秦海燕 范慧艷 李石清 張水利張春椿

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

光照強(qiáng)度對南方紅豆杉紫杉醇含量及相關(guān)酶基因表達(dá)的影響

浙江中醫(yī)藥大學(xué) 杭州 310053

[目的]研究光照強(qiáng)度對南方紅豆杉中紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡?、螅?0-deacetylbaccatin III,10-DABⅢ）含量變化，探討其可能的環(huán)境適應(yīng)機(jī)制。[方法]通過高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）測定不同遮光率（50%、70%和90%）分別遮光30、60、90d后紫杉醇和10-DABⅢ含量；通過PCR法測定相關(guān)酶基因表達(dá)量。[結(jié)果]光照強(qiáng)度能夠影響紫杉醇的積累。遮光0～90d，空白組紫杉醇和10-DABIII含量呈下降趨勢，各遮光組呈先升后降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。其中50%和70%遮光組明顯高于空白組及90%遮光組（P＜0.01）。此外，光照對紫杉二烯 5α-羥基化酶（taxane 5α-hydroxylase,TH5α）、紫杉烷 7β-羥基化酶（taxane 7β-hydroxylase,7β）和紫杉烷 14β-羥基化酶（taxane 14βhydroxylase,14OH）基因表達(dá)也存在明顯影響，70%遮光組TH5α基因表達(dá)量隨遮光時間延長而增加，14OH基因則下降（P＜0.01）。[結(jié)論]本研究初步得到光照因素可以影響南方紅豆杉次生代謝產(chǎn)物的合成及相關(guān)酶基因的表達(dá)，適當(dāng)?shù)恼诠猓?0%遮光）可以提高紫杉醇的含量，且遮光3月內(nèi)紫杉醇含量穩(wěn)定。

南方紅豆杉；遮光；HPLC；PCR法；紫杉醇；10-DABⅢ；基因表達(dá)

南方紅豆杉(Taxus chinensis var.mairei)是中國地方性物種，在長江以南普遍存在[1]。紫杉醇(Paclitaxel,商品名Taxol）作為紅豆杉屬植物的重要次生代謝產(chǎn)物，是當(dāng)前公認(rèn)的高效廣譜抗癌藥物之一[2]。但紫杉醇在紅豆杉中含量極低，且紅豆杉資源有限，急切需要探尋一種促紫杉醇增產(chǎn)、經(jīng)濟(jì)可行的新技術(shù)。近年來研究表明，環(huán)境因子可以影響紅豆杉的生長。關(guān)品高等[3]發(fā)現(xiàn)海拔、光照、溫度等環(huán)境因素對云南紅豆杉紫杉醇含量具有明顯影響。楊逢建等[4-6]認(rèn)為適量光照有利于南方紅豆杉葉片中紫杉醇的合成，但是光照過強(qiáng)反而會降低其含量。苗莉云等[7]運(yùn)用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在紅豆杉細(xì)胞中過表達(dá)Bapt基因可以提高紫杉醇產(chǎn)量。

近年來，利用高效液相色譜法同時測定紫杉醇和10-脫乙酰基巴卡?、螅?0-deacetylbaccatinⅢ,10-DABⅢ）含量的方法已有報道[8-9]，且利用實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測基因表達(dá)的方法已十分成熟[10-13]。本研究采用高效液相法及實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)，測定不同遮光率（50%、70%和90%）分別遮光30、60和90d后紫杉醇和10-DABⅢ含量以及合成過程中紫杉二烯 5α-羥基化酶（taxane 5α-hydroxylase,TH5α）、紫杉烷 7β-羥基化酶（taxane 7β-hydroxylase,7β）和紫杉烷 14β-羥基化酶（taxane 14β-hydroxylase,14OH）基因表達(dá)，以期找到能夠切實(shí)提高紫杉醇含量、降低生產(chǎn)成本的合適方法。

1 材料與方法

1.1 儀器 WatersE2695全自動高效液相色譜儀（Waters 2996 PDA 檢測器），MS105DU半微量分析天平（METTLER TOLEDO），Quawell Q5000微量紫外可見分光光度計、Tanon-4100數(shù)碼凝膠圖像處理系統(tǒng)（天能科技有限公司），PCR儀（BioRad MyCycler-TMThermal Cycler,580BR11767），熒光定量PCR儀（BioRad C1000 TouchTMThermal Cycler,785BR10301）。

1.2 藥材 選取長勢良好、高度相近的5年生南方紅豆杉（杭州富陽皇天塘紅豆杉基地，海拔561米，N29.53，E119.53），每 6株分為 1組，設(shè)置空白（不遮光）組，50%遮光組、70%遮光組和90%遮光組。分別采摘遮光前、遮光30d、遮光60d和遮光90d的中段枝葉，自然陰干備用。

1.3 試劑 多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（TIANGEN BIOTECH,批號：DP441）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScriptTMRT Reagent Kit,批號：RR037A）、引物（上海生工生物工程有限公司合成）、qRT-PCR試劑盒（SYBR Premix Ex TaqTM,批號：RR420A）、紫杉醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：305/18638)、10-脫乙酰巴卡?、髽?biāo)準(zhǔn)品（上海詩丹德生物技術(shù)有限公司，批號：1942/18641)。

1.4 實(shí)驗方法

1.4.1 色譜條件 色譜柱：inertsil ODS-SP（250×4.6mm,5μm）；流動相：甲醇∶水（0～16min，44%～56%；16～20min,44%～62%；20～25min，62%～67%；25～30min，67%～70%；30～35min，70%～62%；35～40min,62%）[14-15]；檢測波長：227nm；流速：1.0mL·min-1；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10μL。每個樣本重復(fù)3次。

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察 將紫杉醇和10-DABⅢ標(biāo)準(zhǔn)品分別配制成濃度為 0.67、0.296、0.25125、0.1675、0.08375、0.041875mg·mL-1和 1.04、0.552、0.39、0.26、0.13、0.0652mg·mL-1。按上述色譜條件進(jìn)樣，以峰面積（Y）對濃度（X）進(jìn)行線性回歸。

1.4.3 試樣制備 各遮光組和空白組共5個批次陰干的南方紅豆杉枝葉，組間內(nèi)的6株樣本混合打粉，稱取5.0g用50mL甲醇浸潤20min，超聲50min離心，重復(fù)兩次；上清液30℃減壓旋干；用45mL甲醇和5mL蒸餾水溶解，用50mL正己烷萃取至上層無色；甲醇相30℃減壓蒸干用50mL二氯甲烷溶解，蒸餾水萃取兩次除雜；二氯甲烷相真空濃縮至干，用5mL色譜純甲醇溶解、定容，0.45μm膜過濾后進(jìn)行HPLC檢測。

1.4.4 加樣回收率試驗 根據(jù)測得的樣品中10-DABⅢ、紫杉醇的含量，在原藥材粉末中分別添加樣品中10-DABⅢ、紫杉醇含量80%、100%和120%的標(biāo)準(zhǔn)品甲醇溶液，平行3份，按照“1.4.3”項下方法制得溶液，測定其含量。

1.4.5 植物總RNA提取及電泳檢測 分別稱取各組各株南方紅豆杉枝葉0.75mg，用液氮研磨成粉末，參照多糖多酚植物總RNA提取試劑盒方法提取植物總RNA，-80℃保存。取5μL樣本RNA，150V電泳檢測8min。

1.4.6 實(shí)時熒光定量PCR（qPT-PCR）檢測基因表達(dá)以RNA為模板按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作得到cDNA，存于-80℃，反應(yīng)條件為 37℃ 15min，85℃ 5s，4℃ 20min。按qRT-PCR試劑盒說明書加樣，引物序列（表 1），反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性 3min，95℃,變性 5s，60℃退火 30s，65℃延伸 5s，39個循環(huán)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理數(shù)據(jù)。計量數(shù)據(jù)用±s表示，各組間比較采用t檢驗，組間比較用 LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 實(shí)驗結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系考察 紫杉醇在40～300μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=18864X-10669，相關(guān)系數(shù)（r）為 0.9997；10-DABⅢ在 60～600 μg·mL-1具有良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=14388X-40545，相關(guān)系數(shù)（r）為 0.9996。

2.2 加樣回收實(shí)驗 計算出10-DABⅢ的平均回收率為98.73%，RSD為1.56%；紫杉醇的平均回收率為96.28%，RSD為1.34%，符合要求。

表1 紫杉烷類生物合成關(guān)鍵酶基因定量PCR引物序列Tab.1 Taxane biosynthesis Key enzyme gene Quantification PCR primers

2.3 含量測定結(jié)果 5年生南方紅豆杉不同遮光干預(yù)后枝葉中紫杉醇和10-DABⅢ含量隨遮光時間變化的結(jié)果（表2）。遮光處理組中紫杉醇和10-DABⅢ含量較同時間內(nèi)空白組均有較大差異，有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。相對于 50%和 90%遮光組而言，70%遮光條件下紫杉醇和10-DABⅢ兩種化學(xué)物質(zhì)的含量一直保持高穩(wěn)定狀態(tài)。遮光90d，70%遮光組與50%和90%遮光組比較，紫杉醇含量分別增加了33.49%和74.44%；遮光90d，70%遮光組與50%和90%遮光組比較，10-DABⅢ含量分別增加了43.38%和86.72%。表2顯示，遮光率相同，空白組紫杉醇和10-DABⅢ含量隨遮光時間增加呈下降趨勢，各遮光組隨遮光時間延長呈先升后降的趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表2 不同遮光處理紫杉醇和10-DABⅢ的含量測定結(jié)果(±s，mg·g-1)Tab.2 The results of the determination of paclitaxel and 10-DABⅢ in different shading treatments(±s，mg·g-1)

表2 不同遮光處理紫杉醇和10-DABⅢ的含量測定結(jié)果(±s，mg·g-1)Tab.2 The results of the determination of paclitaxel and 10-DABⅢ in different shading treatments(±s，mg·g-1)

注：與空白組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。Note:Compared with the control group,*P＜0.05,**P＜0.01.

組別 10-DABⅢ含量遮光0d 遮光30d 遮光60d 遮光90d紫杉醇含量遮光0d 遮光30d 遮光60d 遮光90d空白組50%遮光組70%遮光組90%遮光組0.1136±0.0069 0.1189±0.0051 0.1050±0.0080 0.1316±0.0023*0.1013±0.0007 0.2217±0.0035**0.1852±0.0054**0.1245±0.0088**0.0852±0.0006 0.1147±0.0069**0.1540±0.0071**0.0824±0.0032 0.0753±0.0013 0.0853±0.0007**0.1223±0.0051**0.0655±0.0008**0.1096±0.0061 0.1056±0.0013 0.1157±0.0045 0.0976±0.0026*0.0957±0.0016 0.2108±0.0035**0.1719±0.0054**0.1102±0.0088**0.0855±0.0044 0.1127±0.0031**0.1488±0.0022**0.0748±0.0040*0.0731±0.0021 0.0869±0.0037**0.1160±0.0026**0.0665±0.0041

2.4 熒光定量檢測結(jié)果 光照對紫杉醇相關(guān)酶基因的表達(dá)也存在明顯影響。遮光時間相同，各遮光組TH5α、7β、14OH 3種基因的表達(dá)較空白組均存在差異。由圖1可知，遮光30d，50%遮光組較空白組14OH表達(dá)顯著性下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），70%和90%遮光組顯著性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。遮光 60d，50%遮光組 TH5α 低于空白組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05），70%和90%遮光組TH5α高于空白組，但無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05)，50%和70%遮光組14OH分別低于和高于空白組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05，P＜0.01），70%遮光組 7β 表達(dá)顯著性低于空白組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.01）。遮光 90 d，14OH 和TH5α差異較為顯著，70%遮光組TH5α表達(dá)量高于空白組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.01），50%和 90%遮光組14OH表達(dá)量低于空白組，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05，P＜0.01）。遮光強(qiáng)度相同，不同遮光時間各基因表達(dá)量均有較大差異，其中7β和14OH差異尤其顯著?？瞻捉M7β基因表達(dá)隨遮光時間延長逐漸下降，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05，P＜0.01）。70%遮光組 TH5α基因表達(dá)量隨遮光時間延長而增加，14OH基因則下降，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.05，P＜0.01）。90%遮光組14OH和7β的含量隨遮光時間延長而下降，差異有統(tǒng)計意義（P＜0.01）。

圖1 TH5α、7β和14OH基因表達(dá)量隨時間變化統(tǒng)計圖Fig.1 TH5α,7β and 14OH gene expression changes over time

3 討論

目前，紫杉醇的生物合成途徑基本闡明。紫杉醇及其相關(guān)的帶有C13位側(cè)鏈化合物的生物合成途徑可分為紫杉烷碳環(huán)系統(tǒng)的生物合成、側(cè)鏈的生物合成、紫杉烷系統(tǒng)和側(cè)鏈的酯化反應(yīng)[16]。TH5α是第一個羥基化反應(yīng)中的催化酶，不僅催化核心骨架C5特異性地添加一個羥基，而且還催化C4(5)的雙鍵轉(zhuǎn)移到C4(20)位置上，生成紫杉-4(20),11(12)-二烯-5α醇。由于此反應(yīng)速度很慢，因此TH5α很可能是紫杉醇骨架合成的限速酶[17-18]。而7β催化C7取代氧化反應(yīng)，合成半合成前體巴卡亭Ⅲ[11]。因此，TH5α、紫杉烷 7β-羥基化酶基因是紫杉醇及其半合成前體巴卡亭Ⅲ生物合成調(diào)控的重要靶標(biāo)[10]。而14OH是存在于C-l3氧取代的紫杉烷合成分支途徑中的一種P450單加氧酶，與紫杉醇的含量成負(fù)相關(guān)[12-13]從而調(diào)控紫衫烷類合成。C14氧取代的紫杉烷類物質(zhì)是紫杉醇合成通路中影響紫杉醇含量的一個重要分支，近年來研究證明其關(guān)鍵調(diào)控酶是14OH[19]。

次生代謝物質(zhì)的產(chǎn)生是外界刺激因素、發(fā)育程度及組織分化通過作用于生物合成基因表達(dá)從而進(jìn)行調(diào)控，研究發(fā)現(xiàn)4組遮光條件對關(guān)鍵酶基因的表達(dá)起到一定作用，強(qiáng)光照可使植物體內(nèi)部分酶失活，影響植物代謝，影響關(guān)鍵酶表達(dá)及紫杉烷類物質(zhì)合成，實(shí)驗表明，70%的遮光度可提高TH5α基因表達(dá)量，較為理想。70%遮光組和90%遮光組內(nèi)14OH基因酶隨遮光時間延長而減少?？瞻捉M內(nèi)7β基因酶隨遮光時間延長而減少，有可能強(qiáng)光照抑制7β基因酶表達(dá)。故可建議藥農(nóng)可對南方紅豆杉進(jìn)行適度的遮光。

紅豆杉每年都在3月下旬至4月下旬發(fā)新芽，從第1年4月份到次年3月份形成一個枝葉生長循環(huán)[20]。紅豆杉為喜陰植物，在7～9月光照最強(qiáng)的時間內(nèi)，不利于其次生代謝合成紫杉醇。本研究通過對南方紅豆杉進(jìn)行適當(dāng)遮光處理后發(fā)現(xiàn)，無論是次生代謝產(chǎn)物還是相關(guān)酶基因表達(dá)都有所增加，紫杉醇和10-DABⅢ的含量變化趨勢與TH5α基因表達(dá)一致，而且適當(dāng)?shù)恼诠鈴?qiáng)度可以促進(jìn)紫杉醇的積累。遮光70%，有利于TH5α基因表達(dá)合成紫杉醇重要前體物質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)紫杉醇的積累，且遮光3月內(nèi)紫杉醇含量穩(wěn)定。由此可知，在夏季較高光強(qiáng)度下，可以通過對南方紅豆杉采取遮光處理，增加紫杉醇的生物合成來提高產(chǎn)量，且適當(dāng)?shù)恼诠鈺r間內(nèi)紫杉醇含量保持穩(wěn)定。紫杉醇作為一種次生代謝產(chǎn)物，其合成同時受到遺傳物質(zhì)和外界環(huán)境的影響。結(jié)合本實(shí)驗紫杉烷類物質(zhì)積累的變化，發(fā)現(xiàn)大部分基因酶和相對應(yīng)的紫杉烷類成分變化呈相同趨勢，更加明確表明了關(guān)鍵酶表達(dá)量調(diào)控著紫衫烷類生物合成，為從基因分子機(jī)制提高紫衫烷類成分奠定理論依據(jù)。

綜上所述，外界刺激因素極大的影響了關(guān)鍵酶基因表達(dá)量。但實(shí)驗發(fā)現(xiàn)紫杉烷類生物合成關(guān)鍵酶基因14OH表達(dá)量與紫杉醇和10-DABⅢ的含量相差甚遠(yuǎn)。有可能由于紫杉醇生物合成途徑需多種酶共同協(xié)調(diào)催化，其他的合成酶表達(dá)量直接影響紫衫烷類產(chǎn)量?；蛘哂忠驗槊傅南鄬Ｒ恍?，可催化多種反應(yīng)，不一定全部作用于紫杉烷的生物合成，即使作用于紫杉烷生物合成途徑，又因分支途徑太多而沒有促進(jìn)研究組所測試的紫衫烷類成分。亦可能是由于紫杉烷類的過度積累對紫杉烷合成關(guān)鍵酶的活性起到了反饋抑制作用及紫杉烷類產(chǎn)物的部分降解所導(dǎo)致。至于具體的機(jī)制，則需要進(jìn)一步探究。

References：

[1] 王昌偉,仝川,李文建,等.遮光對南方紅豆杉生長及紫杉醇含量的影響[J].生態(tài)學(xué)雜志,2008,27(8):1269-1273.WANG Changwei,TONG Chuan,LI Wenjian,et al.Effects of shading on Taxus chinensis var.mairei growth and its taxol content[J].Chinese Journal of Ecology,2008,27(8):1269-1273.

[2] Ji Y,Bi JN,Yan B,et al.Taxol-Produeing fungi:a new approach to industrial production of taxol[J].Chinese J Bioteehnol,2006,22(11):l-6.

[3] 關(guān)品高,劉江華.云南紅豆杉生長特性及其人工種植產(chǎn)業(yè)發(fā)展研究[J].林業(yè)調(diào)查規(guī)劃,2010,35(3):58-61.GUAN Pingao,LIU Jianghua.Study on growth characters of Taxusy unnanensis and development of its plantation industry[J].Forest Inventory and Planning,2010,35(3):58-61.

[4] 楊逢建,龐海河,祖元剛,等.南方紅豆杉生長發(fā)育及其紫杉醇含量與環(huán)境因子的關(guān)系[J].植物研究,2010,30(10):742-746.YANG Fengjian,PANG Haihe,ZU Yuangang,et al.Relationships between the growth and taxolcontentof Taxus chinensis var.mairei and environment factors[J].Bulletin of Botanical Research,2010,30(10):742-746.

[5] 周海坤,周云.云南紅豆杉枝葉紫杉醇含量影響因素概述[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,43(1):106-109.ZHOU Haikun,ZHOU Yun.Study on factors affecting taxol content in leaves and twigs of Taxus yunnanensis[J].Journal of Anhui Agri.Sci,2015,43(1):106-109.

[6] 楊逢建,龐海河,張學(xué)科,等.光脅迫對南方紅豆杉葉片中葉綠體色素和紫杉醇含量的影響[J].植物研究,2007,27(5):556-558.YANG Fengjian,PANG Haihe,ZHANG Xueke,et al.Effect of light stress on the content of chloroplast pigment and taxol in the leaves of Taxus chinensis var.mairei[J].Bulietin of Botanical Research,2007,27(5):556-558.

[7] 苗莉云,張鵬,劉博,等.過表達(dá)Bapt基因提高中國紅豆杉細(xì)胞的紫杉醇產(chǎn)量[J].中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報,2013,29(6):549-554.MIAO Liyun,ZHANG Peng,LIU Bo,et al.Overexpression of a C-13 phenylpropanoid side chain-co a acetyltransferase gene promotes taxol yield in Taxus chinensis cells[J].Chinese Journal of Biochemistry and Molecular Biology,2013,29(6):549-554.

[8] 陳立國,劉程惠,何克江,等.HPLC法對5種紅豆杉屬植物中紫杉烷類化合物成分的分析[J].分析試驗室,2007,26(s1):58-61.CHEN Liguo,LIU Chenghui,HE Kejiang,et al.Analysis of Taxane Compounds in Five Taxus Species by HPLC[J].Chinese Journal of Analysis Laboratory,2007,26(51):58-61.

[9] 王文芝.西藏紅豆杉中紫杉醇及相關(guān)紫杉烷含量的高效液相色譜分析[J].色譜,1997,15(3):254-256.WANG Wenzhi.Reversed-phase high performance liquid chromatographic(RP-HPLC)analysis of taxol and related taxanes extracted from Taxus Wallichiana Zucc[J].Chinese Journal of Chromatography,1997，15（3）:254-256.

[10] 駱建新,陳永勤,劉占杰.紫杉醇生物合成相關(guān)酶基因的克隆與表達(dá)[J].中國生物工程雜志,2003,23(6):36-40.LUO Jianxin,CHEN Yongqin,LIU Zhanjie.Cloning and expression of genes responsible for taxol biosynthesis[J].China Biotechnology,2003,23(6):36-40.

[11] 燕麗娜,蘇應(yīng)娟,王艇.南方紅豆杉紫杉烷7β-羥基化酶基因全長序列的克隆和進(jìn)化分析[J].中山大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版),2009,48(5):120-124,130.YAN Lina,SU Yingjuan,WANG Ting.Molecular cloning and evolutionary analysis of the full-length sequence of the Taxus wallichiana var.mairei taxoid 7-beta-hydroxylase gene[J].Acta Scientiarum Naturalium Uiverisitatis Sunyatseni.2009,48(5):120-124,130.

[12] 李鳳嵐,邱德有,馬小軍,等.利用RNAi抑制曼地亞紅豆杉細(xì)胞紫杉烷14β-羥基化酶基因的表達(dá)[J].中國生物工程雜志,2009,29(5):55-60.LI Fenglan,QIU Deyou,MA Xiaojun,et al.Suppressionof taxoid 14b-hyd roxylase g ene expression in Taxus media via RNA interference[J].China Biotechnology,2009,29(5):55-60.

[13] 胡新玲,徐妙云,劉德虎,等.紫杉烷14β-羥基化酶基因片段的克隆及其植物表達(dá)載體的構(gòu)建[J].分子植物育種,2006,4(2):243-250.HU Xinling,XU Miaoyun,LIU Dehu,et al.Cloning a DNA fragment of taxane 14β-hydroxylase gene and construction of its plant expresstion vectors for plant system[J].Molecular Plant Breeding,2006,4(2):243-250.

[14] Tamar S,Joseph M,Rinat M,et al.Combined weekly carboplatin and paclitaxel as primary treatment of advanced epithelial ovarian carcinoma[J].Gynecologic Oncology,2009,114(2):215-218.

[15] Shi QW,Kiyota H.New natural taxane diterpenoids from Taxus species since 1999[J].Chemistry&Biodiversity,2005,2(12):1597-1623.

[16] JENNEWEIN S,LONG R,WILLIAMS R M,et al.Cytochrome P450 taxadien 5α-hydroxylase,a mechanistically unusual monooxygenase catalyzing the first oxygenation step of Taxol biosynthesis[J].Chem.Biol.,2004,11(3):379-387.

[17] 翟芳,宋田青,肖文海,等.產(chǎn)5α羥化紫杉二烯醇人工酵母的組合設(shè)計構(gòu)建[J].化工學(xué)報,2016,67(1):315-323.ZHAI Fang,SONG Tianqing,XIAO Wenhai,et al.Combinatorial design and construction of artificial yeast for production of taxadien-5α-ol[J].CIESC Journal,2016,67(1):315-323.

[18] 金晶,王微,邵妤,等.利用Bio-BglBrick方法表達(dá)紫杉醇生物合成酶[J].生物技術(shù)通訊,2014,25(5):616-620.JIN Jing,WANG Wei,SHAO Yu,et al.Expression of taxol biosynthetic enzymes via bio-bglbrick method[J].Letters in Biotechnology,2014,25(5):616-620.

[19] 高明波,張衛(wèi),李興泰,等.聯(lián)合調(diào)控對中國紅豆杉細(xì)胞關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響[J].中國生物工程雜志,2010,30(8):31-36.GAO Mingbo,ZHANG Wei,LI Xingtai,et al.Expression Profiling of Genes Involved in Taxuyunnanine C Biosynthesis in Cell Suspension Cultures of Taxus chinensis by Repeated Elicitation with a Newly Synthesized Jasmonate,in situ Absorption and Sucrose Feeding[J].China Biotechnology,2010,30(8):31-36.

[20] 黃璽,李遠(yuǎn).不同采集時間曼地亞紅豆杉中紫杉醇含量分析[J].現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生,2013,29(12):1806-1808.HUANG Xi,LIYuan.Analysison taxolcontentsof Taxus media Hicksii in different harvest time[J].J Mod Med Health,2013,29(12):1806-1808.

Effects of Light Intensity on Taxol Content and Expression of Related Enzymes in Taxus Chinensis var.Mairei

QIN Haiyan,FAN Huiyan,LI Shiqing,et al Zhejiang Chinese Medical University,Hangzhou(310053),China

[Objective]The changes of paclitaxel and 10-deacetylbaccatin III(10-DABIII)in Taxus chinensis var.Mairei were studied,and the possible environmental adaptation mechanism was discussed.[Methods]The contents of paclitaxel and 10-DABIII were measured by high performance liquid chromatography(HPLC)at different shading rates(50%,70%and 90%)for 30,60 and 90d respectively.The expression of related enzyme gene was determined by quantitative real-time PCR.[Result]Light intensity can affect the accumulation of paclitaxel.The content of paclitaxel and 10-DABIII in the blank group decreased at 0 to 90d,and the shading group increased firstly and then decreased,but there was difference(P＞0.05).50%and 70%of the shading group were significantly higher than the blank group and 90%shading group(P＜0.01).In addition,the expression of 5α-hydroxylase(TH5α),taxane 7β-hydroxylase(7β)and taxane 14β-hydroxylase(14OH)gene were also significantly affected by irradiation.Compared with the blank group,the expression of 7β and 14OH genes was negatively correlated with shading time at 70%shading,while the trend of 50%and 90%shading was not obvious and it was presumed that 7β and 14OH gene in the taxane synthesis process for the competitive relationship.[Conclusion]In this study，the preliminary results showed that light factors could affect the synthesis of secondary metabolites and the expression of related enzyme genes.Appropriate shading(70%shading)could increase the content of paclitaxel and paclitaxel content was stable shading in 3 months.

Taxus chinensis var.mairei；shading；HPLC;PCR method;paclitaxel；10-DAB III；gene expression

R282.71

A

1005-5509（2017）07-0556-06

10.16466/j.issn1005-5509.2017.07.002

2017-02-27）

國家中醫(yī)藥行業(yè)專項項目(201407002)；浙江省自然科學(xué)基金（LQ12H28003）；浙江中醫(yī)藥大學(xué)科研基人才專項項目（2014ZR09）

Fund projects:National scientific research project of national traditional Chinese medicine(201407002)；Zhejiang Provincial Natural Science Foundation(LQ12H28003)；Special scientific research project of Zhejiang Chinese Medical University（2014ZR09）

張春椿，E-mail：zhangchun200123@163.com