何保明 李素萍 喻良

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烏司他丁對氯化鋰-匹羅卡品誘發(fā)癲癇大鼠腦保護(hù)作用及其機(jī)制研究

何保明 李素萍 喻良

目的 研究烏司他丁對癲癇發(fā)作時大腦的保護(hù)作用及其機(jī)制。方法 通過對Wistar大鼠建立癲癇模型，建模成功后并對其進(jìn)行4種分組處理，即A組注射生理鹽水；B組注射卡馬西平；C組注射卡馬西平和少量烏司他丁(10 000 U/kg)；D組注射卡馬西平和大量烏司他丁(70 000 U/kg)；測量每組達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)后24、48、72、96 h不同時間段的S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)水及96 h后腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與IL-1β水平；通過免疫組化檢測caspase-3、bax與bcl-2陽性細(xì)胞數(shù)；觀察神經(jīng)元凋亡情況；用水迷宮檢測大鼠的認(rèn)知功能，通過模型組與空白對照組和模型組間對比分析烏司他丁對癲癇大鼠的影響；空白對照組全程注射等量生理鹽水。結(jié)果 注射烏司他丁能夠降低S100β和NSE水平，并且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；烏司他丁對TNF-α與IL-1β表達(dá)進(jìn)行抑制，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁后caspase-3與bax的陽性細(xì)胞減少而bcl-2的陽性細(xì)胞增加，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁能夠減少海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)；注射烏司他丁能夠改善癲癇大鼠的認(rèn)知功能，且大劑量烏司他丁效果更顯著(P<0.05)。結(jié)論 烏司他丁可能是通過抑制炎癥因子的表達(dá)和caspase-3與bax的激活，促進(jìn)bcl-2蛋白激活，并減少神經(jīng)元凋亡來對癲癇大鼠的大腦進(jìn)行保護(hù)。

烏司他丁 癲癇 氯化鋰-匹羅卡品

顳葉癲癇(Temporal Lobe Epilepsy,TLE)系中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其是難治性癲癇中最常見的類型，TLE常常自發(fā)性發(fā)作和反復(fù)發(fā)作，其病因和發(fā)病機(jī)制目前尚不明確[1]。癲癇的發(fā)生與神經(jīng)元的凋亡、神經(jīng)元興奮性增加及突觸的異常等相關(guān)[2]，大量研究表明免疫應(yīng)答也參與了癲癇的發(fā)病機(jī)制[3]。烏司他丁是一種來源于人尿液的糖蛋白水解酶抑制劑，研究發(fā)現(xiàn)其對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，并且具有一定的抗炎效果[4]。本研究通過在癲癇大鼠模型注射烏司他丁，以了解烏司他丁對癲癇模型鼠腦的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 建模及實(shí)驗(yàn)分組

通過對健康成年Wistar大鼠(250～300 g)腹腔注射氯化鋰(3 mg/kg)及20 h后皮下注射匹羅卡品(30 mg/kg)進(jìn)行建模，并隨機(jī)分組(A、B、C、D組)，每組各10只，對空白對照組(10只)只進(jìn)行生理鹽水注射，模型組中共對53只進(jìn)行建模處理，其中8只沒有達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)、5只死亡；共4組模型組和1組空白對照組；密切觀察模型組大鼠狀態(tài)并進(jìn)行Simialowski 6級評分，達(dá)到IV或V級為本次研究驚厥的標(biāo)準(zhǔn)，不達(dá)評分等級的大鼠則另用其大鼠實(shí)驗(yàn)，以保證每組10只大鼠達(dá)標(biāo)，達(dá)標(biāo)后對大鼠進(jìn)行如下處理。A組不進(jìn)行任何治療，也不注射烏司他??；B組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，但不注射烏司他??；C組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，并注射少量烏司他丁(10 000 U/kg)；D組在發(fā)生驚厥后注射卡馬西平進(jìn)行止驚治療，并注射大量烏司他丁(70 000 U/kg)。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)水平檢測 各組大鼠在達(dá)到驚厥標(biāo)準(zhǔn)后24、48、72、96 h分別收集鼠尾靜脈血，使用S100β蛋白和神經(jīng)烯醇化酶(NSE)試劑盒檢測其水平，操作步驟嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

1.2.2 TNF-α與IL-1β水平檢測 96 h后用雙抗夾心ELISA法檢測每組大鼠腦中TNF-α與IL-1β水平，并觀察注射烏司他丁后其水平的變化情況。

1.2.3 caspase-3、bax、bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù) 上述處理完后斷頭處死，對大鼠海馬進(jìn)行切片，每只大鼠取一個切片并進(jìn)行caspase-3、bax、bcl-2免疫組化檢測，于400倍光鏡下隨機(jī)計數(shù)陽性細(xì)胞，多少個？視野讀取求平均值。陽性細(xì)胞是指aspase-3胞核呈棕黃色，bax與bcl-2胞漿呈棕黃色。

1.2.4 TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù) 斷頭處死后對海馬CA3區(qū)切片并TUNEL染色，陽性細(xì)胞是指細(xì)胞核呈棕黃色顆粒者，在400倍光鏡下計算10個視野的TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)并其求均值。

1.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

對建模后4個模型組進(jìn)行水迷宮訓(xùn)練，水迷宮設(shè)備是一個直徑為150 cm，深度為60 cm的水池，分為4個象限并在某一象限固定放置一個直徑12 cm的平臺；實(shí)驗(yàn)前將大鼠置于站臺上適應(yīng)10 s，隨后將大鼠隨機(jī)從不同象限面壁置入池內(nèi)，大鼠登上站臺5 s后終止記錄，最長記錄時間為120 s，若大鼠在120 s內(nèi)不能上臺，引導(dǎo)其登上站臺適應(yīng)10 s，最后將大鼠擦干放入鼠籠；如此將大鼠置入游泳池，4次/d，每次間隔1 h，定位航行訓(xùn)練需要4 d；第5 d撤下平臺測量平臺逃避潛伏期，來評價大鼠的空間記憶能力。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 各組腦電圖異常及發(fā)作次數(shù)比較 C、D組的發(fā)作次數(shù)與A、B組比較無明顯差異(P>0.05)，但腦電圖異常情況明顯改善(表1，圖1)。

表1 各組各時間段的發(fā)作次數(shù)和腦電圖異常情況,n=10)

注：與A組比較，*P<0.05

圖1 96h后4組腦電圖表現(xiàn)

2.2 各組S100β蛋白和NSE水平比較 對5組在驚厥發(fā)作后不同時間段S100β蛋白、NSE水平和每小時發(fā)作次數(shù)進(jìn)行檢測，隨著時間的持續(xù)發(fā)現(xiàn)兩者水平都在上升，且模型組S100β和NSE水平較空白對照組高(P<0.05)；烏司他丁能夠降低S100β和NSE水平，且烏司他丁劑量越大效果越顯著(P<0.05)(表2)。

2.3 各組TNF-α與IL-1β水平比較 建模96 h后模型組TNF-α與IL-1β水平明顯高于空白對照組，模型組中C、D組明顯低于A、B組(P<0.05)，其中B組低于A組，但無明顯差異(P>0.05)，而D組明顯低于C組(P<0.05)(表3)。

2.4 各組caspase-3、bax、bcl-2陽性細(xì)胞計數(shù) 模型組中C、D組的caspase-3和bax陽性細(xì)胞數(shù)明顯低于A、B組，而bcl-2陽性細(xì)胞明顯高于A、B組(P<0.05)，其中A、B組無明顯差異(P>0.05)，但C、D組有明星差異(P<0.05)(表4)。

表1 驚厥發(fā)作后不同時間段S100β蛋白、NSE水平,n=10，ng/L)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05

表3 建模96 h后各組TNF-α與IL-1β水平,n=10，ng/g)

注：與空白對照組比較，*P<0.05；與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

表4 各組caspase-3、bax與bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù),n=10，個/每400倍視野)

注：與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

2.5 各組TUNEL陽性細(xì)胞計數(shù) 模型組海馬CA3區(qū)凋亡細(xì)胞數(shù)明顯較高，模型組中C、D組明顯低于A、B組(P<0.05)；C、D組也有明顯差異(P<0.05)，但A、B組無明顯差異(P>0.05)(表5)。

表5 各組海馬CA3區(qū)神經(jīng)元的凋亡情況,n=10，個/每400倍視野)

注：與A組、B組比較，△P<0.05；與C組比較，▲P<0.05

2.6 水迷宮檢測大鼠的學(xué)習(xí)和記憶能力 模型組大鼠認(rèn)知功能明顯降低，模型組中C、D組認(rèn)知功能于A、B組明顯改善(P<0.05)；C、D組之間無明顯差異(P>0.05)，A、B組之間也無明顯差異(P>0.05)(表6)。

3 討 論

癲癇是中樞神經(jīng)系統(tǒng)第二常見的疾病，全世界發(fā)病率為5%～8%，其特征性表現(xiàn)之一是自發(fā)性痙攣發(fā)作，主要是因?yàn)樯窠?jīng)元的興奮性增加或腦電波同步性增強(qiáng)所致[5]。本研究通過對模型組的發(fā)作次數(shù)和腦電圖異常情況分析發(fā)現(xiàn)烏司他丁對癲癇大鼠的大腦具有一定的保護(hù)作用。

S100β蛋白和NSE常用于檢測是否存在腦損傷與腦功能失調(diào)。本研究發(fā)現(xiàn)驚厥發(fā)作后不同時間段S100β蛋白和NSE的水平迅速增加，通過不同藥物方案處理后對照發(fā)現(xiàn)，注射烏司他丁后S100β蛋白和NSE的水平低于未使用烏司他丁，并且其差異性具有統(tǒng)計學(xué)意義。因此，對模型大鼠經(jīng)止痙治療同時給予烏司他丁處理，對癲癇模型大鼠的腦功能具有一定的保護(hù)作用。

表6 各組大鼠認(rèn)知功能的情況,n=10)

注：與A組、B組比較，△P<0.05

本研究發(fā)現(xiàn)注射烏司他丁后TNF-α與IL-1β表達(dá)減少，烏司他丁劑量越大其效果越明顯。TNF-α與IL-1β是重要的炎癥細(xì)胞因子，在癲癇發(fā)作時對大腦的損害具有重要的作用，炎癥反應(yīng)不僅僅在持續(xù)性癲癇狀態(tài)中存在，在慢性癲癇患者中一樣存在并一直潛伏著，直到自發(fā)性癲癇發(fā)作的時候起作用[6-8]。越來越多的證據(jù)表明，長時間的炎性反應(yīng)表現(xiàn)不僅僅是病理組織所附帶存在的，相反它極大程度地降低了易受影響的大腦區(qū)域中驚厥發(fā)生的閾值，炎性細(xì)胞因子在產(chǎn)生驚厥及自發(fā)性復(fù)發(fā)中具有重要的作用[9-12]。實(shí)驗(yàn)證明，TNF-α水平升高會導(dǎo)致相應(yīng)組織發(fā)生炎癥反應(yīng)，當(dāng)注射烏司他丁后對腦具有保護(hù)作用[13]。IL-1主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，即在所有腦區(qū)都有表達(dá)，在海馬和皮層神經(jīng)元的表達(dá)水平最高，并且對突觸神經(jīng)遞質(zhì)的釋放具有重要的作用[14]。Yang等[15]通過免疫熒光和免疫組化等方法對IL-1在難治性癲癇中的表達(dá)進(jìn)行評估，發(fā)現(xiàn)IL-1主要在神經(jīng)元表達(dá)，在癲癇模型中參與影響神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。最近一項(xiàng)對腦缺血再灌注損傷的模型研究中發(fā)現(xiàn)，烏司他丁能夠明顯降低TNF-α與IL-1β表達(dá)，能夠降低大腦的炎癥反應(yīng)[16]。

本研究發(fā)現(xiàn)注射烏司他丁后caspase-3與bax的陽性細(xì)胞數(shù)減少而bcl-2的陽性細(xì)胞數(shù)增加，烏司他丁的劑量越高陽性細(xì)胞的變化越明顯。眾所周知，驚厥和癲癇持續(xù)狀態(tài)會激活內(nèi)在和外在的凋亡通路，進(jìn)而導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡，caspase-3與bax的激活進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)元形成不可逆死亡。caspase-3蛋白酶在細(xì)胞凋亡過程中直接導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，Amorim等[8]發(fā)現(xiàn)海馬在癲癇持續(xù)發(fā)作時活性較高，并通過對癲癇模型在持續(xù)發(fā)作時進(jìn)行深部腦刺激發(fā)現(xiàn)海馬區(qū)caspase-3的活性明顯減低，能夠減輕大鼠大腦的傷害。據(jù)報道，烏司他丁也可抑制caspase-3蛋白與bax蛋白的表達(dá)，并對bcl-2蛋白的表達(dá)進(jìn)行上調(diào)[17]。

本研究通過對模型癲癇大鼠的海馬CA3區(qū)進(jìn)行切片發(fā)現(xiàn)，注射烏司他丁后神經(jīng)元凋亡數(shù)低于未注射烏司他丁，并且烏司他丁的劑量越高其神經(jīng)元凋亡率越低。據(jù)報道，通過建立癲癇大鼠模型發(fā)現(xiàn)，烏司他丁抑制caspase-3與bax的激活，從而減少腦細(xì)胞凋亡，對大腦產(chǎn)生保護(hù)作用，最終在整體水平上改善大鼠的認(rèn)知功能[18]，本研究與此觀點(diǎn)一致。

綜上所述，烏司他丁對癲癇模型大鼠腦部具有明確的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過對炎性因子的表達(dá)和caspase-3、bax的激活進(jìn)行抑制及加速對bcl-2進(jìn)行激活，并減少神經(jīng)元細(xì)胞的凋亡來對癲癇大鼠的大腦進(jìn)行保護(hù)。

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(2016-07-18收稿)

Protective effect and mechanism of ulinastatin on brain in rats with epilepsy induced by LICI-pilocarpin

HeBaoming，LiSuping，YuLiang.

Departmentofinternalmedicine,SichuanProvincialPeople'sHospital,SichuanAcademyofMedicalSciences,Chengdu610072

Objective To study the protective effect and mechanism of ulinastatin on brain in rats during seizures.Methods Wistar rats were divided into 5 groups:control group with saline,A group with saline, B group with carbamazepine,C group with carbamazepine and little amount of ulinastatin(10 000 U/kg)and D group with carbamazepine and large amount of ulinastatin(70 000 U/kg).After seizures 24 h,48 h,72 h and 96 h,the level of S100β and NSE were detected.After 96 h,the level of TNF-α and IL-1β,the expression of caspase-3,bax and bcl-2,and the apoptosis of neuron in the CA3 area of hippocampus were detected.Water maze was used to assay cognitive function.Results The injection of ulinastatin reduced the contents of S100β,NSE,caspase-3,bax,the expression of TNF-α and IL-1β,and the apoptosis of neuron,increased the content of bcl-2,and ameliorated the cognitive function of rats with epilepsy.The effect was more significant when rats were treated with higher dose of ulinastatin(P<0.05).Conclusion The protective effect of ulinastatin on brain may be through inhibiting the expression of inflammatory cytokines,the activation of caspase-3 and bax,and the apoptosis of neuron,and improving the activation of bcl-2.

Ulinastatin Epilepsy LICI-pilocarpine

610072 成都，四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科

R742.1

A

1007-0478(2017)01-0013-05

10.3969/j.issn.1007-0478.2017.01.003