蔡嚇明 魏建銘

福建莆田學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，福建 莆田 351100

在我國(guó)約有80%的60歲以上的老年人群患有骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)，女性患病人數(shù)是男性的6倍，有40%～50%的50歲以上婦女可能發(fā)生絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松性骨折[1]。除了增齡、缺鈣和女性絕經(jīng)等已知的OP危險(xiǎn)因素外，血糖升高與OP 密切相關(guān)[2]。有研究發(fā)現(xiàn)糖尿病會(huì)讓女性的絕經(jīng)期提前，并增加了她們罹患骨骼疾病的風(fēng)險(xiǎn)。而骨強(qiáng)度下降是OP 的根本特點(diǎn)[3]，骨強(qiáng)度取決于骨密度(bone mineral density，BMD)和骨質(zhì)量，BMD測(cè)定是世界上公認(rèn)的骨質(zhì)疏松癥的診斷金標(biāo)準(zhǔn)，本文通過(guò)建立絕經(jīng)期糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠模型，旨在探討糖尿病合并去勢(shì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)退化、OP發(fā)生情況及其影響因素。

1 材料和方法

1.1 模型的建立

選用清潔級(jí)3月齡SD雌性大鼠40只，體重200～220 g，由福州吳氏動(dòng)物中心提供。去勢(shì)組切除大鼠雙側(cè)卵巢，假手術(shù)組手術(shù)過(guò)程不切除卵巢而切除小塊脂肪組織。STZ(美國(guó)SANLAN公司提供)誘發(fā)糖尿病。STZ用0.1 mol/L枸櫞酸緩沖液配成1%(g/mL)濃度，按60 mg/kg左下腹腔內(nèi)注射。72 h后取尾血用One Touch血糖測(cè)定儀測(cè)血糖，凡血糖≥167 mmol/L即為糖尿病。糖尿病合并去勢(shì)組用去卵巢與鏈脲佐菌素復(fù)合造模。隨機(jī)分為對(duì)照組、假手術(shù)組、去勢(shì)組、糖尿病組和糖尿病合并去勢(shì)組，6 w和15 w后測(cè)定。

1.2 骨標(biāo)志物檢測(cè)

10%水合氯醛麻醉后，腹主動(dòng)脈采血，-80℃冰箱保存。采用羅氏COBASE601全自動(dòng)電化學(xué)發(fā)光免疫分析儀檢測(cè)骨標(biāo)志物(β-膠原降解產(chǎn)物)，嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.3 骨密度值檢測(cè)

采用Lunar iDNA型雙能X線骨密度儀(美國(guó)通用)檢測(cè)，測(cè)量第4腰椎骨密度和股骨近端，由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的放射科醫(yī)生進(jìn)行共同確診，用自帶的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 骨組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)比較

麻醉取股骨，入4%多聚甲醛固定，逐級(jí)脫水脫脂后，再以10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣，制成蠟塊，連續(xù)切片(厚度4 μm)。蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡(日本Olympus BX51T-PHD-J11)觀察骨細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)分布。隨機(jī)選取，高倍鏡視野下觀察骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁間距(Tb.SP)，同樣要求在不同的視野各測(cè)定一次，取平均值。

1.5 Van Gieson氏膠原纖維染色

切片以Van Gieson氏進(jìn)行膠原纖維染色，光鏡下觀察骨膜膠原纖維沉積情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，Pearson相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 骨標(biāo)志物水平比較

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。去勢(shì)6 w和15 w組骨β-膠原降解產(chǎn)物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病15 w松質(zhì)骨β-膠原降解產(chǎn)物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病合并去勢(shì)組6 w和 15 w組松質(zhì)骨β-膠原降解產(chǎn)物水平明顯升高，骨密度值明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1、2)。

圖1 各組β-膠原降解產(chǎn)物水平比較(P<0.01)Fig.1 Comparison of the levels of beta collagen degradation products among each group(P<0.01)

圖2 各組骨密度值比較(P<0.01)Fig.2 Comparison of bone mineral density among each group (P<0.01)

2.2 各組骨組織形態(tài)學(xué)比較

圖3 各組股骨骨松質(zhì)光鏡下的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(HE法，標(biāo)尺示20 μm)。A：6 w組各組股骨骨松質(zhì)光鏡下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(A1：對(duì)照組，A2：假手術(shù)組，A3：去勢(shì)組，A4：糖尿病組，A5：糖尿病合并去勢(shì)組)；B：15 w組各組股骨骨松質(zhì)光鏡下結(jié)構(gòu)特點(diǎn)(B1：對(duì)照組，B2：假手術(shù)組，B3：去勢(shì)組，B4：糖尿病組，B5：糖尿病合并去勢(shì)組)Fig.3 The structural characteristics of the cancellous bone in femurs under light microscope (HE method, ruler 20 μm). A: in 6 w groups (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: in 15 w groups (B1: control group, B2: the sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

對(duì)照組股骨的骨小梁粗大(圖3A1)。假手術(shù)6 w組骨小梁粗大稍厚，未見(jiàn)吸收或斷裂現(xiàn)象(圖3A2)。去勢(shì)6 w組骨小梁變細(xì)變薄，骨髓腔變大(圖3A3)。糖尿病6 w組骨小梁尚未見(jiàn)大片成塊狀缺失(圖3A4)。糖尿病合并去勢(shì)6 w組(圖3A5)。對(duì)照組15 w組股骨的骨小梁依然粗大厚實(shí)(圖3B1)。假手術(shù)15 w組股骨的骨小梁較多較厚，未見(jiàn)骨小梁斷裂(圖3B2)。去勢(shì)15 w組骨小梁排列稀疏變薄，不規(guī)則彎曲、間距增大，結(jié)構(gòu)紊亂(圖3B3)。糖尿病15 w組骨小梁排列稀疏、出現(xiàn)編織狀纖維骨組織，部分骨小梁斷裂(圖3B4)。糖尿病合并去勢(shì)15 w組骨小梁稀疏變薄斷裂。出現(xiàn)編織狀纖維骨組織，骨髓腔普遍增大，腔內(nèi)造血組織明顯減少(圖3B5)。

2.3 組織計(jì)量學(xué)指標(biāo)測(cè)定統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。去勢(shì)6 w和15 w組骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病15 w骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。糖尿病合并去勢(shì)組6 w和15 w組松質(zhì)骨骨小梁間距明顯升高，骨小梁厚度明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖4、5)。

圖4 各組骨小梁厚度比較(P<0.01)Fig.4 Comparison of trabecular thickness among each group(P<0.01)

2.4 骨膜膠原代謝的改變

Van Gieson氏染色結(jié)果，對(duì)照6 w組骨基質(zhì)膠原纖維積聚有序(圖6A1)。假手術(shù)6 w組骨基質(zhì)膠原纖維積聚、緊密排列，方向有序(圖6A2)。去勢(shì)6 w組骨基質(zhì)膠原纖維染色較深(圖6A3)。糖尿病6 w組骨基質(zhì)膠原纖維較多，但松散(圖6A4)。糖尿病合并去勢(shì)6 w組骨基質(zhì)膠原纖維染色淺，排列稀疏(圖6A5)。對(duì)照15 w組膠原纖維緊密排列(圖6B1)。假手術(shù)15 w組骨基質(zhì)膠原纖維染色深，緊致有序(圖6B2)。去勢(shì)15 w組骨基質(zhì)膠原纖維松散無(wú)序分布(圖6B3)。糖尿病15 w組骨基質(zhì)膠原纖維染色淺，排列稀疏(圖6B4)。糖尿病合并去勢(shì)15 w組膠原纖維稀疏，明顯減少(圖6B5)。

圖6 各組股骨骨松質(zhì)膠原纖維分布特點(diǎn)(Van Gieson法，標(biāo)尺示20 μm)。A：6 w組各組股骨骨松質(zhì)膠原纖維分布特點(diǎn)(A1：對(duì)照組，A2：假手術(shù)組，A3：去勢(shì)組，A4：糖尿病組，A5：糖尿病合并去勢(shì)組)；B：15 w組各組股骨骨松質(zhì)膠原纖維分布特點(diǎn)(B1：對(duì)照組，B2：假手術(shù)組，B3：去勢(shì)組，B4：糖尿病組，B5：糖尿病合并去勢(shì)組)Fig.6 Femoral bone collagen fiber distribution characteristics of loose matter (Van Gieson method, ruler 20 μm). A: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 6 w (A1: control group, A2: sham operation group, A3: ovariectomized group, A4: diabetes group, A5: diabetes mellitus and castration group); B: distribution characteristics of collagen fiber in the femoral bone in 15 w (B1: control group, B2: sham operation group, B3: ovariectomized group, B4: diabetes group, B5: diabetes mellitus and castration group).

圖5 各組骨小梁間距比較(P<0.01)Fig.5 Comparison of trabecular separation among each group(P<0.01)

2.5 骨膜膠原面密度積分統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果

與對(duì)照組相比，假手術(shù)組沒(méi)有出現(xiàn)明顯改變。去勢(shì)15 w組、糖尿病15 w組、糖尿病合并去勢(shì)組6 w和15 w組膠原面密度積分明顯明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖7)。

圖7 各組膠原纖維含量比較(P<0.01)Fig.7 Comparison of levels of collagen fibers among each group(P<0.01)

3 討論

本研究采用復(fù)合造模法，建立絕經(jīng)期糖尿病骨質(zhì)疏松癥大鼠模型[4]。雌激素受體是成骨細(xì)胞主要受體，通過(guò)與雌激素的結(jié)合可以增加成骨細(xì)胞的活性，促進(jìn)新生骨的形成。絕經(jīng)期后內(nèi)源性雌激素分泌下降[5]，對(duì)成骨細(xì)胞的作用減低，會(huì)加速人體內(nèi)骨質(zhì)的丟失，與OP有著密切聯(lián)系[6-7]。在正常骨代謝中，骨骼重建是在破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞作用下有序進(jìn)行的。本文研究結(jié)果提示，絕經(jīng)后OP婦女存在明顯的骨代謝異常。Ⅰ型膠原蛋白與骨結(jié)合蛋白是骨骼組成的主要成分，而Ⅰ型膠原占骨膠原的97%以上，提供礦化的骨架。β-膠原降解產(chǎn)物是Ⅰ型膠原蛋白的降解產(chǎn)物，通過(guò)檢測(cè)β-膠原降解產(chǎn)物可了解到患者破骨細(xì)胞活性。由于OP患者骨吸收增強(qiáng)，使得β-膠原降解產(chǎn)物釋放更多。從而間接了解骨轉(zhuǎn)換程度，絕經(jīng)后OP婦女體內(nèi)破骨細(xì)胞的活性增強(qiáng)，且骨吸收速度遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了骨形成速度。臨床診斷OP的金標(biāo)準(zhǔn)為骨密度值。雌激素和骨標(biāo)志物與絕經(jīng)后婦女OP的關(guān)系密切[7]。另一方面，內(nèi)源性雌激素的減少對(duì)下丘腦-垂體的負(fù)反饋調(diào)節(jié)能力下降，垂體分泌的卵泡刺激素大量增加，導(dǎo)致破骨細(xì)胞數(shù)量和活性增強(qiáng)，骨質(zhì)流失進(jìn)一步加快[8]。

另外，高血糖的毒性逐漸造成各種代謝紊亂，引起晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycationend products，AGEs)的蓄積，直接影響成骨細(xì)胞的增殖，在一定程度上影響了骨膠原蛋白的形成，Ⅰ型膠原合成減少[9]。糖尿病患者由于胰島素分泌相對(duì)或絕對(duì)不足，抑制了成骨細(xì)胞的活性，骨形成降低。絕經(jīng)后糖尿病患者出現(xiàn)骨代謝的影響因素較多，如雌激素、血清抗酒石酸酸性磷酸酶等[10]。高血糖致滲透性利尿，促使鈣、磷排出增加，血鈣濃度降低，刺激甲狀旁腺激素分泌，溶骨作用增強(qiáng)，骨吸收增加，骨礦化減少而致骨密度下降[11]。長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)導(dǎo)致糖尿病患者體內(nèi)HbA1c蓄積，直接或間接影響骨蛋白及骨細(xì)胞分化，骨形成減少，骨脆性增加[12]。糖尿病導(dǎo)致微血管病變會(huì)降低骨血流量，骨脆性增加、骨量流失[13]。高糖環(huán)境的毒性作用，特別是對(duì)成骨細(xì)胞合成能力的抑制并促進(jìn)骨吸收[14]。

大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察發(fā)現(xiàn)雌性動(dòng)物的糖尿病發(fā)病率遠(yuǎn)不及雄性，而去勢(shì)后雌性動(dòng)物糖尿病發(fā)病率升高。雌激素調(diào)節(jié)胰島素受體的基因表達(dá)，雌激素還能通過(guò)雌激素受體ERa起到一定的抗P細(xì)胞調(diào)亡作用，從而保護(hù)胰島功能[15]。研究結(jié)果證實(shí)雌激素與糖代謝并不是兩個(gè)獨(dú)立的個(gè)體，糖尿病的發(fā)生發(fā)展與更年期女性內(nèi)源性雌激素水平的變化具有相關(guān)性。研究提示絕經(jīng)和血糖量均與骨質(zhì)疏松的形成發(fā)展密切相關(guān)[16]，其中時(shí)間、病程及交互有待進(jìn)一步研究，為臨床預(yù)防和治療提供合理的指導(dǎo)。