王昌 湯旭磊 陳克明 張莉 劉偉寧 趙瑾

1.西安交通大學醫(yī)學院附屬廣仁醫(yī)院/西安市第四醫(yī)院，陜西 西安 710004 2.蘭州大學第一醫(yī)院內(nèi)分泌科，甘肅 蘭州 730000 3.蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所，甘肅 蘭州 730050 4.西安市灞橋區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710038

隨著人口老齡化日趨明顯和人們對生活質(zhì)量要求的提高，骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥已成為全世界關(guān)注的一大社會保健和公共衛(wèi)生問題，號稱“世紀慢性隱形疾病”，受到各國醫(yī)學界和國際社會的普遍重視[1]。尤其是婦女絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病率高，危害性大，雌激素缺乏是其主要病因，但由此產(chǎn)生的氧化應(yīng)激是參與其發(fā)病過程的一個重要環(huán)節(jié)[2-3]。雌激素替代療法因出現(xiàn)諸多嚴重副作用而使其應(yīng)用受限。因此，尋找更有效的治療措施具有重要意義。有研究報道，葛根素(puerarin，Pue)作為一種植物雌激素具有減少骨吸收，促進骨形成，增加骨密度的作用，而在刺激子宮組織增生不良反應(yīng)方面又遠較雌激素為輕[4]，還可能清除自由基和發(fā)揮抗氧化作用[5]。筆者在之前的實驗研究中發(fā)現(xiàn)葛根素對成骨細胞(osteoblast，OB)增殖、分化、礦化作用的影響存在劑量依賴性，并且具有雙向性[6]。本實驗旨在觀察Pue在體外對OB的影響及對過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)OB氧化損傷的保護作用，為其防治骨質(zhì)疏松癥提供一定的實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物與主要試劑

出生24 h以內(nèi)的新生Wistar大鼠，SPF級，購自蘭州大學醫(yī)學院GLP實驗室；Pue購于中國藥品生物制品檢定所；MEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶購自Gibco公司；胎牛血清購自中美合資蘭州民海生物工程有限公司；堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)、mMDA、SOD、T-AOC測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所；CO2細胞培養(yǎng)箱(Thermo Revco公司，美國)；倒置相差顯微鏡(OLYMPUS，日本)；細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿購自美國Corning Costar公司。

1.2 細胞的分離與培養(yǎng)

采用0.25%胰蛋白酶和0.1%的Ⅱ型膠原酶多次消化法，由出生24 h以內(nèi)的新生Wistar大鼠頭蓋骨分離成骨細胞，使用含10%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液37 ℃，5%CO2培養(yǎng)，根據(jù)細胞形態(tài)、ALP和1型膠原染色、茜素紅S(Alizarin Red S，ARS)法和Von kossa改良法進行礦化結(jié)節(jié)染色等[7-8]方法對分離得到的成骨細胞加以鑒定。細胞在80%～90%匯合時換用含分化(礦化)誘導(dǎo)液的MEM培養(yǎng)，選用第2代細胞實驗。

1.3 細胞分組處理及氧化應(yīng)激細胞模型的建立

將第2代OB分為：①正常對照組、Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)組[P組]；②正常對照組、H2O2(3×10-5mol/L～3×10-4mol/L)組[H組]；③正常對照組、1×10-4mol/L H2O2組[H′組]、“Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)+1×10-4mol/L H2O2”組[“P+H′”組]和“1×10-4mol/L H2O2+Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)”組[“H′+P”組]；④正常對照組、H′組、“10-5mol/L Pue+H′”組[“P′+H′”組]和10-5mol/L Pue組[P′組]。正常對照組和H′組使用普通MEM培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，而P組、“P+H′”組、“H′+P”組和P′組分別用含有10-10mol/L～10-3mol/L、10-5mol/L的葛根素培養(yǎng)液培養(yǎng)。在細胞貼壁24 h或48 h(增殖期)，匯合并誘導(dǎo)分化24 h或48 h(分化期)后除正常對照組外，結(jié)合自己的實驗結(jié)果均用1×10-4mol/L (0.1 mmol/L)的H2O2進行處理24 h，造成細胞氧化應(yīng)激損害。

1.4 細胞增殖率和ALP活性的測定

傳第2代細胞按(0.5～2.0)×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，100 μL/孔，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，按組施加不同處理因素，每組8孔。用四甲基偶氮唑藍(methyl thiazolyl tetrazolium，MTT)比色法測定OB在Pue或和H2O2處理后第3天的增殖情況，檢測波長為570 nm；細胞匯合后誘導(dǎo)分化培養(yǎng)并用葛根素或和H2O2處理后，分別在第4天用ALP測定試劑盒用酶標儀于405 nm波長處檢測吸光度值。

1.5 細胞mMDA含量、SOD活性及T-AOC的測定

硫代巴比妥酸法測定細胞的微量MDA含量，黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性，絡(luò)合物比色法測T-AOC，考馬斯亮蘭G250測定蛋白質(zhì)水平校正各測定值。均嚴格按照試劑盒說明書操作。

1.6 統(tǒng)計學處理

2 結(jié)果

2.1 原代細胞分離純化、培養(yǎng)與鑒定

多次酶消化法分離得到較高純度的原代成骨細胞，根據(jù)細胞增殖、分化及礦化過程中的形態(tài)(圖1)，成骨細胞的ALP染色、1型膠原染色和礦化結(jié)節(jié)染色等鑒定(圖2)。

2.2 不同濃度葛根素對大鼠成骨細胞增殖、分化及礦化作用的影響

與正常對照組比較，Pue 10-9mol/L～10-5mol/L均能刺激OB增殖(P<0.01)，第3天刺激最為明顯(預(yù)實驗)；細胞融合后誘導(dǎo)分化經(jīng)Pue處理后第4天時，各濃度組與對照組比較ALP活性O(shè)D值的差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，即除10-3mol/L組外其余有較明顯促進細胞分化的作用；對照組礦化結(jié)節(jié)形成較少，Pue 10-8mol/L～10-5mol/L形成礦化結(jié)節(jié)數(shù)高于對照組(P<0.05)。組間兩兩比較，10-6mol/L組OD值明顯高于其他各組(P<0.01)，而10-6mol/L組形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)增高也最明顯(P<0.01)，結(jié)果見表1。

2.3 不同濃度H2O2對成骨細胞增殖與分化的影響

2.3.1H2O2的細胞毒性反應(yīng)：加入H2O2>1×10-4mol/L(0.1 mmol/L)時產(chǎn)生細胞毒性反應(yīng)，在

鏡下見貼壁細胞幾乎全部從培養(yǎng)皿底部脫落，培養(yǎng)液上漂浮一層死細胞(圖3)。

2.3.2不同濃度H2O2對成骨細胞生長的影響：在H2O2濃度低于7×10-5mol/L時，各檢測值較對照組均有顯著增加(P<0.001)；而H2O2濃度達9×10-5mol/L以上時，反映細胞增殖和分化的OD值均有明顯下降(P<0.001)，見表2。

表1 不同濃度葛根素對成骨細胞增殖(MTT值)、分化(ALP活性)和礦化(礦化結(jié)節(jié)形成數(shù))的影響Table 1 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation, alkaline phosphatase activity, and the formation of mineralized nodules of osteoblasts

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與10-6mol/L組相比，▲P<0.05，▲▲P<0.01(因統(tǒng)計已顯示：不同濃度Pue組間兩兩比較，10-6mol/L組較其他濃度組差異顯著且OD值也最高，故為方便顯示表中僅以該濃度組為陽性對照組做比較)。

Note: Compared with the normal/control group,★P<0.05，★★P<0.01；Compared with the 10-6mol/L group,▲P<0.05，▲▲P<0.01 (The statistics have showed that the 10-6mol/L group was more significant difference than the other concentration of Pue groups and its OD value was the highest, so we only took 10-6mol/L group as positive control group for the convenience to show in the table).

表2 H2O2對成骨細胞增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影響Table 2 The effect of different concentrations of H2O2 on proliferation and alkaline phosphatase activity of osteoblasts

注：與對照組相比，★P<0.01，★★P<0.001。

Note: Compared with the control group,★P<0.01，★★P<0.001.

圖3 A和B顯示H2O2濃度分別為0.5 mmol/L和1 mmol/L時的細胞狀態(tài)。從形態(tài)上看，培養(yǎng)細胞首先出現(xiàn)突出收縮、變得細小，似干枯的樹枝(A)；胞體萎縮甚至崩解成碎片，隨后脫壁漂浮于培養(yǎng)基中(B)(100×)Fig.3 A and B were H2O2 concentrations of 5×10-4 mmol/L and 1 mmol/L, respectively. In morphology, cells appeared shrinkage and small, and dry branch like (A); the cells were increasingly atrophy and even collapse into pieces, then dropped and floated in the culture medium (B, 100×).

2.3.3適當濃度H2O2處理成骨細胞前后的形態(tài)學變化：見圖4、5。

圖4 用H2O2處理OB前的細胞狀態(tài)(100×)。加入H2O2之前，細胞生長旺盛，邊界不清(A為培養(yǎng)第4天，B為培養(yǎng)第6天)Fig.4 Morphological characteristics of osteoblasts prior to the addition of H2O2 (100×). The cells grow vigorously and its boundary were obscure before adding H2O2. (A, 4 days after culture; B, 6 days after culture).

圖5 用H2O2處理OB后的細胞狀態(tài)(100×)。加入含H2O2的培養(yǎng)液后，細胞伸出的偽足稍有收縮，使細胞的分界明顯(A：H2O2 0.1 mmol/L)；當H2O2濃度≥0.2 mmol/L時細胞開始出現(xiàn)大量死亡(B：H2O2 0.2 mmol/L)Fig.5 The morphological changes of osteoblasts treated with H2O2 (100×). The cellular pseudopods appeared shrinkage and the boundary of cells was obvious after adding H2O2 (A: H2O2 0.1 mmol/L). When the concentration of H2O2≥0.2 mmol/L, a large number of cells became dead. (B: H2O2 0.2 mmol/L).

2.4 不同濃度葛根素對H2O2損傷成骨細胞的影響

2.4.10.1 mmol/L H2O2對成骨細胞生存狀態(tài)的影響：通過以上實驗數(shù)據(jù)顯示，0.1 mmol/L H2O2加入正常生長的成骨細胞，既可對OB增殖和分化產(chǎn)生最大抑制作用，又不會產(chǎn)生嚴重毒性作用而使細胞大量死亡。用AM/PI熒光染色加入0.1 mmol/L H2O2的成骨細胞并在熒光顯微鏡下觀察細胞的生存狀態(tài)(圖6)。

圖6 熒光顯微鏡下的細胞狀態(tài)，示加入H2O20.1 mmol/L，在同一視野下存活細胞顯示黃綠色熒光(A)，而死亡細胞顯示被染成紅色(B)Fig.6 Under the fluorescence microscope, when 0.1 mmol/L of H2O2 were additioned into the culture, the survival cells showed yellow-green fluorescence (A), but dead cells were dyed red (B) in the same visual field.

2.4.2不同濃度葛根素對0.1 mmol/L H2O2損傷成骨細胞的影響：對0.1 mmol/L H2O2損傷OB前或后加入不同濃度Pue(10-10mol/L～10-3mol/L)所得的觀察值(MTT值和ALP活性的OD值)進行比較，組內(nèi)因素效應(yīng)(保護或修復(fù)損傷的效應(yīng))差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001，表中未標示，下同)，組內(nèi)因素(保護或修復(fù)損傷)與組間因素(不同Pue濃度)間的交互效應(yīng)在MTT值的比較中差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而在ALP活性檢測中差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；不同組別間的觀察值差異有顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)，與正常對照組比較，各組MTT值和ALP活性顯著降低(P<0.001)。與H2O2組相比，在細胞增殖階段，Pue10-7mol/L～10-4mol/L組MTT值顯著增高(P<0.01，其中Pue10-7mol/L和10-4mol/L兩組比較，P<0.01，10-6mol/L和10-5mol/L兩組比較，P<0.001)；在細胞分化階段，10-8mol/L～10-4mol/L的ALP活性O(shè)D值均顯著升高(P<0.001)，見表3。

表3 不同濃度Pue對H2O2損傷OB增殖(MTT值)和分化(ALP活性)OD值的影響Table 3 The effect of different concentrations of puerarin on proliferation and differentiation of osteoblasts exposed to H2O2 n=8)

注：與正常對照組比較，各組差異均有極顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001，表中未標示)；與H2O2組相比，★P<0.05，★★P<0.01。(P→H′:P+H′)和(H′→P:H′+P)分別表示先加P和先加H′。

Note: Compared with the control group, all of the other groups had statistical significance (P<0.001, not marked in the table); Compared with the H2O2group,★P<0.05，★★P<0.01. (P→H′: P+H′) indicate that add P first, and (H′→P: H′+P) that add H' first respectively.

不同濃度Pue組間兩兩比較，10-5mol/L組較其他各組差異更顯著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，所測OD值最高，但仍達不到正常組水平。

2.5 葛根素對成骨細胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影響

與正常對照組相比，單純Pue組(10-5mol/L)的mMDA含量顯著減少(P<0.01)，而SOD活性則顯著增強(P<0.01)，T-AOC也有所增加(P<0.05)；H2O2(0.1 mmol/L)組的mMDA含量顯著增高，而SOD活性和T-AOC顯著降低(P<0.01)，見表4。

表4 葛根素對成骨細胞mMDA含量、T-AOC和SOD活性的影響Table 4 The effect of puerarin on mMDA, T-AOC, and SOD in osteoblasts

注：與正常對照組相比，★P<0.05，★★P<0.01；與Pue組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01；與H2O2組相比，#P<0.05，##P<0.01。

Note: Compared with the control group,★P<0.05，★★P<0.01; Compared with the P′ group (Pue10-5mol/L),▲P<0.05，▲▲P<0.01; Compared with the H′ group (H2O20.1 mmol/L),#P<0.05，##P<0.01.

Pue使受損OB的mMDA含量顯著減少(P<0.01)，而SOD活性(P<0.01)和T-AOC則均顯著增強(P<0.05)，但仍不能使mMDA含量(P<0.01)、SOD活性(P>0.05)和T-AOC(P<0.01)恢復(fù)正常。

3 討論

成骨細胞是具有成骨潛能的細胞，也是骨組織中主要的功能細胞，它對骨組織的生長發(fā)育、損傷修復(fù)、骨代謝平衡和骨量的維持等均起著關(guān)鍵作用，它不僅分泌骨基質(zhì)參與成骨，同時也參與破骨細胞(osteoclast，OC)對骨吸收功能的調(diào)節(jié)。OB數(shù)量不斷增加，即可產(chǎn)生更多的骨組織；反之，若OB減少或功能減退則可導(dǎo)致骨小梁變細、薄弱、穿孔，皮質(zhì)骨出現(xiàn)多孔性改變等問題[9]。筆者用新生24 h內(nèi)Wistar大鼠頭蓋骨經(jīng)過多次酶消化法成功地獲得了生物學性能良好的OB，分離和培養(yǎng)的OB呈三角形、多邊形、菱形或不規(guī)則形，胞核較大呈卵圓形。

近年來，植物雌激素因其初步的療效和較小的毒副作用而具有良好的前景，成為目前研究的熱點之一。Pue是一種異黃酮類植物雌激素，化學名為4′,7-二羥基-8-D-葡萄糖基異黃酮，是中藥葛根的主要成分，且我國有豐富的野生葛根資源。Pue具有雌激素樣活性，副作用也相對較少[4]。但Pue在體外影響骨代謝，尤其是設(shè)置較大濃度范圍的Pue對OB功能的影響及其對OB抗氧化損傷作用的相關(guān)研究鮮見報道。因此，此領(lǐng)域的研究具有一定的現(xiàn)實意義。鑒于在大多數(shù)國內(nèi)文獻中一般只設(shè)置了3～4個Pue濃度進行相關(guān)研究，為了更全面了解藥物的作用和效能，筆者在之前的實驗[6]中觀察了Pue較大濃度范圍(10-10mol/L～10-3mol/L)，結(jié)果顯示，Pue在較低濃度下(10-8mol/L～10-5mol/L)刺激OB成骨的作用明顯，其中10-6mol/L作用最顯著(P<0.01)；在較高濃度(10-4mol/L～10-3mol/L)的促進作用不顯著，甚至會產(chǎn)生抑制；而過低的Pue濃度(10-10mol/L～10-9mol/L)則不會產(chǎn)生明顯的促進作用，即與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義。換言之，適當劑量的葛根素能明顯促進成骨細胞的增殖(尤以培養(yǎng)第3天時增殖最快)、分化(培養(yǎng)并誘導(dǎo)分化48 h后ALP活性增強)和礦化功能，礦化結(jié)節(jié)數(shù)量顯著多于對照組(P<0.01)。

近年來的研究表明，在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機制中氧化應(yīng)激起到了非常重要的作用[2，10]。由H2O2介導(dǎo)造成對細胞的損傷，取決于受損細胞的類型和施加的劑量大小[11]。本次實驗發(fā)現(xiàn)，成骨細胞中H2O2濃度低于7×10-5mol/L時可刺激其生長和分化；而H2O2濃度達9×10-5mol/L以上時，OB的增殖和分化均起到明顯的抑制甚至呈現(xiàn)細胞毒作用(P<0.001)，提示H2O2可能具有雙向性作用，即較低濃度促進OB生長和分化，而隨著濃度的增加這一效應(yīng)消失甚至被抑制。通過多次實驗和反復(fù)比較，最終決定采用1×10-4mol/L的H2O2，該損傷濃度既對OB的增殖和分化產(chǎn)生最大的抑制作用，同時又不會對其產(chǎn)生嚴重的毒害而導(dǎo)致細胞死亡。此與郭寶磊[12]、Zhang[13]和Lee[14]等在研究中所采用的H2O2濃度基本一致，盡管各自報道造成氧化損傷的準確劑量并不完全相同，范圍從0.01 mmol/L～1 mmol/L不等。不過這種差異可能與細胞的類型、來源、狀態(tài)，藥物的配置準確性及細胞對氧化刺激物的耐受性不同等因素有關(guān)。與H′組比較，“P+H′”和“H′+P”組中的10-7mol/L～10-4mol/L Pue使受損OB的MTT值升高(P<0.01)，10-8mol/L～10-4mol/L使ALP活性增加(P<0.001)，在各濃度組中都以10-5mol/L 的Pue組影響更為顯著(增殖中P<0.01，分化中P<0.001)，提示10-5mol/L的Pue組發(fā)揮抗氧化作用最顯著，故其保護和修復(fù)作用更為明顯(P<0.01)，且與H2O2損傷后比較，在H2O2損傷前加入Pue能起到更好的保護作用(P<0.001)，但是其OD值均低于正常對照組(P<0.001)。據(jù)此得出結(jié)論：用H2O2損傷OB后其增殖和分化程度均受到嚴重抑制，Pue對OB所受氧化損傷(或氧化應(yīng)激狀態(tài)OB)有比較強的保護和修復(fù)作用，尤其是其預(yù)防保護作用顯著強于修復(fù)作用(P<0.001)，在OB的分化過程中這種作用更顯突出(P<0.001)。然而這種作用畢竟有限，仍然達不到未受損(正常對照組)的水平。目前關(guān)于Pue對氧化應(yīng)激OB的影響尚未見文獻報道。不過，筆者的研究團隊以前研究大體的結(jié)果也顯示[15]，Pue可以改善OVX大鼠的氧化應(yīng)激狀態(tài)，防止骨質(zhì)疏松和血管病變的發(fā)生。

植物雌激素作為抗氧化劑可以阻止H2O2介導(dǎo)的氧化損傷。在所有植物抗氧化劑中，以黃酮類化合物研究最多，其清除自由基的作用也最強，通過酚羥基與自由基反應(yīng)形成穩(wěn)定半醌式自由基結(jié)構(gòu)，酚羥基是其抗氧化作用的主要活性基團，而B環(huán)是清除自由基的主要活性部位。從結(jié)構(gòu)上分析，Pue含有兩個酚羥基，為異黃酮類化合物，這可能是其發(fā)揮抗氧化作用和清除氧自由基功能的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)[16-17]。

另外，H2O2組的成骨細胞SOD活性和T-AOC減弱，mMDA含量增加，這與細胞增殖活力和分化、礦化功能受到抑制之間的關(guān)系尚不清楚，推測OB氧化產(chǎn)物(如MDA)和抗氧化酶的變化與細胞功能改變之間可能是互為因果關(guān)系。相比之下，Pue對H2O2氧化損傷的OB具有明顯的保護和修復(fù)作用，說明Pue作為一種植物雌激素，除了可能發(fā)揮雌激素樣作用外，還具有抗氧化作用，可以有效地保護和預(yù)防H2O2對OB造成的氧化損傷(P<0.01)，但仍不能使細胞的抗氧化酶系統(tǒng)完全恢復(fù)至受損前水平。然而，在并不造成氧化應(yīng)激狀態(tài)的情況下單純加入Pue，SOD活性和T-AOC明顯較正常對照組要高，MDA卻相反(P<0.05)，說明在體外正常培養(yǎng)OB的情況下也可能會發(fā)生弱的氧化應(yīng)激反應(yīng)，這進一步證實了Pue的抗氧化能力。

Dreher等[18]認為，OB自身具有一定的抗氧化能力，硒蛋白(selenoproteins)具有類谷胱甘肽過氧化物酶的作用，在人胚OB中的表達說明OB有一套新的抗氧化防御體系，它能保護OB免受骨改建過程中OC產(chǎn)生的H2O2的損害。但OB這種抗氧化作用畢竟有限，過多ROS的產(chǎn)生會導(dǎo)致OB的死亡，減少OB的數(shù)量。從本實驗結(jié)果可以推測，實驗中的正常對照組DNA自發(fā)性損傷較低，而H2O2組DNA氧化損傷情況嚴重。這可能是由于H2O2為DNA誘導(dǎo)劑，它能很容易地穿透細胞膜自由進入細胞，如不被酶解則可直接進入細胞核。在結(jié)合于DNA上的金屬離子如鐵、銅等的催化下可能轉(zhuǎn)變成具有高活性的物質(zhì)，或直接由H2O2誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)引起細胞內(nèi)DNA儲藏位點的釋放，從而造成DNA鏈的斷裂。最終H2O2不但可以造成DNA鏈的斷裂，而且抑制DNA的修復(fù)。

綜上所述，雌激素的減少或缺乏會導(dǎo)致氧化應(yīng)激，進一步促進骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。然而雌激素替代治療有諸多不可避免的副作用發(fā)生。Pue是結(jié)構(gòu)類似于雌激素的異黃酮類植物雌激素，本實驗研究發(fā)現(xiàn)其對氧化損傷的OB具有抗氧化和清除氧自由基，增加OB增殖、分化和礦化功能的作用。Pue可以有效地防御和降低H2O2對OB的氧化損傷，進而通過淬滅自由基保護OB頑強生長，促進其成骨過程。但是這一具有抗氧化作用的植物雌激素對氧化應(yīng)激后OB影響的具體機制還有待于進一步研究。