崔紅旺 孟志斌 王挺銳 祝開忠 史方富 唐崧杰 朱永俊

1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院脊柱骨病外科，海南 ?？?570102 2.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病風(fēng)濕科，海南 ?？?570102

骨細(xì)胞的死亡在絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(postmenopausal osteoporosis，PMOP)發(fā)病過程中起重要的作用[1]。以往對絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)病機(jī)制的研究主要集中在雌激素調(diào)控細(xì)胞凋亡的機(jī)制上[2]。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，在卵巢切除(ovariectomized，OVX)大鼠骨質(zhì)疏松發(fā)病過程中，程序性壞死是引起骨細(xì)胞死亡的另一種重要方式[3]。然而，雌激素缺乏是如何促發(fā)骨細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生機(jī)制，目前尚未有文獻(xiàn)報道。

腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor，TNF-α)對PMOP骨代謝的調(diào)節(jié)起著重要作用[4]。研究已證實，絕經(jīng)前健康婦女接受OVX術(shù)后8 w TNF-α明顯增加，這與骨吸收指標(biāo)密切相關(guān)[5]。TNF-α與其受體(tumor necrosis factor receptors，TNFR)作用可激活細(xì)胞程序性死亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性壞死(necroptosis)[6]。在OVX大鼠骨量丟失過程中，骨細(xì)胞程序性壞死是否與TNF-α相關(guān)及其機(jī)制尚不清楚。本研究以O(shè)VX大鼠骨質(zhì)疏松模型為研究對象，探討雌激素缺乏骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的機(jī)制，從而進(jìn)一步完善絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制，為防治絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥尋找出一條新的途徑。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

成年健康雌性12 w齡的Sprague-Dawley大鼠，體重220～260 g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。動物許可證號：SCXK(渝)2012-0001。飼養(yǎng)場所由海南省藥物安全性評價研究中心提供：標(biāo)準(zhǔn)層流SPF級動物房。飼養(yǎng)條件：5只/籠，12 h晝夜節(jié)律光照，室溫20～24 ℃，相對濕度(55±5)%。所有動物自由活動，給予標(biāo)準(zhǔn)飲食，自由飲水。實驗過程中嚴(yán)格執(zhí)行海南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究倫理委員會批準(zhǔn)的動物保護(hù)法案。

1.2 主要試劑

E2(17β-estradiol，美國Sigma-Aldrich公司)；necrostatin-1(美國Sigma-Aldrich)；Z-VAD-fmk (美國MP Biomedicals公司)；小鼠anti-RIP1單克隆抗體、兔RIP3多克隆抗體(美國 abcam)；MLKL(美國 Santa Cruz)；Drp1(美國 Cell Signaling Technology)，兔抗β-actin單克隆抗體；骨組織抗原修復(fù)液(上海舜百生物科技有限公司)；Access Estradiol試劑盒(美國 Beckman Coulter)；Envision免疫組化染色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；EDTA(德國巴斯夫)。

1.3 實驗方法

1.3.1實驗分組：實驗分為5組，60只Sprague-Dawley大鼠被隨機(jī)分為Control組(假手術(shù)，12只)和OVX組(卵巢切除術(shù)，48只)兩組。OVX組行雙側(cè)卵巢切除術(shù)，Control組行假手術(shù)。OVX組實驗大鼠再為4組：OVX+vehicle組、OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組、OVX+E2組，每組12只。

1.3.2實驗?zāi)Ｐ偷慕⒓八幬锔深A(yù)方法：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，分別行雙側(cè)卵巢切除術(shù)或假手術(shù)[7]。從術(shù)后4 w開始，所有實驗大鼠均通過腹腔注射給藥，每日一次，連續(xù)給藥4 w。OVX+vehicle組大鼠按1 000 μL/(kg·d)給予腹腔注射10% DMSO液；OVX+Nec-1組大鼠按1.65 mg/(kg·d)[8]給予腹腔注射Nec-1；OVX+Z-VAD組按1.0 mg/(kg·d)[9]腹腔注射Z-VAD；OVX+E2組按10μg/(kg·d)[8]腹腔注射E2[10]。Control組按1 000 μL/(kg·d)給予腹腔注射10%的DMSO液。

1.3.3標(biāo)本的收集與處理：因筆者前期實驗已證實大鼠骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的高峰在OVX術(shù)后8 w[3]，故本實驗選取術(shù)后8 w處死各組大鼠。銳性剔除脛骨近端骨表面的軟組織，髓腔用0.9%的生理鹽水灌洗。左側(cè)標(biāo)本立即投入液氮保存，用于Western blot檢測蛋白表達(dá)；右側(cè)每組6例標(biāo)本用電鋸切割脛骨近端，固定于2.5%的戊二醛磷酸鹽緩沖液中用于透射電鏡掃描。剩余右側(cè)6例標(biāo)本固定于4%的多聚甲醛，用于Micro-CT掃描分析骨組織微結(jié)構(gòu)變化，掃描完成后標(biāo)本應(yīng)用15%的EDTA脫鈣液脫鈣4 w，制作石蠟標(biāo)本用于免疫組化檢測。

1.3.4血清E2的測定：所有實驗大鼠在行OVX手術(shù)或sham手術(shù)時和實驗結(jié)束時行尾靜脈穿刺采血，普通生化采血管收集靜脈血，室溫靜置血清樣本完全凝聚，3000 rpm離心10 min，吸取上清500 μL，于海南醫(yī)學(xué)院學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗科使用Access Estradiol試劑盒在UniCel Dxi 800 Access儀進(jìn)行E2的檢測。

1.3.5Micro-CT掃描骨組織微結(jié)構(gòu)形態(tài)：收集標(biāo)本固定在4%的多聚甲醛，24 h內(nèi)掃描骨組織微結(jié)構(gòu)。將股骨近端放入CT掃描儀(SCANCO Medical AG 瑞士)的專用杯罩中，設(shè)置掃描參數(shù)：15 μm分辨率，70 kVp，114 μA和 250 ms 掃描速度[11]。掃描完成后保存數(shù)據(jù)，3D重建骨組織微結(jié)構(gòu)，輸出參數(shù)有骨密度(bone mineral density，BMD)、骨體積分?jǐn)?shù)(bone volume fraction，BV/TV)、骨小梁厚度(trabecular thickness，Tb.Th)、骨小梁數(shù)目(trabecular number，Tb.N)、骨小梁間距(trabecular separation，Tb.Sp)，分析閾值為245[12]。

1.3.6投射電鏡觀察骨細(xì)胞形態(tài)變化：電鏡標(biāo)本脫鈣后，將骨組織修剪為1 mm3大小的組織塊，送檢于重慶醫(yī)科大學(xué)電鏡室制作電鏡標(biāo)本。2%的鋨酸(PH為7.4)常溫下固定4 h；在4 ℃下，經(jīng)50%、70%、80%、90%的乙醇梯度脫水(各20 min)，轉(zhuǎn)入90%丙酮20 min，再轉(zhuǎn)入常溫下100%的丙酮(20 min×3次)。然后包埋于環(huán)氧樹脂包埋劑中，放置在60 ℃恒溫箱中加熱48 h，聚合硬化后形成包埋塊。應(yīng)用超微切片機(jī)將標(biāo)本切成50 nm超薄切片，放置在涂有formvar-coated的銅網(wǎng)格上晾干。最后用3%的醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，于透射電鏡下觀察骨細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)。

1.3.7免疫組化染色檢測TNF-α、RIP1、RIP3在骨組織中的表達(dá)：采用Envision免疫組化染色法檢測TNF-α、RIP1、RIP3在骨細(xì)胞的表達(dá)情況。石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，骨組織抗原修復(fù)液100 μL覆蓋組織，放置于37 ℃恒溫箱中孵育30 min，山羊血清封閉液100 μL，室溫孵育10 min；在組織上滴入50 μL左右的一抗，在4 ℃冰箱中孵育過夜(一抗稀釋比例為TNF-α 1∶100，RIP1 1∶200，RIP3 1∶100)，按試劑盒說明書依次滴加試劑1Polymer Helper和試劑2 poly-HRP anti-Rabbit IgG 或 poly-HRP anti-Mouse IgG，DAB顯色。在光學(xué)顯微鏡下以細(xì)胞漿中出現(xiàn)棕黃色為TNF-α或RIP1或RIP3陽性。采用Leica DM6000 B全自動數(shù)碼成像及分析系統(tǒng)檢測TNF-α、RIP1和RIP3蛋白表達(dá)情況，每個樣本隨機(jī)選6個視野計算陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3.8Western blot檢測MLKL、Drp1蛋白的表達(dá)：從液氮中取出骨組織標(biāo)本約200 mg投入研缽，加入液氮充分研磨成粉末狀，加入 RIPA裂解液/PMSF混合液，使蛋白充分裂解，提取骨組織總蛋白。測定蛋白濃度，并配平；凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)膜，5%BSA-TBST室溫封閉；加一抗：RIP1、 RIP3、TNF-α、MLKL、Drp1 (稀釋比例均為1∶000)，β-actin(1∶2000)， 4 ℃過夜；加入二抗37 ℃孵育1 h；TBST洗膜，ECL發(fā)光顯色。以β-actin作為內(nèi)參，采用vilber fusion fx7分析軟件進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 OVX大鼠雌激素缺乏致大鼠股骨近端骨量丟失

E2的檢測結(jié)果如圖1。在OVX+vehicle組、OVX+Nec-1組、OVX+Z-VAD組，OVX術(shù)后8 w E2較術(shù)前明顯降低 (P<0.01)，而在Control和OVX+E2組術(shù)后8 w的 E2與術(shù)前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。OVX+E2組術(shù)后8 w大鼠E2水平較OVX+vehicle組明顯升高 (P<0.01)。

圖1 各組血清E2變化注：與術(shù)前比較，##P<0.01；與術(shù)后OVX + vehicle組比較，**P<0.01。Fig.1 Changes of serum E2 in each groupNote: ##P<0.01 vs preoperative in each group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group after OVX.

Micro-CT掃描脛骨近端，3D重建骨組織微結(jié)構(gòu)分析BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp和骨密度，結(jié)果見圖2、3。與Control組比較，OVX+vehicle組BV/TV、Tb.Th、Tb.N明顯降低(P<0.01)，而Tb.Sp顯著增大(P<0.01)，脛骨近端骨組織呈明顯退變狀態(tài)。與OVX+vehicle組比較，應(yīng)用Nec-1或Z-VAD或E2治療OVX大鼠均能有效減輕骨組織的微結(jié)構(gòu)退變。與Control組比較，OVX+vehicle組BMD明顯降低(P<0.01)；OVX+Nec-1組和OVX+E2組的BMD比OVX+vehicle組增高(P<0.05)，而OVX+Z-VAD組與OVX+vehicle組的BMD相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 雌激素缺乏對去卵巢大鼠脛骨近端微結(jié)構(gòu)的影響注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01Fig.2 The effect of estrogen deficiency on bone microstructure in the proximal tibia of OVX ratsNote: ## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

2.2 雌激素缺乏通過上調(diào)TNF-α促發(fā)骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死

免疫組化檢測程序性壞死的關(guān)鍵信號分子RIP1和RIP3及TNF-α蛋白在脛骨近端骨細(xì)胞表達(dá)情況見圖4，結(jié)果顯示RIP1、RIP3及TNF-α蛋白在骨細(xì)胞均有表達(dá)，主要表達(dá)在骨細(xì)胞的胞漿。計算各個蛋白陽性細(xì)胞的百分率進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析顯示，與Control組比較，OVX+vehicle組RIP1、RIP3及TNF-α陽性細(xì)胞的百分率顯著增高(P<0.01)；Nec-1治療后明顯降低RIP1和RIP3陽性細(xì)胞的百分率(P<0.01)，而對 TNF-α蛋白表達(dá)無影響； Z-VAD治療后對 RIP3和RIP1蛋白表達(dá)無影響；OVX+E2組的TNF-α、RIP1、RIP3陽性細(xì)胞的百分率(P<0.01)較OVX+vehicle組明顯降低(P<0.01)。

圖3 雌激素缺乏對去卵巢大鼠脛骨近端骨密度的影響注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，*P<0.05。Fig.3 The effect of estrogen deficiency on bone mineral density in the proximal tibia of OVX ratsNote: ##P<0.01 vs the control group; *P<0.05 vs the OVX + vehicle group.

圖4 雌激素缺乏對去卵巢大鼠骨細(xì)胞TNF-α、RIP1、RIP3 蛋白表達(dá)的影響(標(biāo)尺25 μm)注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01。Fig.4 Effect of estrogen deficiency on the expression of TNF-α, RIP-1, and RIP-3 in osteocytes of OVX rats (Scale bar represents 25 μm)Note:## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

電鏡下觀察骨組織發(fā)現(xiàn)，在OVX+vehicle組可見有骨細(xì)胞呈典型壞死形態(tài)特征，細(xì)胞器腫脹，細(xì)胞膜破裂，胞漿內(nèi)容物外溢，見圖5。在Control組和OVX+E2組骨細(xì)胞的結(jié)構(gòu)正常，OVX+Z-VAD和OVX+Nec-1組僅可見到輕度腫脹和正常的骨細(xì)胞。

2.3 雌激素缺乏對程序性壞死下游信號分子MLKL、Drp1表達(dá)的影響

Western blot檢測程序性壞死的下游信號分子MLKL和Drp1蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示，與Control組相比，OVX+vehicle組的MLKL和Drp1蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.01)；Nec-1或E2均能有效抑制MLKL和Drp1蛋白表達(dá)(P<0.01)；而Z-VAD對MLKL和Drp1蛋白表達(dá)無影響，見圖6。

3 討論

圖5 透射電鏡觀察各組骨細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化(標(biāo)尺為1 μm)Fig.5 The morphological change of osteocytes visualized with TEM (Scale bar represents 1 μm)

圖6 Western blot分析各組骨細(xì)胞MLKL、Drp1蛋白的表達(dá)注：與對照組比較，##P<0.01；與OVX+vehicle組比較，**P<0.01Fig.6 The expressions of MLKL and Drp1 were detected using Western blottingNote: ## P<0.01 vs the control group; **P<0.01 vs the OVX + vehicle group.

PMOP是由于雌激素缺乏導(dǎo)致的骨量降低及骨小梁微結(jié)構(gòu)退變的代謝性骨骼病變。骨細(xì)胞過度死亡在PMOP的發(fā)病過程中起著重要作用，骨細(xì)胞的大量死亡破壞了骨細(xì)胞-小管結(jié)構(gòu)體系，影響了骨陷窩-小管系統(tǒng)里液體流動的改變，阻礙了骨組織重建的信息傳遞，結(jié)果形成了不可修復(fù)的骨缺損[13]。

以往研究認(rèn)為，骨細(xì)胞凋亡是PMOP發(fā)病過程中骨細(xì)胞死亡的主要方式[14]，而筆者前期的研究發(fā)現(xiàn)，OVX大鼠PMOP模型中大量骨細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死[3]。為探討雌激素缺乏導(dǎo)致骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的機(jī)制，本研究應(yīng)用大鼠OVX模型成功模擬了PMOP的發(fā)病過程，并首次探討了OVX大鼠術(shù)后TNF-α變化與骨細(xì)胞程序性壞死的關(guān)系。

程序性壞死是一種caspase非依賴的、可以被調(diào)控的細(xì)胞程序性死亡方式，它可以被TNF-α、toll樣受體、氧化應(yīng)激等因素促發(fā)[15-16]。程序性壞死的細(xì)胞具有壞死的形態(tài)學(xué)特征[17]，且可以被Nec-1特異性抑制，而不受凋亡抑制劑如Z-VAD 的影響[15]。雖然細(xì)胞程序性壞死的確切機(jī)制還未完全清楚，但是RIP1和RIP3在細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生過程中起著關(guān)鍵作用[18-19]，RIP1去泛素化后招募RIP3磷酸化，促使程序性壞死小體的形成[16]。本實驗OVX+vehicle組中，研究發(fā)現(xiàn)了大量的典型壞死骨細(xì)胞，而且RIP1和RIP3陽性細(xì)胞百分率明顯高于Control組；應(yīng)用Nec-1或E2治療OVX大鼠后，RIP1陽性率明顯下降，骨組織中看不到壞死樣的骨細(xì)胞，而Z-VAD治療OVX大鼠后骨細(xì)胞無此變化，這些結(jié)果與程序性壞死的特征一致[15-17]。這說明由于缺乏E2，OVX大鼠骨細(xì)胞發(fā)生了程序性壞死。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，OVX+vehicle組的TNF-α陽性細(xì)胞百分率明顯高于Control組，而應(yīng)用E2治療后，TNF-α的陽性率明顯下降，這與RIP1的變化趨勢一致。由此可推測，骨細(xì)胞程序性壞死可能與骨細(xì)胞TNF-α的高表達(dá)相關(guān)，其機(jī)制有待進(jìn)一步研究證實。

研究已證實RIP1和RIP3能相互磷酸化與MLKL，共同形成程序性壞死小體 “necrosome”，啟動程序性壞死[16]。MLKL能把程序性壞死小體“necrosome”的死亡信號傳遞給線粒體，使線粒體發(fā)生功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性壞死[20]。線粒體分裂調(diào)節(jié)蛋白Drp1已被證實參與調(diào)節(jié)大多數(shù)的細(xì)胞死亡過程，如Bras等[21]研究發(fā)現(xiàn)，慢性淋巴細(xì)胞白血病B細(xì)胞接受刺激后引起絲氨酸蛋白酶活化，促使Drp1轉(zhuǎn)位到線粒體，使線粒體分裂，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。本研究發(fā)現(xiàn)OVX+vehicle組MLKL和 Drp1蛋白水平顯著增高，而應(yīng)用Nec-1或E2治療OVX大鼠后，MLKL和Drp1蛋白水平下降。這與文獻(xiàn)[20-21]報道一致， MLKL和Drp1可能作為程序性壞死小體“necrosome”的下游信號分子參與了骨細(xì)胞程序性壞死的發(fā)生。然而在細(xì)胞執(zhí)行程序性壞死過程中，Drp1的作用存在爭議，Moujalled等[22]研究證實，Drp1并非是程序性壞死信號通路的關(guān)鍵因素。因此對于程序性壞死下游信號分子通路的確切調(diào)節(jié)機(jī)制有待于進(jìn)一步深入研究。

綜上所述，在OVX大鼠PMOP模型中，骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死可能是由雌激素缺乏上調(diào)TNF-α的表達(dá)所促發(fā)，MLKL和Drp1可能是骨細(xì)胞發(fā)生程序性壞死的關(guān)鍵下游信號分子。