徐亮 陶樹清 文剛 李超 陶天遵

哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院骨二科，黑龍江 哈爾濱 150081

骨質疏松癥(osteoporosis，OP)是一種以骨量減少、骨的微觀結構退化為特征的，導致骨的脆性增加，易發(fā)生骨折的全身性疾病。目前公認的骨質疏松癥的主要發(fā)病機制是成骨細胞和破骨細胞在骨重塑過程中失衡，成骨細胞數(shù)量和活性降低，而破骨細胞數(shù)量增加，功能活躍，導致骨形成減少，骨吸收增加，從而使骨吸收速率超過骨形成速率，造成骨質疏松。而骨髓間充質干細胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)作為成骨細胞和成脂肪細胞的前體細胞，其向成骨和成脂方向的分化失衡可能是導致骨質疏松的關鍵因素之一[1]。在BMSCs成骨分化過程中，細胞骨架將發(fā)生改變，而RhoA/ROCK信號通路是調控細胞骨架的關鍵信號通路之一[2]。近年來，大量研究表明，RhoA/ROCK信號通路通過改變細胞骨架，進而影響B(tài)MSCs的成骨分化[3]。目前關于RhoA在骨質疏松發(fā)病機制中的研究尚未完全明確，RhoA/ROCK信號通路在骨質疏松發(fā)病機制中的研究仍待完善。本實驗擬建造骨質疏松大鼠模型，體外培養(yǎng)骨質疏松鼠BMSCs，觀察RhoA/ROCK信號通路在BMSCs成骨分化中的作用，為臨床骨質疏松的治療提供新的靶點。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗用純系SD大鼠(購于哈爾濱醫(yī)科大學動物實驗中心)，DMEM-F12(美國Gibco公司)，胎牛血清(美國Gibco公司)，Rockl/2、RhoA抗體(美國Santa Cruz公司)，Trizol試劑盒、PCR和Westem Blot試劑(北京中山生物技術有限公司)，PCR引物(上海生工生物工程技術服務有限公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1大鼠骨質疏松模型的建立：以10%水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉；于背側沿脊柱兩側剃毛；常規(guī)2%碘伏消毒，以雙下肢屈曲位膝關節(jié)與脊柱側方10 mm交叉點為中心，取長約10～20 mm縱行切口，切開皮膚、皮下筋膜，尋找出包裹于脂肪組織中的卵巢，止血鉗分離、結扎輸卵管及其伴行血管，切除卵巢；逐層縫合，青霉素干粉涂抹切口。術后首日禁食水，而后改為正常飲食并單獨飼養(yǎng)，術后1～3 d肌注青霉素(8 iu/d)預防感染。

1.2.2BMSCs的培養(yǎng)：實驗分A、B兩組，A組細胞為骨質疏松模型組，B組為3月齡大鼠細胞組。取各組SD大鼠，頸椎離斷處死，置于75%乙醇浸泡10 min；無菌條件下剪開皮膚、暴露后肢，剪開中間膝關節(jié)、去除韌帶與多余組織，于髖關節(jié)和踝關節(jié)分別剪切，分離取出脛骨和股骨；在PBS溶液中去除股骨、脛骨周圍肌組織、剪去兩側骺板及骨骺端，反復沖洗3次；用注射器吸取5 mL無血清培養(yǎng)基，反復沖洗骨髓腔，直至骨顏色變白、髓腔內干凈為止；夾碎骨并濾掉大塊組織，收集沖洗液；1000 rpm室溫離心10 min，棄上清，收集細胞制成單細胞懸液；取少量細胞懸液與等量4%乙酸混合，顯微鏡下血球計數(shù)板計數(shù)有核細胞，重懸細胞；以5×104/mL的細胞密度接種于含完全培養(yǎng)基的25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)。取生長狀態(tài)良好的二代BMSCs，經(jīng)0.25%胰蛋白酶1 mL消化，1000 rpm室溫離心5 min，棄上清，收集細胞，補加一定量完全培養(yǎng)基制成細胞懸液；以1×104/mL的細胞密度分別接種于含完全培養(yǎng)基的6孔板(2 mL/孔)、96孔板(100 μL/孔)以及培養(yǎng)瓶中，于96孔板中取一無培養(yǎng)基孔設為空白對照；置于飽和濕度培養(yǎng)箱(37 ℃，5% CO2)中培養(yǎng)；24 h后換液，并定期在倒置顯微鏡下觀察細胞生長形態(tài)。

1.2.3BMSCs成骨分化礦化結節(jié)觀測：取6孔板中添加成骨誘導劑培養(yǎng)基培養(yǎng)的A、B組大鼠的BMSCs，培養(yǎng)3 w后棄培養(yǎng)基，PBS液沖洗2次，加適量4%多聚甲醛固定15 min，PBS液沖洗2次，加入適量1%茜素紅溶液置于室溫5 min，PBS液沖洗，倒置顯微鏡下觀察礦化結節(jié)。100×倒置顯微鏡下任選10個視野，觀察后計算細胞分化后的鈣化面積平均值與載玻片的總面積比值，并計算鈣化率。

1.2.4Western blot分析蛋白表達：各組細胞經(jīng)消化離心后，加入蛋白裂解液RIPA，冰上放置40 min，12 000 r/min于4 ℃下離心40 min，取上清。以BSA為標準，用Bradford 法對上清進行蛋白定量。取20μg蛋白樣品，10% SDS-PAGE電泳，100 V轉移1 h至硝酸纖維素薄膜，放入封閉液中37 ℃封閉1 h；一抗 4 ℃過夜。同時，另1張用不含抗體TBS-T液孵育，作為陰性對照。洗膜后，將膜與堿性磷酸酶標記的抗IgG抗體孵育，室溫輕搖1 h，洗膜后采用ECL系統(tǒng)感光顯像觀察結果。計算機成像掃描分析靶蛋白條帶，以其灰度值作為蛋白表達的相對水平。

1.2.5RT-PCR檢測軟骨細胞RhoA、ROCKl的表達：取第3代BMSCs細胞以1×105個/mL的密度接種于6孔板，每孔2 mL，72 h后以Trizol法提取總RNA，并逆轉錄為cDNA。取上述細胞提取總RNA的提取參照Trizol試劑盒說明書進行操作。取總RNA 1 g，應用逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。反應條件：95 ℃變性，60～65 ℃退火，20～37個循環(huán)。PCR反應產(chǎn)物5 uL在瓊脂糖凝膠上電泳圖像分析儀采集圖像，以β-actin為基準，做半定量分析，即以擴增目的片段β-actin的灰度比值表示所擴增的目的基因片段的相對表達水平。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 實驗結果

2.1 BMSCs的顯微鏡觀察

剛剛接種的培養(yǎng)瓶中原代細胞內含有大量的懸浮、未貼壁的骨髓基質細胞。隨著細胞液的更換，棄去培養(yǎng)液中的懸浮細胞，剩下貼壁細胞進行原代培養(yǎng)。原代培養(yǎng)約12～24 h可見細胞呈球形貼壁。培養(yǎng)24 h后換液見大部分懸浮細胞被棄掉，細胞貼壁，呈圓形、多角形、梭形等多種形態(tài)存在，貼壁細胞胞體對光的通透性及折射性較好。原代培養(yǎng)72 h后見長梭形細胞集落式生長，培養(yǎng)4 d后貼壁細胞開始增值(圖1)，原代培養(yǎng)5～6 d后可見大部分細胞貼壁，幾乎布滿瓶底，細胞呈現(xiàn)魚群樣。原代培養(yǎng)約6 d后分布在瓶底的細胞群互相接近、細胞形態(tài)發(fā)生變化，呈現(xiàn)旋渦狀(圖2)。原代培養(yǎng)約9 d后可見細胞融合為一層平鋪于瓶底。原代培養(yǎng)約12 d時，可見貼壁細胞呈現(xiàn)細絲樣改變(成纖維樣外觀)，其中B組細胞貼壁率明顯高于A組。

貼壁細胞原代培養(yǎng)約8～12 d即可以進行傳代培養(yǎng)。在無菌條件下進行消化與傳代，與原代細胞相比，子代細胞生長迅速，傳代培養(yǎng)4～6 h即可見細胞貼壁生長，培養(yǎng)24 h后子代細胞就能完全貼壁生長。貼壁細胞初期呈圓形、短梭形或多角形，同時貼壁細胞胞體對光的通透性及折射性也比較好，細胞形態(tài)逐漸趨于一致，表現(xiàn)為長梭形(圖3、4)。

圖1 BMSCs 4 d(倒置相差顯微鏡100×)Fig.1 BMSCs 4 d (inverted phase contrast microscope 100 ×)

圖2 BMSCs 7 d(倒置相差顯微鏡100×)Fig.2 BMSCs 7 d (inverted phase contrast microscope 100 ×)

圖3 BMSCs 2代(倒置相差顯微鏡100×)Fig.3 The 2nd generation of BMSCs (inverted phase contrast microscope 100 ×)

圖4 BMSCs 3代(倒置相差顯微鏡100×)Fig.4 The 3rd generation of BMSCs (inverted phase contrast microscope 100 ×)

細胞傳至第3代以后，各子代細胞在倒置顯微鏡下觀察生長情況基本相同。筆者所提取的原代骨髓間充質干細胞大致傳代10代左右，貼壁細胞的形態(tài)基本一致，傳代3～4 d細胞生長活躍、增值迅速。傳代次數(shù)與細胞活性呈現(xiàn)反比。傳至3代以后BMSCs可見細胞變形能力以及貼壁所用的時間明顯改變，能力下降。實驗數(shù)據(jù)證明第3代的骨髓間充質干細胞的活性最強。

2.2 礦化結節(jié)的觀測

細胞茜素紅染色后于兩組細胞內均可觀測到礦化結節(jié)(圖5)，A組細胞礦化率(50.02±0.05)%較B組細胞(38.50±0.05)%有明顯差異(P<0.05)。提示骨質疏松大鼠BMSCs成骨分化能力減低。

圖5 成骨細胞茜素紅染色(100×)Fig.5 Alizarin red staining of osteoblasts (100×)

2.3 各組蛋白表達情況

A、 B兩組BMSCs中均可見RhoA、ROCK1表達，其中3月齡組細胞RhoA、ROCK1的表達較骨質疏松組明顯增高(圖 6)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖6 兩組細胞RHOA、ROCK1蛋白表達Fig.6 Expression of RHOA and ROCK1 proteins in cells of two groups

2.4 各組細胞RhoA、ROCK1 mRNA的表達

A、B兩組BMSCs中均可見RhoA、ROCK1表達，其中3月齡組細胞RhoA、ROCK1的表達較骨質疏松組明顯增高(圖7)，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

圖7 各組細胞RhoA、ROCK1 mRNA表達情況Fig.7 Expression of RhoA and ROCK1 mRNA in each group

3 討論

BMSCs是目前骨質疏松癥研究的熱點，目前認為骨質疏松的發(fā)病機制與BMSCs成骨分化能力減低有關。細胞之間生物學信號的傳導是一切生理、病理過程的基礎，對細胞信號轉導的研究一直是醫(yī)學及生物學領域的熱點。從細胞膜表面受體接受信息開始、至細胞內生成信息物質的生成，標志著細胞外信號完成向細胞內的轉導過程。該過程中G蛋白對跨膜信號轉導發(fā)揮了重要作用?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的G蛋白家族共有3類，其中有兩類分別參與膜受體信息轉導與蛋白質合成過程；另一類為小G結合蛋白(small GTP-bindingproteins)，簡稱小G蛋白(small G proteins)，其功能與細胞分裂、增殖、分化等活動關系密切。

Rho是小G蛋白亞家族之一，其又包括RhoA、RhoB、RhoC、RhoD、RhoE蛋白，其中RhoB、RhoC與RhoA具有高度同源性[4]，Rho蛋白的GDP結合形式處于非活化狀態(tài)，而GTP結合則被啟動激活。活化的Rho蛋白其效應分子大多是激酶，可通過磷酸化細胞內靶分子調控細胞功能，主要包括PAKs (p21-activatedkinases，可與激活的Cdc42或Racl結合)和ROCKS(Rho-associatedcoiled-coil-forming kinases，可與激活的RhoA結合)[5]。目前，針對Rho家族的研究主要集中在RhoA、Rac1、Cdc42和TC10。目前Rho的下游底物研究較為深入的是ROCK。RhoA/ROCK信號通路在多種疾病的病理生理過程中發(fā)揮重要的作用[6]。Takeshita等通過建立大鼠骨性關節(jié)炎模型，證實在骨性關節(jié)炎軟骨中ROCK的表達明顯增加[7]。近年來，RhoA/ROCK信號通路在細胞分化中的作用越來越受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)Y-27632對BMSCs向神經(jīng)細胞分化方面具有抑制作用[8]，而Y-27632是ROCK的特異性抑制劑，因此推論RhoA/ROCK信號通路在BMSCs向神經(jīng)細胞分化方向具有重要作用。并且有報道稱在牽張應力的作用下，人牙膜細胞的成骨分化能力增強，且這種作用可能是通過RhoA/ROCK信號通路實現(xiàn)的[9]。在骨組織工程領域，激活RhoA/ROCK信號通路能夠促進間充質干細胞成骨分化能力已得到證實[10-11]。Xu等[12]也證實當RhoA/ROCK信號通路受移植時，干細胞可向成軟骨和成脂方向分化，而當信號通路激活時，干細胞可向成骨方向分化。在骨質疏松領域，因細胞內微環(huán)境改變，干細胞向成骨、成脂方向分化受多種因素調節(jié)，同時破骨細胞活性也受RhoA/ROCK信號通路的調節(jié)[13]。

本實驗通過體外培養(yǎng)骨質疏松大鼠BMSCs和正常大鼠BMSCs，發(fā)現(xiàn)在正常月齡情況下骨髓間充質干細胞的成骨分化能力強，對外界刺激的反應能力較強，而在骨質疏松狀態(tài)下，細胞的成骨分化能力減低，對外界刺激的反應能力減弱。經(jīng)Western blot及PCR實驗證明，在骨質疏松大鼠BMSCs中RhoA/ROCK信號通路的表達相對較弱，而這與骨質疏松大鼠BMSCs成骨分化能力減低有關，為臨床治療骨質疏松提供了新的研究方向。