楊雅 謝菲飛 張潔 符劉晨 符曉玲 賴曉陽

1. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，江西 南昌 330006 2. 贛州市立醫(yī)院內(nèi)分泌代謝科，江西 贛州 341000 3. 南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院骨科，江西 南昌 330006

骨質(zhì)疏松是一種骨吸收與形成失衡，骨量減少，骨的微結(jié)構(gòu)破壞，骨強(qiáng)度減退而脆性增加的退化性疾病，發(fā)病率隨著年齡的增長而增加。維生素D與骨質(zhì)疏松發(fā)病有密切聯(lián)系。維生素D通過促進(jìn)腸道和腎臟對鈣和磷酸鹽的吸收，這為骨基質(zhì)的正常礦化提供了充足的礦物質(zhì)。1，25(OH)2D3/維生素D受體(vitamin D receptor，VDR)可以促進(jìn)小腸上磷酸鹽的吸收，特別是磷酸鹽含量低時，能增加II型鈉依賴性磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)[1]。此外，1，25(OH)2D3通過作用于成熟的成骨細(xì)胞/骨細(xì)胞上其同源受體增加LRP5活性促進(jìn)骨形成，兩者聯(lián)合起來直接增加骨小梁量和皮質(zhì)骨厚度[2]，而流行病學(xué)研究資料表明維生素D和骨密度密切相關(guān)。Li等[3]對25個研究進(jìn)行Meta分析，總共4075名中國女性，發(fā)現(xiàn)中國絕經(jīng)后女性的VDR Bsml和Apal多態(tài)性和骨密度有明顯聯(lián)系。Wang等[4]納入3243名絕經(jīng)后亞洲女性進(jìn)行Meta分析發(fā)現(xiàn)VDR Fokl多態(tài)性與骨密度有關(guān)聯(lián)，并可以和其他遺傳標(biāo)志物一起用于識別骨質(zhì)疏松的高危人群。另外，維生素D可協(xié)同雌激素的作用[5]，調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的雌激素受體表達(dá)和雌激素介導(dǎo)的信號通路[6-7]，還可通過維生素D受體介導(dǎo)上調(diào)雌激素的合成[8]。

基質(zhì)Gla蛋白(marix gla protein，MGP)是14Kda的N-末端γ-羧基化蛋白家族的成員，最初從牛骨骼中分離的維生素K依賴性循環(huán)蛋白，富含賴氨酸、谷氨酸殘基，有84個氨基酸，其中包含了5個γ-羧基化的谷氨酸殘基和一個雙硫鍵[9-10]。Cancela等[11]使用MGP cDNA 探針克隆人類MGP基因，長3.9Kb，有4個外顯子，3個長的內(nèi)含子序列分隔的一種多功能細(xì)胞分化調(diào)控因子。在骨骼中MGP主要參與骨鈣化調(diào)節(jié)。MGP基因敲除小鼠出現(xiàn)身材矮小，低骨量，骨質(zhì)疏松、骨折[12]。日本、韓國等國家關(guān)于老年絕經(jīng)后女性的研究發(fā)現(xiàn)MGP基因的多態(tài)性與女性絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有密切聯(lián)系[13]。以上結(jié)果均提示MGP可能在骨質(zhì)疏松中有重要的作用。許多與成骨分化相關(guān)的蛋白或因子可調(diào)節(jié)體內(nèi)MGP的表達(dá)。

筆者前期研究已證實1，25(OH)2D3促進(jìn)原代SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞及人骨肉瘤細(xì)胞MGP的表達(dá)[14]，但具體機(jī)制仍不清楚。許多研究已經(jīng)證實了1，25(OH)2D3對Wnt /β-catenin信號傳導(dǎo)通路有促進(jìn)作用。在成骨細(xì)胞、人成骨樣TE-85骨肉瘤細(xì)胞上，VDR可以通過增加β-catenin轉(zhuǎn)錄而調(diào)節(jié)Wnt信號通路，明顯增強(qiáng)骨的合成代謝[10]但其具體機(jī)制仍不清楚。故本研究探討1，25(OH)2D3是否通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)來影響骨形成，為維生素D在骨質(zhì)疏松的防治機(jī)制提出新理論奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

人成骨肉瘤MG63細(xì)胞株購自美國培養(yǎng)保存中心(ATCC號：CRL1427)；活性維生素D，美國Sigma公司；DMEM培養(yǎng)基、I型膠原酶(collagenase type I)，美國 Solarbio公司；0.25%胰酶一ED’FA、胎牛血清，美國Gibco公司；25 em2細(xì)胞培養(yǎng)瓶、細(xì)胞培養(yǎng)板，美國Coming公司；一次性濾器，美國Millipor公司；RNAstore樣本保存液、DP408 RNase-free水，天根生化科技有限公司；DP408-02 RNAiso Plus(D9108S)、PrimeScript@RT reagent kit(Perfect Real Time，DRR037S)、Premix Ex Taqll (Perfect Real TimeDRR039A)及PCR配套試劑，寶生物工程(大連)有限公司，DKK-1美國PeproTech公司；MGP、β-catenin、Runx2、LRP5、GAPDH引物，上海Invitrogen公司；Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time)，美國Invitrogen公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：取10代人成骨肉瘤細(xì)胞MG63細(xì)胞株復(fù)蘇，于含5%的CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)液為含有10%FBS的無酚紅MEM培養(yǎng)液。細(xì)胞達(dá)匯片后按5×105細(xì)胞/瓶接種于25 cm2培養(yǎng)瓶，細(xì)胞培養(yǎng)液每2天換一次。

1.2.2 干預(yù)實驗：藥物干預(yù)：MG63細(xì)胞體積達(dá)到90%左右時，改用含0.1%BSA的無血清MEM培養(yǎng)液培養(yǎng)2d，(1)空白對照組：1%BSA+無酚紅MEM培養(yǎng)；(2)10-8M 的1，25(OH)2D3組；(3)200 ng/ml DKK-1組；(4)10-8M 1，25(OH)2D3+200 ng/mlDKK-1組干預(yù)48 h。

1.2.3 熒光定量PCR：按Trizol操作步驟提取總RNA。逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA：按照試劑盒(PrimeScript RT reagent kit，TaKaRa)要求操作，取9ulRNA樣本做逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系20 ul，反應(yīng)條件：37 ℃ 15 min 85 ℃ 5 s，1個循環(huán)，結(jié)束。熒光定量PCR反應(yīng)：管家基因GAPDH作為內(nèi)參基因，引物均由上海Invitrogen公司設(shè)計合成，引物序列見表1。優(yōu)化反應(yīng)體系，PCR反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性3 s,進(jìn)入循環(huán)，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環(huán)。每次實驗均設(shè)置復(fù)孔，重復(fù)2次。Ct值代表每個樣本2次重復(fù)的平均Ct值。比較目的基因與GAPDH基因的擴(kuò)增效率的斜率有無顯著性差異，如果沒有，以GAPDH基因作為內(nèi)參照，利用Ct值，應(yīng)用比較閾值法，即2-△△CT,(2-△△CT所得結(jié)果即表示目的基因相對于對照組的倍數(shù)，公式為△△Ct=(CtMGP-CtGAPDH)實驗組-(CtMGP-CtGAPDH)對照組。如果有顯著性差異，按Rasmussen計算出相對表達(dá)差異。

表1 各基因的引物序列及產(chǎn)物的長度Table 1 Sequence of the primer of gene

1.2.4 Western-blot雜交：按照蛋白抽提試劑盒操作要求抽提總細(xì)胞蛋白，測蛋白濃度，取60 μg細(xì)胞總蛋白于SDS-PAGE膠中電泳，電濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5%脫脂奶封閉2h，敷育一抗過夜，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗敷育2 h，化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)試劑自顯影，洗片顯帶，雜交信號用Imagemaster VDS成像分析系統(tǒng)行吸光度檢測。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 1,25(OH)2D3對MG63細(xì)胞MGP蛋白表達(dá)的影響

Western-blot結(jié)果顯示(如圖1)：使用1,25(OH)2D310-8mol/l、DKK1 200 ng/ml時，MGP蛋白的表達(dá)分別是對照組的1.21倍、0.86倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與1,25(OH)2D3相比，與DKK1聯(lián)用時MGP蛋白的表達(dá)下降0.87倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 1,25(OH)2D3對MG63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.2.1 1,25(OH)2D3及DKK-1對MG63細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)的影響：1,25(OH)2D3作用于MG63細(xì)胞以后，能明顯提高β-catenin的表達(dá)，是對照組的1.13倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。DKK-1 200 ng/ml作用于細(xì)胞以后，能明顯下調(diào)β-catenin的表達(dá)0.87倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯(lián)用β-catenin蛋白的表達(dá)下調(diào)0.93倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 western-blot 檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細(xì)胞MGP蛋白表達(dá)的影響(*P<0.05與對照組相比，**P<0.05與1，25(OH)2D3組相比)Fig.1 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of MGP protein in MG63 cells, detected by western-blot(*P<0.05 compared with the control group,**P<0.05 compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group)

圖2 Western-blot 檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細(xì)胞β-catenin表達(dá)的影響(與對照組相比*P<0.05，與1，25(OH)2D3組相比**P<0.05)Fig.2 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-catenin protein in MG63 cells, detected by western-blot(Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

2.2.2 1,25(OH)2D3對MG63細(xì)胞LRP5蛋白表達(dá)的影響：1,25(OH)2D3作用于MG63細(xì)胞以后，能明顯提高LRP5的表達(dá)，分別是對照組的1.14倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。DKK-1 200 ng/ml作用于細(xì)胞以后，能明顯下調(diào)LRP5的表達(dá)0.87倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯(lián)合用于LRP5蛋白的表達(dá)下調(diào)0.92倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 1,25(OH)2D3及DKK-1對MG63細(xì)胞Runx2蛋白表達(dá)的影響

1,25(OH)2D3作用于MG63細(xì)胞以后，能明顯提高Runx2的表達(dá)，是對照組的1.17倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4。DKK-1 200 ng/ml作用于細(xì)胞以后，能明顯下調(diào)Runx2的表達(dá)0.86倍。DKK-1與1,25(OH)2D3聯(lián)用Runx2蛋白的表達(dá)下調(diào)0.87倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

2.4 1,25(OH)2D3對人骨肉瘤MG63細(xì)胞Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)基因及MGP基因表達(dá)的影響

1,25(OH)2D310-8mol/L作用于MG63細(xì)胞以后，能明顯提高β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因的表達(dá)，分別是對照組的2.73倍、3.72倍、1.53倍、2.31倍，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，如圖5所示。DKK-1 200 ng/ml作用于細(xì)胞以后，能明顯下調(diào)β-catenin、Runx2、LRP5、MGP基因表達(dá)，分別是對照組的0.34倍、0.52倍、0.42倍、0.78倍，表達(dá)有顯著差異(P<0.05)。DKK-1與1,25(OH)2D3聯(lián)用與單獨(dú)使用1,25(OH)2D3相比，β-catenin、Runx2、LRP5、MGP的表達(dá)下調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖5 實時熒光定量PCR檢測1，25(OH)2D3及DKK-1對MG63細(xì)胞β-cateninm、Runx2、LRP5及MGP基因表達(dá)的影響(與對照組相比*P<0.05，與1，25(OH)2D3組相比**P<0.05)Fig.5 The effect of 1,25(OH)2D3 and DKK-1 on the expression of β-cateninm, Runx2, LRP5 and MGP mRNA in MG63 cells, detected by real time RT-PCR (Compared with the control group*P<0.05, compared with the 1,25(OH)2D3 10-8 mol/l group**P<0.05)

3 討論

維生素D是一種惟一由相應(yīng)的維生素D原經(jīng)陽光照射由皮膚合成的脂溶性維生素。維生素D對維持骨健康和骨骼功能方面有著重要的作用。成骨細(xì)胞上維生素D受體的過表達(dá)可影響成骨細(xì)胞的生長和分化，從而刺激骨細(xì)胞的骨形成和礦化，促進(jìn)人間充質(zhì)干細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞成骨分化[15]。體內(nèi)活性維生素D抑制骨吸收可能存在兩種機(jī)制：一是體內(nèi)長期活性維生素D可能影響鈣的內(nèi)分泌系統(tǒng)，它以一種復(fù)雜的方式抑制成骨細(xì)胞上RANKL表達(dá)。二是活性維生素D可能降低成骨細(xì)胞上RANKL的活性或誘導(dǎo)成骨細(xì)胞的細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化[15]。Lisse等[16]研究發(fā)現(xiàn)mi RNA在維生素D對成骨細(xì)胞分化和功能的微調(diào)效應(yīng)中起關(guān)鍵作用。近來還發(fā)現(xiàn)維生素D受體基因多態(tài)性與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松的發(fā)展有關(guān)。隨著研究的深入，筆者推測維生素D對骨代謝可能存在新的機(jī)制。

MGP是血管和軟骨組織鈣化的抑制劑。在血管鈣化病變中發(fā)現(xiàn)MGP調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化[17]。近年的研究證實MGP與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥有著千絲萬縷的聯(lián)系。筆者的前期動物實驗發(fā)現(xiàn)使用雌激素干預(yù)去卵巢SD大鼠后大鼠腰椎血清、尿液MGP水平升高，骨密度也增加，由此提示骨密度的增加可能與血清MGP水平的增加有關(guān)，兩者之間有密切聯(lián)系[18]。PTH、維生素K、雌激素等治療骨質(zhì)疏松癥的藥物能調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)[14]。Tuón-Le Poultel等再次證實了男性MGP基因變異可能預(yù)測骨量丟失進(jìn)展的高風(fēng)險[19]。以上臨床研究均提示MGP與骨密度存在密切聯(lián)系。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干預(yù)骨肉瘤MG63 48h后，與對照組相比MGP蛋白及基因的表達(dá)增加。前期研究也顯示1,25(OH)2D3呈劑量依賴性增加原代SD大鼠顱骨成骨細(xì)胞MGP mRNA的表達(dá)[14]。James等[20]通過放射免疫法及Northern blot技術(shù)檢測證實1,25(OH)2D3能呈濃度和時間依賴性刺激骨肉瘤細(xì)胞株UMR106-01、ROS 25/1、ROS 25/4的MGP mRNA表達(dá)，經(jīng)1,25(OH)2D3干預(yù)后MGP表達(dá)增加6～15倍。以上研究結(jié)果均與本研究一致，1,25(OH)2D3可上調(diào)MGP的表達(dá)。原代成骨細(xì)胞及本研究的細(xì)胞株體外實驗結(jié)果共同證實了維生素D對可調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)，但1,25(OH)2D3具體通過何種途徑調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)尚不清楚。

Wnt/β-catenin信號通路對骨代謝有非常密切的聯(lián)系[21-22]。Wnt信號通路可間接調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞功能及抑制分化并促進(jìn)成骨細(xì)胞分化，維持正常骨密度和骨礦物沉積。β-catenin、LRP5等相關(guān)因子的丟失可能是骨質(zhì)疏松發(fā)生的重要原因。近年研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥相關(guān)。1,25(OH)2D3可以增加Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)因子β-catenin、LRP5、Runx2的表達(dá)。本研究中使用10-8M 1,25(OH)2D3干預(yù)骨肉瘤MG63細(xì)胞 48h后，與對照組相比Wnt/β-catenin信號通路中β-catenin、LRP5、Runx2蛋白及基因的表達(dá)都增加了，由此提示1,25(OH)2D3可上調(diào)骨肉瘤MG63細(xì)胞中Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)因子的表達(dá)。本研究結(jié)果與Royan等[27]結(jié)果一致，不僅發(fā)現(xiàn)1,25(OH)2D3可促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)因子的表達(dá)，而且還發(fā)現(xiàn)在促進(jìn)β-catenin、Runx2表達(dá)的同時，也上調(diào)了MGP的表達(dá)。1,25(OH)2D3可通過促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路的核心β-catenin與T細(xì)胞因子/淋巴增強(qiáng)因子(TCF/LEF)整合而上調(diào)Runx2，促進(jìn)間充質(zhì)前體細(xì)胞的成骨細(xì)胞分化，并可通過Wnt刺激成骨細(xì)胞釋放OPG，降低RANKL的表達(dá)，因此也降低破骨細(xì)胞生成和破骨細(xì)胞的激活、促進(jìn)破骨細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)骨的合成代謝、抑制骨的吸收[23-25]，這可能是維生素D維持骨量和骨骼強(qiáng)度的機(jī)制之一，維生素D有可能通過影響Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)。

近來生化和遺傳研究認(rèn)為，DKK1作為Dickkopf家族中的一員，是一種天然的可溶性Wnt信號通路抑制劑，直接或間接通過與受體復(fù)合物的LRP5/6競爭性結(jié)合抑制Wnt信號通路，破壞成骨細(xì)胞分化。DKK1作為β-catenin/TCF途徑的下游目標(biāo)，參與了Wnt信號通路的負(fù)反饋[26]。DKK1缺失的人和鼠可導(dǎo)致骨形成的增加[27]。轉(zhuǎn)基因大鼠過度表達(dá)Wnt蛋白拮抗因子DKK1可出現(xiàn)成骨細(xì)胞數(shù)目的急劇下降，也降低了骨鈣素的表達(dá)[28]。為進(jìn)一步證實筆者的推論，使用DKK1從另一方面驗證Wnt/β-catenin信號通路是否對MGP存在影響。DKK1組與對照組相比，抑制β-catenin、Runx2、LRP5表達(dá)的同時也下調(diào)了MGP的表達(dá)，由此提示W(wǎng)nt/β-catenin信號通路受到DKK1抑制時，MGP的表達(dá)也下調(diào)，MGP的表達(dá)可能受到了Wnt/β-catenin信號通路的影響。Alfieri等[29]使用成骨細(xì)胞培養(yǎng)基和Wnt拮抗劑sFRP3共同培養(yǎng)主動脈瓣膜間質(zhì)細(xì)胞后可減弱對MGP的誘導(dǎo)表達(dá)，主動脈瓣間質(zhì)細(xì)胞Wnt信號通路的增加可導(dǎo)致骨膜蛋白和MGP的表達(dá)。Fazenda等[30]在體內(nèi)、外實驗都證實了MGP是Runx2的主要靶基因，外源性Runx2過表達(dá)可上調(diào)MGP轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。本研究結(jié)果與之前研究結(jié)果均提示W(wǎng)nt/β-catenin可影響MGP的表達(dá)，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步證實。

由此可見，維生素D可同時促進(jìn)Wnt/β-catenin信號通路中相關(guān)因子及MGP的表達(dá)，而Wnt/β-catenin信號通路抑制劑DKK1則抑制信號通路同時下調(diào)MGP的表達(dá)，推測維生素D可能通過Wnt/β-catenin信號通路調(diào)節(jié)MGP的表達(dá)，這可能為維生素D對于防治骨質(zhì)疏松癥機(jī)制研究提供了新方向，但深入的機(jī)制仍需有待進(jìn)一步研究。