陳香君 俸婷婷 楊周潔 管靜 王慧娟 趙丹 趙致 周英*

1. 貴州大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽 550025 2. 貴州省中藥民族藥創(chuàng)制工程中心，貴州 貴陽 550025 3. 貴州省藥食同源植物資源開發(fā)工程技術(shù)研究中心，貴州 貴陽 550025 4. 貴州省藥食兩用資源應(yīng)用開發(fā)工程實驗室，貴州 貴陽 550025

大血藤為我國特有植物，系木通科藤本植物大血藤Sargentodoxa Cuneata(Oliv.)Rehd. et Wils.的莖，分布于河南、江蘇、安徽、浙江、江西、湖南、湖北、四川等省。大血藤為傳統(tǒng)中藥材，性味苦平，具有清熱解毒、活血通絡(luò)、祛風(fēng)止痙等作用[1]。據(jù)文獻報道大血藤具有較強的抗氧化能力，主要與其所含的大量酚類化合物有密切關(guān)系[2]。目前，大量研究已經(jīng)證實氧化應(yīng)激在骨質(zhì)疏松(osteoporosis，OP)發(fā)生發(fā)展中起重要作用，抗氧化劑可以直接清除體內(nèi)的自由基或提高內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的水平，從而抑制生物大分子的過氧化損傷[3]，利用抗氧化劑來防治OP已成為研究熱點。對此筆者選用1，1二苯基苦基苯肼(DPPH)、Fe3+還原能力(FRAP)和2，2-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉磺酸-6)二銨鹽(ABTS)分別對大血藤醇提物不同極性部位的體外抗氧化活性進行了評價，并直接作用于過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細胞氧化應(yīng)激模型，以MC3T3-E1Subclone 14細胞的存活率、超氧化物歧化酶的活性以及細胞總抗氧化能力為指標，初步研究了大血藤不同極性部位對MC3T3-E1Subclone 14細胞的保護作用及可能的作用機制，為下一步篩選抗骨質(zhì)疏松活性成分奠定實驗基礎(chǔ)，同時也為探求開發(fā)大血藤資源的新用途奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細胞

MC3T3-E1Subclone 14小鼠顱頂前骨細胞亞克隆14，購自中國科學(xué)院細胞庫。

1.2 儀器

RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；LGJ-12型冷凍干燥機(北京松源華興科技發(fā)展有限公司)；1510型酶標儀(Thermo)；96孔酶標板(美國Corning Costar )；移液槍(Thermo)；3111型CO2培養(yǎng)箱(Thermo)。

1.3 藥物與試劑

大血藤(成都市益誠藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號：141001，產(chǎn)地：四川)；1，1-二苯基苦基苯肼( 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH )，2，4，6-三吡啶基三嗪，ABTS，抗壞血酸均購自Sigma公司；三氯化鐵、硫酸亞鐵、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、二甲基亞砜、冰醋酸、乙酸鈉、過硫酸鉀、過氧化氫等均為國產(chǎn)分析純；成骨細胞α-MEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；胎牛血清(浙江天杭生物科技有限公司)；青、鏈霉素(Solarbio公司)；MTT(GENVIEW公司)；超氧化物歧化酶測定試劑盒、總抗氧化能力測定試劑盒(南京建成)。

1.4 實驗方法

1.4.1大血藤極性部位的制備：干燥的大血藤藥材200 g粉碎，用10倍量的80%乙醇回流提取3次，合并藥液并將其濃縮至無醇味稠膏，加適量水混懸后依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，經(jīng)減壓濃縮、冷凍干燥后，得到石油醚萃取部位0.814 g、乙酸乙酯萃取部位2.206 g、正丁醇萃取部位7.024 g、水萃取部位12.12 g，取不同極性溶劑萃取物，用DMSO溶解，配制成適宜濃度的溶液，備用。

1.4.2清除DPPH自由基活性實驗：(1)DPPH溶液的配制。準確稱取19.7 mg DPPH，用無水乙醇溶解，定容到50 mL，于4℃下保存，用時移10 mL DPPH儲備液，用無水乙醇稀釋到100 mL，制成濃度為0.1 mmol/L的供試液。(2)DPPH測定方法。參考文獻[4-5]，在 96 孔板中精密加入等體積不同濃度的待測樣品溶液和0.1 mmol/L的DPPH溶液，反應(yīng)體系為300 μL，將其混勻后，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm波長下測定吸光度，VC作為陽性對照，實驗平行測定3次。DPPH 自由基的清除率(%)，其計算公式為：清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%，A0為DPPH溶液和DMSO混合液的吸光度，Ai為樣品和DPPH混合液的吸光度，Aj為樣品和無水乙醇混合液的吸光度。

1.4.3還原Fe3+能力測定：(1)TPTZ 工作液的配制。將0.3 mol/L醋酸鈉緩沖溶液(調(diào)至pH為3.6)，0.01 mol/L2，4，6-三吡啶基三嗪(TPTZ)溶液(溶解在0.04 mol/L的HCl中)和0.02 mol/L三氯化鐵溶液，以10∶1∶1(v∶v∶v)的比例混合，配制成TPTZ工作液。(2)測定方法。參照文獻[4-5]，在96孔板中分別精密加入等體積樣品溶液和TPTZ工作液，反應(yīng)體系為300 μL，混勻后，37 ℃避光反應(yīng)10 min，在593 nm下測定吸光度，以VC做陽性對照，以上實驗平行測定3次。還原性由反應(yīng)后的A表示，A=Ai-Aj-A0，A0為三蒸水的吸光度，Ai為樣品溶液反應(yīng)后的吸光度，Aj為樣品溶液的吸光度。以FeSO4標準溶液表示，樣品總抗氧化能力表示為每克提取物干重中相當于FeSO4的毫摩爾數(shù)(mmol/g)。(3)標準曲線的測定。將亞硫酸鐵(FeSO4·7H2O)溶液配制成0.02 mmol/L、0.04 mmol/L、0.08 mmol/L、0.16 mmol/L、0.32 mmol/L，按1.4.2方法測定吸光度，得到標準曲線：Y=6.8356X-0.0044，R2=0.9999。

1.4.4ABTS自由基清除能力測定：(1)ABTS自由基工作液的配制。精密稱定0.3841 g ABTS和0.0662 g K2S2O8于燒杯中，并用三蒸水定容至100 mL，使得ABTS的終濃度為7 mmol/L，過硫酸鉀的終濃度為2.45 mmol/L。將混合液在常溫下暗處放置12～16 h，使用前用無水乙醇稀釋，使其在734 nm波長下吸光度為(0.70±0.02)的ABTS+·工作液。(2)測定方法。參考文獻[4-5]，以VC為陽性對照，向96孔板中等體積加入不同濃度樣品溶液和 ABTS+·工作液，反應(yīng)體系為300 μL，震蕩10 s，靜置10 min，在 734 nm 波長處測定樣品的吸光度(Ai)；用DMSO代替樣品溶液測定空白吸光度(A0)；以無水乙醇代替ABTS混合液測定樣品本底吸光度(Aj)；每個濃度做3個平行，取其平均值。ABTS自由基的清除率(%)，其計算公式為：清除率=[A0-(Ai-Aj)]/A0×100%。

1.4.5成骨細胞實驗：(1)成骨細胞的培養(yǎng)及鑒定。將成骨細胞用含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞長成致密單層，鋪滿培養(yǎng)皿底，每板加入1 mL 0.25%的胰蛋白酶消化，顯微鏡下觀察細胞，30 s～1 min細胞成收縮成圓形，棄去消化液，加適量培養(yǎng)液終止消化，吹打培養(yǎng)板底，使細胞脫落，計數(shù)，制成細胞懸液，接種于培養(yǎng)板，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，備用。MC3T3-E1Subclone 14細胞在含有誘導(dǎo)劑50 μg/mL L-抗壞血酸、10 mmol/mL β-甘油磷酸鈉、10-8mol/mL地塞米松的成骨細胞α-MEM全培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)7 d和14 d，采用改良的鈣鉆法[6]和茜素紅染色法[7]進行堿性磷酸酶染色及礦化結(jié)節(jié)染色，在顯微鏡下大體觀察，并采集照片。(2)氧化應(yīng)激細胞模型的建立。待細胞貼壁后，將不同濃度的H2O2作用于MC3T3-E1Subclone 14細胞，選擇合適的H2O2作用濃度，建立氧化應(yīng)激模型，用于后續(xù)研究。將細胞以每孔1×104個接種至96孔板內(nèi)，待細胞貼壁后，分別給予800 μM/L、900 μM/L、1000 μM/L、1100 μM/L、1200 μM/L H2O2，作用1 h，通過MTT比色法來篩選合適的H2O2作用濃度。(3)大血藤各極性部位對成骨細胞的影響。待細胞貼壁后，更換含藥培養(yǎng)基，使大血藤各極性部位的終濃度分別為0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L，另設(shè)對照組常規(guī)培養(yǎng)。分別培養(yǎng)24 h、48 h后，利用MTT比色法測定吸光度值A(chǔ)，按公式計算細胞生存率：細胞存活率(%)=(A實驗組-A空白組)/(A對照組-A空白組)×100%。(4)大血藤各極性部位對H2O2損傷成骨細胞的保護作用。實驗分為對照組、模型組和處理組。對照組細胞按常規(guī)方法培養(yǎng)，模型組細胞用不含藥培養(yǎng)液培養(yǎng)，后用H2O2終濃度為1 mM/L的培養(yǎng)液處理1 h。處理組細胞分別用終濃度為0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L各極性部位預(yù)處理24 h后，吸棄培養(yǎng)液，PBS沖洗1次后，加入H2O2終濃度為1 mmol/L的培養(yǎng)液，處理1 h后，MTT檢測吸光值。(5)超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定。用H2O2和大血藤各極性部位處理后，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1遍，加入0.1%的Triton-X 100裂解液50 μL，4℃裂解30 min。操作按試劑盒說明書進行。SOD(%)=處理組活性值/對照組活性值×100%。(6)細胞總抗氧化能力(T-AOC)的測定。細胞處理方法同SOD的測定，按相關(guān)試劑盒說明書操作進行。T-AOC(%)=處理組能力值/對照組能力值×100 %。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 清除DPPH自由基的作用

DPPH法是檢測天然產(chǎn)物抗氧化活性常用的方法之一，當DPPH自由基被清除，其最大吸收波長519 nm處的吸光度A值隨之減小[8]。根據(jù)該法測定得到樣品和對照品的結(jié)果見表1，表1顯示，大血藤各樣品的DPPH·清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增加，其各部位清除DPPH自由基能力依次為：乙酸乙酯部位>正丁醇部位>水部位>石油醚部位。

表1 大血藤不同極性部位對DPPH·自由基清除能力Table 1 DPPH·scavenging effect of Sargentodoxa

2.2 還原Fe3+的作用

FRAP法根據(jù)樣品吸光值的大小，對照FeSO4的標準曲線來計算出試樣中對應(yīng)的Fe2+的當量，從而得出藥物的抗氧化活性的強弱[9]，大血藤醇提物各極性部位中，乙酸乙酯和正丁醇部分還原Fe3+的能力較強。見表2。

表2 大血藤不同極性部位對Fe3 +的還原能力Table 2 Fe3+ reduction ability of Sargentodoxa

2.3 清除ABTS自由基的作用

本實驗采用K2S2O8與ABTS直接反應(yīng)生成穩(wěn)定的ABTS+·來測定樣品的抗氧化能力。大血藤各極性部位的ABTS+·清除率隨著質(zhì)量濃度的升高而增加，抗氧化活性主要集中于乙酸乙酯和正丁醇部分。見表3。

2.4 成骨細胞的鑒定

顯微鏡下觀察，細胞形態(tài)為單核，梭形，也可見多邊形，細胞伸出較多突起；ALP為一種同源二聚體的糖蛋白，是成骨細胞早期分化的標志，成骨細胞經(jīng)堿性磷酸酶染色后，細胞胞漿中呈黑色顆粒沉淀；礦化結(jié)節(jié)的形成包括膠原的沉積和基質(zhì)的礦化兩個步驟，是成骨細胞分化的最后階段，成骨細胞經(jīng)茜素紅染色后，礦化結(jié)節(jié)呈橘紅色。見圖1。

表3 大血藤不同極性部位對ABTS+·的清除作用Table 3 ABTS+·scavenging effects of Sargentodoxa cuneata extract

2.5 大血藤各極性部位對成骨細胞的影響

利用MTT比色法測定不同濃度各極性部位對細胞增殖作用的影響，評價藥物的毒性作用。實驗結(jié)果如表4所示，不同濃度的各極性部位對細胞的增殖作用沒有明顯的影響，表明藥物在所選濃度范圍內(nèi)沒有細胞毒性。為了節(jié)約時間，因此在后續(xù)實驗中，將選擇0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L作為作用濃度，且作用時間選擇為24 h。

2.6 合適H2O2濃度篩選結(jié)果

分別利用800 μM/L、900 μM/L、1000 μM/L、1100 μM/L、1200 μM/LH2O2作用1 h，測定其對細胞活性的影響，如圖2所示。1 mM/L H2O2作用1 h可以導(dǎo)致成骨細胞發(fā)生50%～60%比例的細胞損傷，因此選擇該濃度作于后續(xù)研究。

圖1 成骨細胞的鑒定。A：活體狀態(tài)觀察(100×)；B：堿性磷酸酶染色(100×)；C：堿性磷酸酶染色(400×)；D：茜素紅染色(40×)；E：茜素紅染色(100×)Fig.1 Identification of osteoblasts. A: cell morphological observation (100×); B: ALP staining (100×); C: ALP staining (400×); D: Alizarin red staining (40×); E: Alizarin red staining (100×)

表4 大血藤不同極性部位對成骨細胞的影響Table 4 The effect of Sargentodoxa cuneata extract on osteoblasts n=3)

2.7 大血藤各極性部位對成骨細胞氧化損傷的保護作用

同對照組相比，單純H2O2作用可以導(dǎo)致活性細胞數(shù)量降低，給予大血藤不同極性部位預(yù)處理后，活性細胞數(shù)量以藥物濃度依賴的方式增加，其中乙酸乙酯部位(0.8 mg/L、4 mg/L、20 mg/L)作用后，改善活性細胞數(shù)量作用最佳，與對照組相比，存活率由未加大血藤保護的H2O2模型組的(49.36±0.27)%分別上升至(60.27±0.32)%、(64.27±0.45)%、(69.47±0.27)%。其次為正丁醇部位，存活率分別為(61.15±0.35)%、(62.61±0.32)%、(64.97±0.58)%。石油醚部位作用最弱，但與模型組對比，仍具有一定的作用，存活率隨著濃度的增大而上升，分別為(49.43 ±0.70)%、(52.27±0.27)%、(57.61±0.64)%。表明大血藤各個極性部位均對氧化應(yīng)激導(dǎo)致的成骨細胞凋亡具有一定的預(yù)防作用。見圖3。

2.8 超氧化物歧化酶(SOD)活性測定結(jié)果

超氧化物歧化酶對機體的抗氧化能力起著至關(guān)重要的作用，此酶通過清除超氧陰離子自由基來保護細胞免受損傷。H2O2損傷后，細胞內(nèi)SOD活力有所下降，比對照組降低了51.60%，而大血藤不同極性部位不同劑量組作用后，均能提高細胞內(nèi)SOD的活力，并且呈一定的濃度依耐性。與模型組相比，大血藤各極性部位高濃度處理組細胞內(nèi)的SOD分別升高了117.96%、207.35%、159.65%和147.98%，中濃度處理組分別升高了77.89%、180.28%、122.33%和133.77%，低濃度處理組分別升高了55.15%、146.99%、85.76%和123.55%。見圖4。

圖2 不同濃度的H2O2對成骨細胞的影響Fig.2 The effect of the different concentration of H2O2 on osteoblasts

圖3 大血藤各極性部位對H2O2氧化損傷的預(yù)防作用Fig.3 The protective effect of Sargentodoxa cuneata extraction on osteoblasts n=4)注：與模型組比較，**P<0.01，* P<0.05。

圖4 大血藤各極性部位SOD活性測定結(jié)果 Fig.4 Results of SOD activity of Sargentodoxa cuneata extracts n=3)注：與模型組比較，**P<0.01，* P<0.05。

2.9 細胞總抗氧化能力(T-AOC)的測定結(jié)果

通過測定細胞總抗氧化能力(T-AOC) 的大小，驗證大血藤是否能提高成骨細胞的整體抗氧化能力，從而達到骨保護的作用?？寡趸芰δＰ徒M的總抗氧化能力與對照組相比，降低了37.03%。大血藤不同極性部位不同劑量組與對照組對比，均能提高細胞的總抗氧化能力，其中乙酸乙酯部位抗氧化能力作用最佳，且呈濃度依耐性關(guān)系，隨著濃度的增大，抗氧化能力逐漸增強，分別為(164.32±2.96)%、(201.50±6.66)%、(221.51±7.24)%，石油醚部位抗氧化能力最弱，分別為(110.00±2.30)%、(127.99±4.39)%、(153.08±3.58)%。見圖5。

圖5 大血藤各極性部位T-AOC活性測定結(jié)果Fig.5 Results of T-AOC activity of Sargentodoxa cuneata extracts n=3)注：與模型組比較，**P<0.01，* P<0.05。

3 討論

大量研究證實氧化應(yīng)激與骨質(zhì)疏松癥存在密切的聯(lián)系。當機體處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時，機體內(nèi)會產(chǎn)生過多的活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)，超出了其清除能力，導(dǎo)致內(nèi)源性的抗氧化劑，如維生素 C、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)的量相對不足。另外，國外研究曾報道，氧化應(yīng)激導(dǎo)致成骨細胞凋亡，減少成骨細胞數(shù)量[10]。而抗氧化劑可以改善體內(nèi)的氧化應(yīng)激狀態(tài)，達到改善骨質(zhì)疏松癥狀的目的[11]。因此在此次實驗中，先測定大血藤各個極性部位的體外抗氧化能力，再直接作用于過氧化氫誘導(dǎo)的成骨細胞，通過比較氧化應(yīng)激狀態(tài)下成骨細胞的存活情況，分析可能存在的作用機制。實驗證明，大血藤可能通過增強細胞內(nèi)的SOD、CAT和GSH-Px等酶的活力，來保護MC3T3-E1Subclone 14細胞免受H2O2誘發(fā)的氧化損傷。

本實驗以體外DPPH、FRAP和ABTS法為評價方法，以抗壞血酸作為參照物，研究大血藤不同極性部位的抗氧化活性。研究表明，乙酸乙酯部位在清除DPPH自由基活性實驗，還原Fe3+能力測定中活性以及清除ABTS+·自由基活性實驗中活性最強，正丁醇部位和水部位稍低，石油醚部位抗氧化活性最低，且就同一實驗組來看，抗氧化能力與濃度成一定線性關(guān)系，濃度越高，活性越強。

目前，關(guān)于大血藤對氧化應(yīng)激后成骨細胞的影響的研究還未見報道。H2O2是最常見的活性氧自由基，易穿透細胞膜，通過攻擊細胞增殖期DNA及合成DNA所需的酶，導(dǎo)致細胞死亡和凋亡[12]。因此在此次實驗中，筆者選用H2O2直接作用于成骨細胞來制造氧化應(yīng)激模型，并且觀察到經(jīng)H2O2處理后細胞活性變差，部分細胞偽足收縮，且有無細胞的空白區(qū)域。但利用大血藤處理后，不同極性部位處理組的細胞活性均有不同程度地改善，且乙酸乙酯部位效果較佳，這與其抗氧化活性相吻合，推測乙酸乙酯部位中可能存在某種強抗氧化劑可與成骨細胞內(nèi)的活性氧作用，抑制氧化損傷，刺激細胞增殖，來達到骨保護的目的。

另外，實驗結(jié)果證實，H2O2損傷組細胞內(nèi)的SOD和T-AOC與對照組相比，都有所下降，說明H2O2處理細胞后，降低了細胞的抗氧化能力，導(dǎo)致細胞內(nèi)自由基的增多，從而抑制了成骨細胞的增殖。而大血藤乙酸乙酯部位預(yù)保護成骨細胞24 h后，可以明顯地增強細胞內(nèi)的SOD的活力及提高細胞的總抗氧化能力。總之，大血藤不同極性部位的體外抗氧化活性及對過氧化氫誘導(dǎo)成骨細胞氧化損傷的保護作用效果基本一致，均以乙酸乙酯部位作用最佳，這些結(jié)果提示，大血藤乙酸乙酯部位可能是通過增強細胞清除自由基的能力來保護成骨細胞免受H2O2誘發(fā)的氧化損傷。

大血藤的抗氧化活性主要與其所含的酚類有密切關(guān)系，而多酚類化合物在細胞系和動物實驗中已經(jīng)被證實具有良好的抗骨質(zhì)疏松作用[13]。因此筆者將結(jié)合前期的研究結(jié)果，進一步考察大血藤乙酸乙酯部位，從中尋找到一種有效的酚類化合物，以期為骨質(zhì)疏松新藥的開發(fā)提供理論和實驗依據(jù)。