康肖++扈文海++裴世深++王清和++劉璞++李士學(xué)

[摘要] 目的 研究斑蝥酸鈉維生素B6誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。 方法 應(yīng)用不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6作用于MG-63細(xì)胞，用MTT比色法檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的增殖抑制作用；反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)存活素信使核糖核酸的表達(dá)。 結(jié)果 斑蝥酸鈉維生素B6在抑制MG-63細(xì)胞增殖方面有顯著作用，其作用具有時(shí)間和劑量依賴性，抑制率可高達(dá)（68.56±5.21）%。RT-PCR顯示可下調(diào)survivin基因表達(dá)。 結(jié)論 斑蝥酸鈉維生素B6抑制MG-63細(xì)胞增殖效果明顯，其機(jī)制可能與下調(diào)survivin基因的表達(dá)有關(guān)。

[關(guān)鍵詞] 斑蝥酸鈉維生素B6；MG-63；細(xì)胞凋亡；存活素

[中圖分類號(hào)] R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-7210（2017）06（a）-0016-04

Effects of Sodium Cantharidate and vitamin B6 on apoptosis and survivin expression in human osteosarcoma cells

KANG Xiao1 HU Wenhai2 PEI Shishen1 WANG Qinghe1 LIU Pu1 LI Shixue1

1.The Third Department of Orthopedics， Hengshui Fourth People's Hospital， Hebei Province， Hengshui 053000， China； 2.Department of Bone Oncology， the Third Hospital of Hebei Medical University， Hebei Province， Shijiazhuang 050051， China

[Abstract] Objective To study the mechanism of Sodium Cantharidate and vitamin B6 inducing apoptosis of MG-63 cells. Methods The different concentrations of Sodium Cantharidinate and vitamin B6 were applied in MG-63 cells， the anti-proliferative effect of drug for cells was detected by MTT colorimetry； reverse transcription polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to detect the expression of survivin messenger RNA. Results Sodium Cantharidate and vitamin B6 could inhibit the proliferation of MG-63 cells in a time and dose-dependent manner， and the inhibition rate could be as high as （68.56±5.21）%. RT-PCR showed downregulation of survivin gene expression. Conclusion The inhibitory effect of Sodium Cantharidate and vitamin B6 on the proliferation of MG-63 cells is obvious， and the mechanism may be related to down regulation of the expression of survivin.

[Key words] Disodium Cantharidinate and Vitamin B6； MG-63； Cell apoptosis； Survivin

成骨肉瘤在臨床上作為病死率極高的原發(fā)惡性腫瘤，具有局部呈侵襲性生長(zhǎng)和早期易轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，在形成過(guò)程中能形成骨組織及其骨樣組織。該病的主要發(fā)病人群集中于10～30歲，且以男性患者居多，發(fā)病部位集中于股骨遠(yuǎn)端、脛骨與肱骨近端，該病發(fā)展迅速，會(huì)出現(xiàn)局部跳躍灶，臨床上經(jīng)常出現(xiàn)肺部轉(zhuǎn)移、骨轉(zhuǎn)移等。因此早發(fā)現(xiàn)早治療尤為重要，臨床癥狀主要表現(xiàn)為疼痛與軟組織腫塊，伴隨著抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用，科研工作者發(fā)現(xiàn)從斑蝥中提取的有效成分斑蝥素，對(duì)于多種惡性腫瘤均有治療作用[1-2]。最新研究證實(shí)斑蝥素和它的衍生物對(duì)肝癌、肺癌、卵巢癌以及結(jié)腸惡性腫瘤等具有良好的抗癌治療作用，并且在臨床抗腫瘤治療中獲得廣泛的應(yīng)用[3-4]，但是斑蝥酸鈉作用于人骨肉瘤細(xì)胞誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡方面罕見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究以MG-63細(xì)胞株作為研究對(duì)象，研究斑蝥酸鈉維生素B6在誘導(dǎo)MG-63細(xì)胞凋亡過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 骨肉瘤MG-63細(xì)胞株（由河北省骨科醫(yī)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供）。

1.1.2 藥品與試劑 斑蝥酸鈉維生素B6（貴州柏強(qiáng)制藥股份有限公司生產(chǎn)，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20053863）；二甲基亞砜（DMSO）（天津永大化學(xué)試劑）；MTT（美國(guó)Sigma）；Trizol試劑（Invitrogen公司）；PCR引物[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

1.1.3 儀器 倒置相差顯微鏡（LH50A型），日本Olympus公司；全自動(dòng)酶標(biāo)分析儀（Biocell-HT2），奧地利Anthos公司；PCR擴(kuò)增儀（PE9600），美國(guó)ABI公司。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)細(xì)胞 用人骨肉瘤細(xì)胞培養(yǎng)基來(lái)培養(yǎng)MG-63細(xì)胞。在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。在試驗(yàn)用倒置顯微鏡下來(lái)觀察MG-63生長(zhǎng)狀態(tài)，在MG-63生長(zhǎng)呈70%～80%融合狀態(tài)時(shí)，用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代，每隔1 d換培養(yǎng)液，每隔3、4 d傳代1次。

1.2.2 MTT方法測(cè)定細(xì)胞的增殖 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×105/mL，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，于培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，24 h后，將各孔內(nèi)培養(yǎng)基吸出，加入藥物濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 μg/mL斑蝥酸鈉維生素B6的培養(yǎng)基，設(shè)置空白對(duì)照組，培養(yǎng)24、48、72 h，在結(jié)束前4 h，將10 μL MTT（濃度為5 mg/mL）加入培養(yǎng)孔內(nèi)，繼續(xù)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，棄上清液，各培養(yǎng)孔中加入10%二甲基亞砜150 μL，用振蕩器震蕩10 min，應(yīng)用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)培養(yǎng)孔內(nèi)的光密度值（OD），以492 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)（參考波長(zhǎng)620 nm）。測(cè)算不同藥物濃度對(duì)MG-63生長(zhǎng)的抑制率。抑制率=（1-實(shí)驗(yàn)組光密度值/對(duì)照組光密度值）×100%。

1.2.3 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)的變化 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MG-63細(xì)胞數(shù)調(diào)整為1×104/mL，接種于3塊6孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔注入量為3 mL。置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)4 h，待細(xì)胞貼壁后再加入藥物濃度為0.1、0.5、1.0、2.5、5.0 μg/mL斑蝥酸鈉維生素B6，培養(yǎng)24、48、72 h，用試驗(yàn)用倒置顯微鏡觀察MG-63細(xì)胞形態(tài)變化。

1.2.4反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測(cè)存活素基因表達(dá) 分別提取實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組細(xì)胞的總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增。將逆轉(zhuǎn)錄的PCR產(chǎn)物應(yīng)用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳后，運(yùn)用凝膠成像系統(tǒng)以及分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將存活素吸光度值與β-actin吸光度值的比值來(lái)代表存活素相對(duì)含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)處理均采用SPSS 14.0版本軟件完成，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)藥物對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT分析結(jié)果表明，經(jīng)不同藥物濃度的斑蝥酸鈉維生素B6處理24、48、72 h以后，人骨肉瘤細(xì)胞增殖隨濃度增加受到明顯抑制，抑制率達(dá)到（68.56±5.21）%，其作用具有顯著的時(shí)間和劑量依賴性（表1）。

2.2 倒置顯微鏡觀察結(jié)果

對(duì)照組細(xì)胞呈現(xiàn)貼壁式生長(zhǎng)，生長(zhǎng)趨勢(shì)良好，細(xì)胞呈現(xiàn)透明狀態(tài)，外形為梭形，細(xì)胞顆粒較少，細(xì)胞分界相對(duì)清楚，隱約可見(jiàn)核仁；處理組細(xì)胞伴隨藥物濃度升高和藥物作用時(shí)間增加，細(xì)胞外形逐漸改變?yōu)閳A形，貼壁式生長(zhǎng)細(xì)胞顯著減少，漂浮生長(zhǎng)細(xì)胞數(shù)明顯增加，細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)受到破壞，能夠存活的細(xì)胞數(shù)顯著下降，在藥物濃度達(dá)到5.0 μg/mL時(shí)，可以見(jiàn)到大部分細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞裂解及大量細(xì)胞碎片。

2.3 存活素信使核糖核酸表達(dá)

RT-PCR顯示：經(jīng)不同藥物濃度斑蝥酸鈉維生素B6處理24 h后，存活素信使核糖核酸（survivin mRNA）條帶隨藥物濃度增加蛋白電泳條帶的寬度逐漸變窄，條帶亮度呈逐漸下降趨勢(shì)，survivin mRNA/β-actin比值分別為（0.803±0.018）、（0.898±0.015）、（0.933±0.008），與對(duì)照組（0.989±0.006）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），提示藥物濃度逐漸增加，存活素信使核糖核酸（survivin mRNA）表達(dá)逐漸降低（圖1）。

3 討論

在臨床醫(yī)學(xué)上對(duì)于骨肉瘤患者的病情診斷需要借助臨床、影像學(xué)和病理三結(jié)合的診斷原則，20世紀(jì)80年代以前醫(yī)學(xué)上采取單純的手術(shù)作為治療手段，主要包括截肢與保肢，如今伴隨著技術(shù)的不斷發(fā)展輔助化療逐步得到認(rèn)可，術(shù)前化療-手術(shù)-術(shù)后化療的模式已在各國(guó)廣泛運(yùn)用，顯著改善患者的病情，經(jīng)過(guò)該種模式的綜合治療，患者5年生存率高達(dá)60%～80%。但是化療藥物的毒副作用使得應(yīng)用受到限制，患者身體難以承受，因此尋找一種高效低毒的抗癌藥物已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外共同的研究目標(biāo)。近年來(lái)，由于新輔助化療存在較大的藥物毒副作用，從而導(dǎo)致化療終止或化療藥物減小劑量，不能達(dá)到預(yù)期化療效果，從而顯著影響新輔助化療的療效發(fā)揮[5-6]。由于中藥及提取物具有毒副作用低、不容易出現(xiàn)耐藥性等特點(diǎn)成為近期研究的焦點(diǎn)[7]。

現(xiàn)在醫(yī)學(xué)上不斷在天然草本中尋求合適的中藥來(lái)提取有效的抗腫瘤成分，不僅擁有毒副作用低的優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)能在抗腫瘤病情發(fā)展的各個(gè)階段發(fā)揮作用，具有多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多效應(yīng)的特點(diǎn)。伴隨著抗腫瘤藥物的研發(fā)與應(yīng)用，科研工作者發(fā)現(xiàn)從斑蝥中提取的有效成分斑蝥素，對(duì)于多種惡性腫瘤均有治療作用。斑蝥在我國(guó)中醫(yī)藥文化中應(yīng)用較廣，早在公元前12世紀(jì)先人就學(xué)會(huì)用它來(lái)進(jìn)行治療，藥用斑蝥主要為黃黑小斑蝥和南方大斑蝥的干燥全蟲，在《本草綱目》、《神農(nóng)本草經(jīng)》等作品中都有記載。最新研究證實(shí)斑蝥素和它的衍生物對(duì)胃癌、小細(xì)胞肺癌、附件惡性腫瘤、肝癌以及結(jié)腸癌等具有良好的抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的作用，并在臨床治療過(guò)程中獲得良好的治療效果[8-10]。研究證實(shí)斑蝥素可改變?nèi)梭w內(nèi)多種蛋白質(zhì)的表達(dá)及活性，阻斷腫瘤細(xì)胞的進(jìn)一步轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，同時(shí)引發(fā)細(xì)胞周期阻滯，促使腫瘤的逐步凋亡。最初人們發(fā)現(xiàn)的斑蝥素雖然能明顯改善腫瘤情況，但它毒性大，容易對(duì)患者產(chǎn)生較大的刺激與傷害，因此醫(yī)學(xué)上通過(guò)合成斑蝥素衍生物來(lái)降低危害，斑蝥酸鈉抗腫瘤細(xì)胞的活性比斑蝥素顯著增強(qiáng)，抗癌譜更廣泛，但是斑蝥酸鈉的毒副作用較斑蝥素明顯減小[11]。斑蝥酸鈉是斑蝥素經(jīng)過(guò)氫氧化鈉水解生成的半合成衍生物，借助自身的小分子量的優(yōu)勢(shì)容易進(jìn)去患者體內(nèi)細(xì)胞，加強(qiáng)了抗腫瘤效果。制劑中的維生素B6可減少治療中的惡心、嘔吐癥狀，減輕對(duì)泌尿系統(tǒng)的刺激，同時(shí)具有升高全血白細(xì)胞的作用[12]。

機(jī)體細(xì)胞凋亡過(guò)程進(jìn)行嚴(yán)格調(diào)控，來(lái)維持自身生命過(guò)程中組織器官的穩(wěn)定性，但是在細(xì)胞凋亡失去控制時(shí)，就會(huì)引發(fā)自身細(xì)胞的過(guò)度增殖或者過(guò)度凋亡[13-14]。正常狀態(tài)下，人體內(nèi)的細(xì)胞在增殖與凋亡上處于動(dòng)態(tài)平衡，但腫瘤細(xì)胞的出現(xiàn)便會(huì)打破這一局面，腫瘤細(xì)胞在人體內(nèi)異常增殖導(dǎo)致病情的急劇惡化，因此在治療過(guò)程中控制腫瘤細(xì)胞的增殖便是治療的關(guān)鍵。MTT比色法是一種用來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性的有效檢測(cè)方法，在科研實(shí)驗(yàn)中廣泛應(yīng)用[15]，主要通過(guò)測(cè)定一定波長(zhǎng)的吸光度值來(lái)快速檢測(cè)，能比較科學(xué)、精確地反映細(xì)胞的分裂及增殖。本研究將配比的不同濃度的斑蝥酸鈉維生素B6處理24、48、72 h以后，應(yīng)用MTT比色法測(cè)定不同濃度藥物對(duì)人骨肉瘤細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，藥物對(duì)MG-63細(xì)胞增殖的抑制作用具有時(shí)間和劑量依賴性。藥物對(duì)MG-63細(xì)胞的抑制比率可高達(dá)（68.56±5.21）%。

凋亡抑制基因存活素是凋亡抑制蛋白家族的新成員之一，1997年由Ambrosini等發(fā)現(xiàn)[16]。存活素具有腫瘤表達(dá)的特異性，存活素僅在腫瘤和胚胎組織中表達(dá)，研究證實(shí)其與腫瘤細(xì)胞分化增殖和浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有密切相關(guān)性，目前成為抗腫瘤基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)，各國(guó)學(xué)者對(duì)存活素在多種腫瘤中的表達(dá)進(jìn)行了廣泛的研究[17-19]。由于存活素有在惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)的特點(diǎn)，科研人員對(duì)存活素在骨肉瘤細(xì)胞中的表達(dá)做了相關(guān)研究，認(rèn)為通過(guò)對(duì)骨肉瘤組織中存活素的測(cè)定，能幫助判斷骨肉瘤患者的預(yù)后，從而成為骨肉瘤在基因治療方面的新靶點(diǎn)[20-22]。由于存活素具有僅在腫瘤組織中表達(dá)，而正常人體組織中不表達(dá)的特性，存活素成為檢測(cè)骨肉瘤發(fā)生、發(fā)展的理想腫瘤標(biāo)志物，并為骨肉瘤患者將存活素為靶點(diǎn)進(jìn)行精準(zhǔn)提供理論基礎(chǔ)[23-25]。本研究發(fā)現(xiàn)斑蝥酸鈉維生素B6可以下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞株中存活素的表達(dá)。斑蝥酸鈉維生素B6可以下調(diào)骨肉瘤細(xì)胞株中存活素的表達(dá)是該藥物可以誘導(dǎo)人骨肉瘤細(xì)胞凋亡的理論基礎(chǔ)之一，提示斑蝥酸鈉維生素B6的抗腫瘤作用是通過(guò)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，斑蝥酸鈉維生素B6可以顯著抑制MG-63的細(xì)胞增殖，并且呈現(xiàn)正相關(guān)性，為以后同其他化療藥物的聯(lián)合應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)。斑蝥酸鈉維生素B6在下調(diào)人成骨肉瘤細(xì)胞存活素基因的表達(dá)中發(fā)揮作用；斑蝥酸鈉維生素B6作為一種中藥有效成分的半合成衍生物，可顯著抑制MG-63的細(xì)胞增殖，體現(xiàn)其在骨肉瘤治療方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（收稿日期：2017-02-07 本文編輯：張瑜杰）