趙軍波++++++王斌++++++嚴肖嘯++++++崔翠

[摘要] 目的 探討色素上皮衍生因子（PEDF）對大鼠視神經(jīng)急性損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞（RGCs）軸突線粒體超微結(jié)構(gòu)的保護作用。 方法 選取健康雌性SD大鼠60只隨機分為三組：空白組、模型組和實驗組，每組各20只，空白組不做任何處理，模型組和實驗組均采用視神經(jīng)鉗夾法用反向鑷鉗夾左眼視神經(jīng)造成視神經(jīng)不全損傷，右眼不予處理。模型組和實驗組左眼造模后即刻、1周、2周分3次分別向玻璃體腔注射平衡鹽溶液5 μL和PEDF 1 μg。三組大鼠均在第3周時取材，分別取10只大鼠左眼眼球制作標本，電鏡下觀察視網(wǎng)膜組織超微結(jié)構(gòu)的改變；并將三組剩余大鼠左眼眼球制備成5 μm視網(wǎng)膜切片，常規(guī)HE染色后對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行計數(shù)。 結(jié)果 透射電鏡觀察模型組與實驗組同空白組相比均存在線粒體水腫、胞質(zhì)濃縮軸突腫脹。同模型組相比實驗組胞質(zhì)濃縮軸突腫脹輕，線粒體結(jié)構(gòu)較完整。HE染色實驗組和模型組的神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)都明顯低于空白組（P < 0.05），實驗組神經(jīng)節(jié)細胞從細胞形態(tài)上要好于模型組，且RGCs數(shù)量較模型組多。模型組和實驗組神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)較空白組分別下降73.3%、53.3%，兩者差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。 結(jié)論 視神經(jīng)不全損傷可引起視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的明顯損害，PEDF可以減輕視神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的損害，并減少視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞凋亡。

[關(guān)鍵詞] 色素上皮衍生因子；視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞 急性視神經(jīng)損傷；超微結(jié)構(gòu)；線粒體

[中圖分類號] R332 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2017）06（a）-0028-04

Effect of pigment epithelium derived factor on ultra structure of acute optic nerve injury in rats

ZHAO Junbo1 WANG Bin2▲ YAN Xiaoxiao1 CUI Cui1

1.Department of Ophtalmology， Central Hospital of Handan， Hebei Province， Handan 056002， China； 2.Forth Department of Neurology， Central Hospital of Handan， Hebei Province， Handan 056002， China

[Abstract] Objective To investigate the protective effect of pigment epithelium derived factor （PEDF） on mitochondria axon ultra structure of retinal ganglion cells （RGCs） in rats after acute optic nerve injury. Methods 60 SD rats were randomly divided into 3 groups： blank group， model group and experiment group， each group included 20 rats. The blank group was not given any disposal， rats in model group and experiment group were treated with forceps clamping left eye optic nerve to cause incomplete injury of optic nerve， the right eye was not given any disposal. The model group and experiment group， the left eyes models successfully made immediately， at 1 week and 2 weeks， the rats was injected balanced salt solution 5 μL and PEDF 1 μg into vitreous cavity respectively. Rats of three groups were harvested at the third week， 10 rats left eyeball were taken out to make specimens in each group， changes of retinal ultra structure was observed by the electron microscopy； the remaining rats were prepared to make 5 μm retinal slices， the retinal ganglion cells were counted by routine HE staining. Results Mitochondria edema， cytoplasm condensed axon swelling existed in model group and experiment group， compared with the blank group by observing with the electron microscopy. Compared with model group， the degree of cytoplasm condensed axon swelling was lesser， and structure was more completely in the experiment group. HE staining showed ganglion cells in the experiment group and model group were less （P < 0.05）， cell morphology of ganglion cells were better and the number of RGCs were more in experiment group. The number of ganglion cell counts in model group and experiment group decreased by 73.3% and 53.3% respectively， the difference was statistically significant （P < 0.05）. Conclusion Incomplete injury of optic nerve can cause obvious damage to the ultra structure of the optic nerve， and PEDF can relieve the damage of the ultra structure of the optic nerve.， also can weaken the apoptosis of RGCs.

[Key words] Pigment epithelium derived factor； Retinalganglion cells； Acute optic nerve injury； Ultra structure； Mitochondria

色素上皮衍生因子（PEDF）是Tombran-Tink等[1]從體外培養(yǎng)的胎兒視網(wǎng)膜色素上皮細胞中分離出的一種有效的內(nèi)生性多功能因子。此后又從人類和小鼠中克隆并純化出PEDF[2]。近年來又發(fā)現(xiàn)其具有抑制新生血管形成、營養(yǎng)保護腦神經(jīng)、抗氧化等功能[3]。關(guān)于PEDF對視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞保護作用的研究多集中在減輕氧化應激損害、減輕光損害、缺血-再灌注損害等，而關(guān)于外傷性急性視神經(jīng)損傷后PEDF對視神經(jīng)損傷修復的報道不多。本實驗通過對視神經(jīng)急性損傷后超微結(jié)構(gòu)的觀察，探討PEDF對外傷性視神經(jīng)損傷后視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的保護作用。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康雌性SD大鼠60只（由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證號：1508079），體重0.20～0.25 kg，眼部檢查無眼疾。

1.2方法

1.2.1 動物模型制作及給藥方法 將60只大鼠隨機分為：空白組、模型組和實驗組，每組各20只。模型組和實驗組均采用視神經(jīng)鉗夾法將左眼制成視神經(jīng)損傷模型[4]，右眼不予處理。模型組和實驗組在禁食12 h后腹腔注射10%水合氯醛（0.35 mL/100 g）麻醉，顯微鏡下操作，沿角膜緣處用眼科手術(shù)剪剪開顳側(cè)球結(jié)膜，用彎剪鈍性分離并充分暴露視神經(jīng)，在球后視神經(jīng)2 mm處用反向鑷鉗夾住視神經(jīng)，夾持力為98 g，夾住視神經(jīng)20 s，造成視神經(jīng)不全損傷。致傷眼瞳孔散大，檢眼鏡查眼底，無視網(wǎng)膜出血者為制模成功。制模成功后模型組即刻向玻璃體腔注射平衡鹽溶液5 μL，而實驗組即刻向玻璃體腔注射PEDF 1μg。模型組之后的1、2周再次向玻璃體腔注射平衡鹽溶液5 μL，而實驗組同樣在1、2周時向玻璃體腔注射PEDF 1 μg。

1.2.2 組織制備 三組大鼠均在第3周時取材，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，球后視神經(jīng)2 mm處剪斷視神經(jīng)并摘除整個眼球，4%多聚甲醛固定24 h后行眼內(nèi)容剜除，將后段眼環(huán)用生理鹽水沖洗血跡4%多聚甲醛固定，4°冰箱保存。

1.2.3 電鏡標本的制作與觀察 隨機在三組各取10只大鼠的后段眼環(huán)組織將其分割切成1 mm×1 mm組織條，選擇位于視乳頭周圍1.5 mm組織，標記后送電鏡室，由專業(yè)人員將其制成50 nm超薄切片（視神經(jīng)為橫斷面切片），染色后透射電鏡（型號：日本日立H-7500）觀察、照相。

1.2.4 視網(wǎng)膜HE染色 將三組剩余大鼠的后段眼環(huán)組織乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將包埋好的眼球標本，按平行于視神經(jīng)矢狀軸為平面的視網(wǎng)膜進行連續(xù)切片，切片厚度約5 μm。將做好待用的切片進行HE染色。每張組織標本切片取4個光學顯微鏡下的視野，以視盤為中心，以1.5 mm為半徑形成的圓形范圍內(nèi)，四個方向?qū)ΨQ各取1個視野，每個眼球只抽取和使用1張切片。使用圖像分析系統(tǒng)對制備好的標本切片進行分析，光鏡（型號：日本BX51T-PHD-J11）下觀察視網(wǎng)膜形態(tài)學變化并對每張切片4個視野的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進行計數(shù)，取其均值作為該切片的計數(shù)結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 16.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠視神經(jīng)的超微結(jié)構(gòu)改變：

空白組視神經(jīng)髓鞘完整軸漿均勻， 軸漿內(nèi)可見清晰的正常微管、微絲和線粒體（圖1A）。視神經(jīng)損傷模型組核質(zhì)、胞質(zhì)水腫，細胞器減少，線粒體水腫空泡化，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，顆粒融合、脫顆?，F(xiàn)象（圖1B）。實驗組染色質(zhì)邊移，輕度厚薄不勻，線粒體數(shù)量較模型對照組多， 且結(jié)構(gòu)較完整，胞質(zhì)濃縮軸突腫脹輕（圖1C）。

2.2 HE染色的視網(wǎng)膜切片形態(tài)學觀察和RGCs計數(shù)

PEDF實驗組（14.25±1.65）（圖2A，封三）和模型組（7.98±1.69）（圖2B，封三）的神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)都明顯低于空白組（29.62±2.24）（圖2C，封三），差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。實驗組神經(jīng)節(jié)細胞從細胞形態(tài)上要好于模型組，且RGCs數(shù)量較模型組多，模型組和實驗組神經(jīng)節(jié)細胞計數(shù)較空白組分別下降73.3%、53.3%，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

3 討論

PEDF由眼內(nèi)多種組織合成如視網(wǎng)膜、脈絡膜等，并分泌作用于眼內(nèi)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞等多種組織。在胎兒的視網(wǎng)膜色素上皮細胞、某些神經(jīng)母細胞、視網(wǎng)膜、脈絡膜、睫狀體、角膜內(nèi)皮細胞等均有PEDF表達[5]。研究發(fā)現(xiàn)PEDF在胎兒和青年人的視網(wǎng)膜色素上皮（RPE）細胞中的表達要明顯高于正常人體眼球內(nèi)的表達。目前已知PEDF對神經(jīng)系統(tǒng)中的許多部位有分化、營養(yǎng)和保護作用，例如初級海馬神經(jīng)元、小腦顆粒細胞（CGCs）和脊髓運動神經(jīng)元等[6]。有研究顯示其濃度為0.1 nm時就可以促進細胞生存和軸突生長[7]，并能夠使雞胚胎的脊髓運動神經(jīng)元分化加快，并促進存活[6]。PEDF可以保護小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元、視桿細胞減輕過氧化氫或光損害導致的細胞減少、細胞壞死等改變[8]。PEDF不僅對急性神經(jīng)損傷、中毒有保護作用，還可對抗其慢性神經(jīng)損害，起神經(jīng)營養(yǎng)和保護作用[9]。在高灌注等眼部缺血損傷模型中證實PEDF可保護視網(wǎng)膜神經(jīng)元細胞抑制其凋亡[10]。目前PEDF營養(yǎng)神經(jīng)的作用機制尚不清楚[11]。有研究顯示PEDF可能通過改變鈣離子在細胞內(nèi)外的濃度而起到神經(jīng)保護作用，在實驗模型中顯示PEDF可以降低小腦顆粒細胞鈣離子濃度的峰值，這提示PEDF可能是調(diào)節(jié)細胞膜的鈣泵、鈉鈣交換器、鈣離子結(jié)合蛋白等鈣離子清除機制，而不是直接抑制電壓敏感性鈣離子通道，從而起到對抗谷氨酸鹽神經(jīng)毒性作用，使得細胞生存延長[12]。PEDF改變鈣離子在細胞內(nèi)外的濃度可能也是通過多通道共同作用的結(jié)果，其可以使細胞凋亡過程開始后線粒體形態(tài)和位置改變變輕，從而使得鈣離子通道發(fā)生改變，也可以作用于一些抑制凋亡因子或促凋亡因子而發(fā)生作用，但這些仍需進一步實驗研究，關(guān)于PEDF保護成熟運動神經(jīng)元的調(diào)節(jié)機制是否同細胞內(nèi)外鈣離子濃度平衡有關(guān)還沒有得到充分證實[13]。此外Yabe等[14]的研究證實PEDF還可通過激活NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑而使抑制凋亡因子Bcl-2等表達上調(diào)而發(fā)揮神經(jīng)保護作用[15]。因此，PEDF可抑制凋亡，并提高視網(wǎng)膜Bcl-2蛋白表達，Bcl-2可通過抑制線粒體在凋亡因素刺激下形態(tài)變化、功能缺失與結(jié)構(gòu)破壞，保持線粒體膜電位的穩(wěn)定，抑制Bax的移動和作用，阻止線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔和Caspase的開發(fā)及激活減緩細胞凋亡[16]。另外，Tsao 等[17]研究發(fā)現(xiàn)PEDF 能夠誘導細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK1 /2） 蛋白磷酸化使其活化，而對氧化應激狀態(tài)下的RPE 發(fā)揮保護作用[18]，這提示 ERK1 /2 通路可能也是PEDF神經(jīng)保護的一個作用方向。Amano等[19]研究發(fā)現(xiàn)PEDF可通過上調(diào)高糖或者H2O2暴露周細胞中谷胱甘肽過氧化物酶的水平并增強其活性并活化Caspase-3起到抗凋亡的作用[18]。

本實驗通過鉗夾視神經(jīng)成功制作外傷性視神經(jīng)損傷動物模型，實驗中筆者從視神經(jīng)節(jié)細胞的觀察及計數(shù)可發(fā)現(xiàn)模型組和實驗組RGC層排列明顯稀疏，數(shù)目較空白組明顯減少，神經(jīng)纖維空泡樣變性，細胞形態(tài)紊亂。實驗中觀察大鼠視網(wǎng)膜的超微結(jié)構(gòu)可以發(fā)現(xiàn)模型組和實驗組視網(wǎng)膜均出現(xiàn)不同程度的病變。如線粒體數(shù)量減少、線粒體水腫、胞質(zhì)水腫。線粒體是人體內(nèi)重要的細胞器，在視網(wǎng)膜和視神經(jīng)內(nèi)含量較高，為視覺信號傳導和細胞生命活動提供必需的能量，線粒體功能異?？蓪е翿GCs凋亡。視神經(jīng)損傷后由于多種因素作用可致使線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，造成線粒體通透性改變、腫脹、外膜破裂，導致細胞色素c釋放，細胞色素c釋放不但能激活Caspase，致使Caspase-3活化，還可以導致線粒體膜電位崩潰，Ca2+外流，這些又進一步加劇了線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，引發(fā)惡性循環(huán)，最終致造成神經(jīng)節(jié)細胞不可逆性的損傷[20]。本實驗的觀察結(jié)果也從超微結(jié)構(gòu)病變發(fā)展的角度提示了RGCs凋亡乃至死亡均可能因外傷性視神經(jīng)損傷引起的RGCs線粒體超微結(jié)構(gòu)的損害。線粒體的功能缺失與結(jié)構(gòu)破壞，是導致RGCs凋亡乃至死亡的機制。此外同模型組相比實驗組胞質(zhì)濃縮軸突腫脹輕， 線粒體數(shù)量較模型對照組多， 且結(jié)構(gòu)較完整。且RGCs數(shù)量較模型組多。這說明PEDF減緩或抑制了凋亡，抑制了視神經(jīng)損傷后多種損傷因素刺激下線粒體的去極化，減少了凋亡誘導因子的釋放，發(fā)揮了保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的作用。這為臨床上預防和治療諸如外傷性視神經(jīng)病變、青光眼性視神經(jīng)病變、缺血性視神經(jīng)病變等視神經(jīng)病變的治療提供了新的思路。關(guān)于PEDF神經(jīng)保護作用的具體作用機制很可能是通過多種機制共同調(diào)節(jié)的結(jié)果，其作為一種可能的新的神經(jīng)保護劑，作用機制仍需進一步實驗研究。

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（收稿日期：2017-02-11 本文編輯：蘇 暢）