杜 芳,劉 偉,劉 敏,劉 芳,王曉紅

·論 著·

原代乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧損傷模型的構(gòu)建

杜 芳1,劉 偉1,劉 敏1,劉 芳1,王曉紅2

目的 構(gòu)建體外培養(yǎng)乳鼠心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型。方法 原代乳鼠心肌細胞培養(yǎng)至第5天進行干預(yù)，缺氧過程(H)將細胞置入1% O2、5% CO2、37 ℃三氣培養(yǎng)箱內(nèi)無糖無血清依次培養(yǎng)1、2、3、4 h，再復(fù)氧過程(R)更換含10%胎牛血清低糖DMEM正常培養(yǎng)6 h。將細胞共分5組：正常對照組，H1R6組，H2R6組，H3R6組，H4R6組。觀察C組和各H/R組再復(fù)氧6 h時心肌細胞一般形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)，用CCK-8法檢測細胞增殖情況，乳酸-丙酮酸法測定乳酸脫氫酶(LDH)活性，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率。結(jié)果 與C組比較，各H/R組心肌細胞一般形態(tài)及超微結(jié)構(gòu)損傷明顯,隨缺氧缺糖時間延長，其損傷逐漸加重；與C組比較，各H/R組細胞增殖減少，培養(yǎng)液LDH活性升高(P<0.05),隨缺氧時間延長，細胞增殖逐漸減少(P<0.05)，培養(yǎng)液LDH活性逐漸升高(P<0.05)；與C組比較，各H/R組細胞早期凋亡率明顯增加(P<0.05)，且隨缺氧時間延長，凋亡率逐漸升高(P<0.05)。結(jié)論 成功建立乳鼠心肌細胞H/R損傷模型，該模型可靠穩(wěn)定，重復(fù)性好，且缺氧時間以3 h為宜。

心肌細胞；缺氧；復(fù)氧；無糖；缺血-再灌注；損傷

近年來心血管疾病發(fā)病率逐漸升高，隨著冠脈搭橋術(shù)、血管成形術(shù)、體外循環(huán)術(shù)、心臟移植術(shù)等的推廣應(yīng)用，心肌缺血-再灌注損傷現(xiàn)象越來越受到臨床關(guān)注。因此，建立心肌細胞缺氧/復(fù)氧(H/R)損傷模型對于在離體水平下研究心肌缺血-再灌注發(fā)生的機制具有重要意義[1]。目前已知的細胞缺氧方法很多，單純性物理法和化學(xué)法制造的缺氧環(huán)境不穩(wěn)定，O2濃度和缺氧時間不易控制，無法建立穩(wěn)定可靠的H/R模型[2-3]，實驗重復(fù)性較差，研究結(jié)果不具說服力[3-4]。本研究擬體外原代培養(yǎng)乳鼠心肌細胞，采用物理性缺氧(1% O2)，同時更換無糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的方法，模擬缺血過程，恢復(fù)糖氧供給模擬再灌注過程，通過觀察細胞一般形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)、細胞損傷酶活性以及細胞凋亡率，以期建立一種穩(wěn)定可靠的體外心肌細胞缺血-再灌注損傷(MIRI)模型。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器:胎牛血清、低糖DMEM培養(yǎng)基、無糖DMEM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶和L-谷氨酰胺均購自Gibco公司(美國)；Ⅱ型膠原酶、5 溴-2，5 溴脫氧核苷尿嘧啶(Brdu)、臺盼藍購自Sigma公司(美國 )；D-Hank’s 液、青鏈霉素混合液等其他試劑購自北京索萊寶科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)活性測定試劑盒(江蘇南京建成生物工程研究所)；CCK-8細胞活力檢測試劑盒(日本同仁公司)；Annexin V-FITC-PI 雙染試劑盒(江蘇南京貝博公司)。

1.2 原代乳鼠心肌細胞分離培養(yǎng):以文獻[5]介紹的方法分離培養(yǎng)乳鼠心肌細胞并加以改良，取6～8只3日齡內(nèi)的SD大鼠[由寧夏醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，許可證號：SCXK(寧)2015-0001]，以75%酒精全身擦洗3遍，無菌條件下取出心臟，用D-Hank’s 液清洗3次，取心尖處心肌組織，剪成1 mm3組織塊。首次用0.125%胰蛋白酶和0.1%Ⅱ型膠原酶等量混合液共10 mL(酶量根據(jù)鼠心臟大小、數(shù)目調(diào)整),在37 ℃水浴下置于磁力攪拌器上消化15 min；棄去首次上清液，之后逐漸縮短每次消化時間、減少酶量，并收集細胞懸液。吸出上清液，加入培養(yǎng)液(10%胎牛血清，低糖DMEM培養(yǎng)基)終止消化，輕輕吹打均勻后4 ℃保存。最后一次消化結(jié)束，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾，再以800 r/min離心5 min后棄去上清液，重懸于含1%青鏈霉素和10%胎牛血清的低糖DMEM培養(yǎng)液中，吹打均勻后接種于直徑為100 mm培養(yǎng)皿中，差速貼壁60～90 min。取上清液計數(shù)細胞(臺盼藍拒染法)，調(diào)整密度，以(3～4)×105個/mL的密度接種于6孔板或直徑為60 mm培養(yǎng)皿內(nèi)(預(yù)先用L-谷氨酰胺包被)，加入0.1 mmol/L Brdu (抑制成纖維細胞生長)，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔24 h換液，培養(yǎng)至第5天進行干預(yù)。

1.3 心肌細胞H/R損傷模型的構(gòu)建:心肌細胞培養(yǎng)至第5天進行干預(yù)。正常對照組細胞在5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。缺氧組缺氧時間依次為1、2、3、4 h，再復(fù)氧時間均為6 h，故共分4組：H1R6組，H2R6組，H3R6組，H4R6組。調(diào)整Thermo三氣培養(yǎng)箱(Thermo公司,美國)參數(shù)：1% O2、5% CO2、37 ℃穩(wěn)定1 h，同時將無糖DMEM培養(yǎng)基預(yù)先置入培養(yǎng)箱中預(yù)溫、飽和。心肌細胞棄去原含血清的低糖DMEM培養(yǎng)基，PBS洗2遍，換不含血清的無糖DMEM培養(yǎng)基(6孔板，每孔1.5 mL)。將缺氧組細胞置入缺氧培養(yǎng)箱內(nèi)(待培養(yǎng)箱預(yù)設(shè)條件達標(biāo)后開始計時)，細胞接受缺氧、無糖、無血清分別培養(yǎng)1、2、3、4 h。復(fù)氧過程為棄去無糖DMEM培養(yǎng)基，換用含10%胎牛血清低糖DMEM培養(yǎng)基，5% CO2、37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h。

1.4 觀察指標(biāo)

1.4.1 心肌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察:復(fù)氧6 h后，C組和各H/R組隨機取3 皿，在倒置相差顯微鏡(Olympus 公司，CKX31，日本)下(×400)觀察細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化。

1.4.2 心肌細胞超微結(jié)構(gòu)觀察:取C組和各H/R組細胞，每組6皿，0.25%胰蛋白酶消化貼壁細胞，1 000 r/min離心5 min，PBS漂洗，離心收集細胞，2%戊二醛固定15 min，離心收集細胞，再次固定1 h后離心棄上清液。1%鋨酸4 ℃固定60 min，PBS漂洗，離心棄上清液，梯度酒精脫水、離心，環(huán)氧丙烷浸透包埋，60 ℃烤箱烘烤過夜，使之固化成硬塊。修塊切片后制成70 nm的切片，用枸醋酸鈾、枸椽酸鉛雙重染色。

1.4.3 CCK-8檢測細胞增殖情況：細胞接種于96孔板中(細胞數(shù)約5 000個/孔)，培養(yǎng)至第5天，C組及各H/R組(每組4孔)復(fù)氧6 h后，每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm處吸光度。實驗重復(fù)3次。

1.4.4 細胞培養(yǎng)液LDH活性測定:取C組及各H/R組(細胞接種于6孔板，每組4孔)細胞上清液標(biāo)本500 μl，-20 ℃保存，乳酸脫氫酶(LDH)活性檢測試劑盒同批檢測，嚴格按照說明書進行操作，實驗重復(fù)3次。

1.4.5 流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率：原代心肌細胞接種于6孔板(每組3復(fù)孔)，C組及各H/R組復(fù)氧6 h后，用胰酶消化心肌細胞，將預(yù)冷的PBS洗2次，1 000 r/min 離心5 min，收集細胞，用流式細胞儀(BD公司 Accuri C6，美國)檢測細胞早期凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 心肌細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)觀察(圖1-圖4，目錄后)：C組細胞生長良好，大部分細胞貼壁逐漸擴展，呈梭形或不規(guī)則的星形，伸出偽足，交織成網(wǎng)，呈放射狀排列；H1R6組細胞結(jié)構(gòu)完整，表面顆粒增多；H2R6組細胞皺縮，表面顆粒明顯增多；H3R6組細胞明顯皺縮，偽足縮短或減少，間隙增寬；H4R6組細胞結(jié)構(gòu)破壞，部分脫落懸浮。

2.2 心肌細胞超微結(jié)構(gòu)觀察(圖5-圖8，目錄后)：C組細胞線粒體結(jié)構(gòu)完整，體積大小不一，嵴較多、排列整齊；H1R6組細胞線粒體輕度腫脹，嵴仍清晰；H2R6組細胞線粒體腫脹明顯，極少數(shù)嵴斷裂；H3R6組細胞線粒體高度腫脹，部分線粒體膜破裂，嵴稀疏，可見透光區(qū)；H4R6組細胞線粒體結(jié)構(gòu)幾乎全破壞，嵴稀疏，可見多個空泡。

2.3 CCK-8法檢測細胞增殖及細胞培養(yǎng)液 LDH活性測定結(jié)果比較：與C組比較，各H/R組細胞增殖減小，培養(yǎng)液LDH活性升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；隨缺氧時間延長，細胞培養(yǎng)逐漸減少(P<0.05)，培養(yǎng)液LDH活性逐漸升高(P<0.05)，見表1。

表1 正常對照組和各H/R組細胞培養(yǎng)及細胞培養(yǎng)液LDH活性的比較

2.4 流式細胞儀檢測各組細胞早期凋亡率情況：細胞早期凋亡率H1R6組(8.37±0.78)%、H2R6組(12.80±2.86)%、H3R6組(20.37±1.33)%、H4R6組(31.93±1.65)%，與C組(3.27±0.15)%比較，各H/R組細胞早期凋亡率明顯增加(P<0.05)，且隨缺氧時間延長，逐漸升高(P<0.05)。

3 討論

缺血-再灌注損傷是臨床常見的病理生理過程，建立體外心肌細胞H/R損傷模型對探索心肌缺血-再灌注損傷機制、尋找有效干預(yù)藥物具有重要意義。目前對于成功建立心肌細胞H/R損傷模型沒有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，多數(shù)研究者通過檢測細胞活力和細胞凋亡率等指標(biāo)，以確定造成穩(wěn)定的細胞損傷[6]，為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

本實驗采用穩(wěn)定的可監(jiān)測O2濃度的三氣培養(yǎng)箱(1% O2、5% CO2、37 ℃)制造缺氧環(huán)境，同時為更好模擬體內(nèi)缺血過程，在缺氧時更換無糖、無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，建立乳鼠心肌細胞H/R模型，使實驗條件穩(wěn)定、標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)。通過CCK-8法檢測細胞活力，流式細胞儀檢測細胞早期凋亡率(Annexin V-FITC-PI染色)，心肌細胞損傷酶學(xué)指標(biāo)改變定量評估細胞損傷，同時結(jié)合細胞一般形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)改變，確定合適的缺氧時間。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著缺糖缺氧時間延長(由1～4 h)，光鏡下觀察到細胞表面顆粒增多，細胞皺縮，偽足減少，缺氧4 h心肌細胞結(jié)構(gòu)破壞，脫離貼壁生長。電鏡下見心肌細胞線粒體明顯腫脹，嵴斷裂、稀疏，缺氧4 h時線粒體結(jié)構(gòu)幾乎全破壞，可見多個空泡，細胞損傷過重。LDH是一種糖酵解酶，存在于機體所有組織細胞的胞質(zhì)內(nèi)，心肌細胞LDH活性遠高于血清數(shù)百倍。任何原因引起的細胞損傷均可使LDH逸出[7-9]。細胞線粒體中的脫氫酶可將CCK-8還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產(chǎn)物，該產(chǎn)物數(shù)量與活細胞的數(shù)量呈正比。用酶聯(lián)免疫檢測儀在450 nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數(shù)量[10]。本研究證實，與正常對照組相比，各H/R組細胞培養(yǎng)液LDH活性升高，細胞增殖減少，且隨缺氧時間延長，LDH活性逐漸升高，細胞增殖逐漸減少，以缺氧4 h最明顯。細胞凋亡是心肌缺血-再灌注損傷細胞死亡的重要機制，與正常對照組相比，各H/R組細胞早期凋亡率均增加，且隨缺氧時間延長，凋亡程度逐漸加重，缺氧4 h細胞凋亡率已超過30%。

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Construction of hypoxia/reoxygenation injury model in primary neonatal rat myocytes

DU Fang1, LIU Wei1, LIU Min1, LIU Fang1, WANG Xiaohong2.

1.Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Department of Intensive Care Unit,General Hospital of Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China

WANG Xiaohong,Email：wxhhelen2005@sina.com

Objective To establish a model of hypoxia / reoxygenation (H/R) injury in the cultured neonatal rat myocytes in vitro.Methods Cardiomyocytes isolated from neonatal rat hearts were cultured for 5 days. Cardiomyocytes being subjected to hypoxia (H) were placed in glucose-free and serum-free DMEM and submitted to hypoxic conditions in tri-gasincubator (1%O2,5% CO2,37 ℃) for a periods. Cardiomyocytes were exposed to hypoxia for 1hr, 2hrs,3hrs and 4hrs respectively. Then followed by reoxygenation, the myocytes recieving reoxygenation (R) were incubated in low glucose DMEM medium containing 10% fetal bovine serum for a further 6hrs. Thus, the cells were divided into five groups: control group (group C), group H1R6, group H2R6, group H3R6 and group H4R6. After 6hr of reoxygenation, morphological features and ultrastructure changes in cardiomyocytes were observed, cell viability was measured by CCK-8 assay, the activity of lactate dehydrogenase (LDH) was determined by lactic acid-pyruvate method and the early cell apoptotic rate was detected by flow cytometry.Results Compared with group C, the morphology and the ultrastructure of cardiomyocytes were obviously damaged in H/R groups, with increasing time of oxygen-glucose deprivation, the damage of cardiomyocytes gradually aggravated; Compared with group C, the cell viability decreased and the LDH activity in the culture media increased in H/R groups (allP<0.05), with the increase of hypoxia time, the cell viability decreased gradually (allP<0.05) and the LDH activity in the culture media increased gradually (allP<0.05); Compared with group C, the early apoptotic rate of H/R groups were significantly increased (all P<0.05), and with the increase of hypoxia time, the early apoptotic rate were increased gradually (allP<0.05). Conclusion The model of hypoxia / reoxygenation (H/R) injury in the cultured neonatal rat myocytes is established successful. This model is reliable, stable and can be repeated well, the oxygen-glucose deprivation time for 3hrs is more appropriate.

Cardiomyocytes;Hypoxia;Reoxygenation;Glucose-free;Ischemia-reperfusion;Injury

10.13621/j.1001-5949.2017.07.0577

國家自然科學(xué)基金資助項目(81460288);寧夏自然科學(xué)基金資助項目(NZ1242)

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)，寧夏 銀川 750004 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院ICU，寧夏 銀川 750004

杜芳(1991-)，女，在讀碩士研究生，從事重癥醫(yī)學(xué)研究方向。

王曉紅，Email：wxhhelen2005@sina.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/64.1008.R.20170713.0844.002.html

R332

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2017-02-14 [責(zé)任編輯]王凱榮