張紅萍 袁梅

白藜蘆醇與吉非替尼的協(xié)同抗肺癌作用及機(jī)制研究

張紅萍 袁梅

目的探討白藜蘆醇是否能提高吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷活性并研究其機(jī)制。方法MTT法檢測(cè)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9細(xì)胞在低濃度吉非替尼和白藜蘆醇處理下的細(xì)胞活力。Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)低濃度吉非替尼和白藜蘆醇對(duì)PC9細(xì)胞c-met表達(dá)水平，表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）磷酸化水平及caspases活化水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PC9細(xì)胞在低濃度吉非替尼和白藜蘆醇處理下的凋亡率。結(jié)果低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)PC9的細(xì)胞活力抑制率顯著高于低濃度吉非替尼組和白藜蘆醇組[（57.7±3.3）%比（12.4±1.1）%、（8.6±0.8）%，P＜0.05]。白藜蘆醇處理可誘導(dǎo)PC9細(xì)胞c-met蛋白的下調(diào)并顯著增強(qiáng)低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞PI3K和AKT磷酸化水平的抑制作用。低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇組對(duì)PC9細(xì)胞活力的抑制率和凋亡誘導(dǎo)率顯著高于低濃度吉非替尼組和低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質(zhì)粒組[抑制率：（57.7±3.3）%比（12.4±1.1）%、（16.3±1.3）%，P＜0.05；凋亡率：（30.9±1.8）%比（7.2±0.5）%、（10.6±0.8）%，P＜0.05]。低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇組對(duì)PC9細(xì)胞caspase-9及caspase-3的活化顯著強(qiáng)于低濃度吉非替尼組和低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質(zhì)粒組。結(jié)論白藜蘆醇可能通過下調(diào)c-met的表達(dá)提高肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性。

非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞；PC9細(xì)胞；白藜蘆醇；c-met；PI3K/AKT；吉非替尼

非小細(xì)胞肺癌是一種發(fā)病率和死亡率都非常高的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害人類健康[1]?；熓欠伟┲委煹某Ｒ?guī)方法，但其嚴(yán)重的毒副作用卻限制了其應(yīng)用[2]。因此針對(duì)肺癌腫瘤細(xì)胞的靶向治療更能被患者所接受。吉非替尼屬于一種表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑，對(duì)正常細(xì)胞的副作用很小而對(duì)肺癌細(xì)胞有很好的靶向性，因此吉非替尼現(xiàn)已作為一線藥物廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療[3]。然而隨著吉非替尼的持續(xù)使用，肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性會(huì)逐漸降低[4]。因此通過輔助治療藥物提高肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性是提高其療效的有效方法。本研究探討天然藥物白藜蘆醇是否能提高吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷活性并研究其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料吉非替尼、白藜蘆醇、噻唑藍(lán)（3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bro mide，MTT）和凋亡檢測(cè)試劑盒購于美國Sigma-Aldrich。DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco。c-met、磷酸化表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、磷酸化磷脂酰肌醇激酶（PI3K）、磷酸化絲氨酸蘇氨酸激酶（AKT）、活化半胱天冬酶-9（caspase-9）、活化半胱天冬酶-3（caspase-3）和β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）兔抗人抗體購于美國Cell Signaling。ECL試劑盒（增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑盒）購于美國Pierce。pcDNA3.1和Lipofectamine2000（脂質(zhì)體2000）購于美國Invitrogen。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系PC9細(xì)胞購于美國ATCC。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，在37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)并通入5%CO2。

1.3 c-met重組質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染將c-met基因cDNA全長(zhǎng)序列（Gene ID：NM_001324401）以分子克隆的方法與pcDNA3.1連接后構(gòu)建成c-met重組真核表達(dá)質(zhì)粒[5]。使用Lipofectamine2000按照試劑說明書操作將2μg/mL c-met質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC9細(xì)胞中。

1.4 細(xì)胞活力抑制率測(cè)定將PC9細(xì)胞按5×103/孔接種在96孔板上孵育過夜。將細(xì)胞用c-met質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后用0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L的吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細(xì)胞48h，之后加入20mLMTT（5mg/mL）37°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h，移除孔內(nèi)培養(yǎng)基，加入100μL二甲亞砜，570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值。分組情況及各組藥物濃度見表1。細(xì)胞活力抑制率用以下公式計(jì)算：抑制率=（OD對(duì)照組-OD藥物處理組）/OD對(duì)照組×100%。

1.5 Western blot實(shí)驗(yàn)將PC9細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上孵育過夜。將細(xì)胞用c-met質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后用0.01μmol/L吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細(xì)胞48h。之后用蛋白提取液提取腫瘤細(xì)胞中的總蛋白質(zhì)。將等量的總蛋白質(zhì)用12% SDS-PAGE進(jìn)行電泳分離。分離完畢后通過電轉(zhuǎn)方法將蛋白質(zhì)從分離膠上轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用c-met、磷酸化EGFR、磷酸化PI3K、磷酸化AKT、活化caspase-9、活化caspase-3和β-actin。兔抗人抗體孵育過夜，之后再用帶辣根過氧化物酶的二抗孵育2h，蛋白條帶用ECL試劑盒顯色發(fā)光。

1.6 細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)將PC9細(xì)胞按5×105/孔接種在6孔板上孵育過夜。將細(xì)胞用c-met質(zhì)粒進(jìn)行轉(zhuǎn)染。24h后用0.01μmol/L吉非替尼及10μmol/L白藜蘆醇處理腫瘤細(xì)胞48h。之后按照凋亡試劑盒說明書步驟將PI（碘化丙啶）和Annexin-V加入細(xì)胞中孵育20min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡，Annexin-V陽性細(xì)胞即為凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 白藜蘆醇對(duì)吉非替尼的協(xié)同抗肺癌作用MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的殺傷活性呈劑量依賴性，0、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05μmol/L的吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的細(xì)胞活力抑制率分別為0、（12.4±1.1）%、（28.5±1.9）%、（42.2±2.8）%、（56.9± 3.2）%、（67.5±3.9）%。低濃度吉非替尼（0.01μmol/L）和10μmol/L白藜蘆醇單獨(dú)治療，對(duì)PC9細(xì)胞的殺傷活性較弱，兩者聯(lián)合后能顯著誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生死亡（P＜0.05），見表1。

表1 白藜蘆醇增強(qiáng)低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的殺傷活性（）

表1 白藜蘆醇增強(qiáng)低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的殺傷活性（）

注：與低濃度吉非替尼組比較，#P＜0.05；與白藜蘆醇組比較，△P＜0.05；與低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組低濃度吉非替尼組白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3吉非替尼濃度（μmol/L）0 0.01 0 0.01 0.01白藜蘆醇濃度（μmol/L）0 0 1 0 10 10細(xì)胞活力抑制率（%）0 12.4±1.1 8.6±0.8 57.7±3.3#△16.3±1.3*

2.2 白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PI3K/AKT途徑的抑制作用Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著抑制PC9細(xì)胞c-met的表達(dá)，而低濃度吉非替尼單獨(dú)治療雖能顯著抑制表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）的磷酸化，但對(duì)PI3K/ AKT磷酸化抑制作用較弱（圖1）。然而低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇后，PC9細(xì)胞的PI3K/AKT磷酸化受到顯著抑制（圖1），提示白藜蘆醇能增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PI3K/AKT途徑的抑制作用。當(dāng)轉(zhuǎn)染c-met表達(dá)質(zhì)粒后，低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇對(duì)PI3K/ AKT途徑的抑制作用顯著降低（圖1），表明白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PI3K/AKT途徑的抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質(zhì)粒組的PC9細(xì)胞活力顯著低于低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組（P＜0.05），表明白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PC9肺癌細(xì)胞的殺傷活性，見表1。

2.3 低濃度吉非替尼聯(lián)合白藜蘆醇顯著誘導(dǎo)PC9細(xì)胞發(fā)生caspases依賴的凋亡流式細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著提高低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)率（P＜0.05），而轉(zhuǎn)染c-met質(zhì)粒能顯著抑制兩者聯(lián)合對(duì)PC9細(xì)胞的凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)（P＜0.05），見表2。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著促進(jìn)低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞caspase-9和caspase-3的活化（圖2）。表明白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)促進(jìn)低濃度吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)和caspases的活化。

3 討論

白藜蘆醇是一種有很強(qiáng)藥理活性的天然多酚類物質(zhì)，對(duì)多種疾病均有良好的治療效果。近期研究表明，白藜蘆醇還有十分良好的抗腫瘤效應(yīng)，如白藜蘆醇可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[6]，還可通過ROS途徑誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞的死亡[7]。另外，白藜蘆醇聯(lián)合雷帕霉素還可有效治療膀胱癌[8]。這些研究都證明白藜蘆醇對(duì)腫瘤有很好的的輔助治療作用，有良好的應(yīng)用前景。本研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇能顯著增強(qiáng)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，使低劑量的吉非替尼亦能發(fā)揮強(qiáng)大的殺傷腫瘤細(xì)胞的生物活性，證明白藜蘆醇與吉非替尼存在協(xié)同抗肺癌活性。

圖1 白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PI3K/AKT途徑的抑制作用

圖2 白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)caspase-9和caspase-3的活化

文獻(xiàn)報(bào)道，非小細(xì)胞肺癌腫瘤細(xì)胞表面的表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）會(huì)發(fā)生過表達(dá)或突變。吉非替尼等表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFRTKIs）對(duì)這些EGFR突變型的肺癌細(xì)胞（如PC9細(xì)胞）有很好的靶向性和殺傷活性，因此吉非替尼是目前治療非小細(xì)胞肺癌的一線藥物[9]。在EGFR信號(hào)通路中，活化的EGFR能導(dǎo)致PI3K及其下游分子AKT的磷酸化使之發(fā)生活化。腫瘤細(xì)胞中AKT的持續(xù)活化又能通過激活下游分子促進(jìn)細(xì)胞的增殖和存活，同時(shí)抑制凋亡的發(fā)生，因此吉非替尼通過抑制EGFR/ PI3K/AKT通路發(fā)揮對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷作用[10]。然而腫瘤細(xì)胞中的PI3K/AKT通路除了受EGFR調(diào)控外，還受肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體c-met的調(diào)節(jié)。高表達(dá)的c-met能激活腫瘤細(xì)胞中包括PI3K/AKT在內(nèi)的多種促進(jìn)腫瘤存活和生長(zhǎng)的信號(hào)通路[11-12]。因此，c-met途徑是誘導(dǎo)肺癌細(xì)胞產(chǎn)生對(duì)吉非替尼獲得性耐藥的重要機(jī)制，過表達(dá)的c-met同樣能顯著激活PI3K/ AKT通路而不依賴于EGFR的活化[13]。

表2 白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)（）

表2 白藜蘆醇通過下調(diào)c-met蛋白的表達(dá)增強(qiáng)吉非替尼對(duì)PC9細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)（）

注：與對(duì)照組比較，△P＜0.05；與低濃度吉非替尼組比較，#P＜0.05；與白藜蘆醇組比較，&P＜0.05；與低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組比較，*P＜0.05

組別對(duì)照組低濃度吉非替尼組白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇組低濃度吉非替尼+白藜蘆醇+c-met質(zhì)粒組孔數(shù)3 3 3 3 3吉非替尼濃度（μmol/L）0 0.01 0 0.01 0.01白藜蘆醇濃度（μmol/L）0 0 1 0 10 10 c-met質(zhì)粒濃度（μg/mL）0 0 0 0 2細(xì)胞凋亡率（%）1.5±0.3 7.2±0.5△4.8±0.4 30.9±1.8#&10.6±0.8*

本研究結(jié)果顯示，低劑量的吉非替尼雖然能抑制PC9肺癌細(xì)胞的EGFR信號(hào)，但卻不能抑制這些細(xì)胞中PI3K/AKT的活化。當(dāng)用白藜蘆醇對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行處理后，細(xì)胞中c-met的表達(dá)水平顯著降低，使c-met/PI3K/AKT通路受到抑制，從而使肺癌細(xì)胞中PI3K/AKT的活化恢復(fù)對(duì)EGFR信號(hào)的依賴性。因此，當(dāng)用白藜蘆醇和吉非替尼對(duì)肺癌細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合治療時(shí)，腫瘤細(xì)胞的PI3K/AKT受到顯著抑制，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤干細(xì)胞發(fā)生caspases的活化和凋亡的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，白藜蘆醇能顯著提高非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)吉非替尼的敏感性，增強(qiáng)吉非替尼的抗腫瘤活性。通過機(jī)制研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇通過抑制c-met的表達(dá)使肺癌細(xì)胞中的PI3K/AKT通路恢復(fù)對(duì)EGFR信號(hào)的依賴性。這些研究為吉非替尼等EGFR/TKIs的治療增效提供了新的策略和思路。

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（收稿：2016-12-12修回：2017-02-18）

Synergistic Effects between Resveratrol and Gefitinib on Lung Cancer

ZHANG Hongping,YUAN Mei.Clinical Laboratory,Jiaxing Hospital of Traditional Chinese Medicine,Jiaxing(314001),China

Objective To investigate the role of resveratrol in increasing the sensitivity of lung cancer cells to gefitinib and the underlying mechanisms.Methods MTT assay was performed to evaluate the viability of PC9 cells treated with resveratrol and low dose of gefitinib.Western blot was used to detect the expression of c-met, phosphorylation of EGFR,PI3K and AKT and activation of caspases on PC9 cells treated with resveratrol and low dose of gefitinib.Flow cytometry analysis was carried out to measure the apoptotic rate of PC9 cells treated with resveratrol and low-dose of gefitinib.Results Cell viability inhibitory rate of PC9 cells in low-dose gefitinib plus resveratrol was significantly higher than the low-dose gefitinib group and resveratrol group（57.7%±3.3%vs 12.4%± 1.1%,8.6%±0.8%,P＜0.05）.Treatment with resveratrol significantly downregulated the expression of c-met as well as enhancing the inhibition of PI3K and AKT phosphorylation induced by gefitinib.Cell viability inhibitory rate and apoptotic rate of PC9 cells in low-dose gefitinib plus resveratrol group was significantly higher than that in the low-dose gefitinib group and the low-dose gefitinib+resveratrol+c-met plasmid group（inhibitory rate:57.7%±3.3%vs 12.4%±1.1%,16.3%±1.3%;apoptotic rate:30.9%±1.8%vs 7.2%±0.5%,10.6%±0.8%;P＜0.05）.Activation of caspase-9 and caspase-3 in the low-dose gefitinib plus resveratrol group was more remarkable than that in the lowdose gefitinib group and the low-dose gefitinib+resveratrol+c-met plasmid group in PC9.Conclusion Resveratrol can increase the sensitivity of lung cancer cells to gefitinib by downregulating the expression of c-met.

non-small cell lung cancer cells;PC9 cells;resveratrol;c-met;PI3K/AKT;gefitinib

浙江省嘉興市中醫(yī)院檢驗(yàn)科（嘉興314001）

張紅萍，Tel：13732569210；E-mail：jxyuanhongping@163.com