白 晶 張立軍 展玉濤 郭 多 劉向祎*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院檢驗科， 北京 100073; 2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院肝膽外科， 北京 100073; 3.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100073; 4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，北京 100069)

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化學發(fā)光酶免疫法檢測血清GP73的臨床應用

白 晶1張立軍2展玉濤3郭 多4劉向祎1*

(1.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院檢驗科， 北京 100073; 2.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院肝膽外科， 北京 100073; 3.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院消化內(nèi)科， 北京 100073; 4.首都醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院人體解剖與組織胚胎學系，北京 100069)

目的 利用新研發(fā)的磁顆?；瘜W發(fā)光法(magnetism particulate chemiluminescence immunoassay， MP-CLIA)替代酶聯(lián)免疫法(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)、肝硬化、病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多種臨床樣本的血清高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GP73)濃度，進一步探討MP-CLIA檢測血清GP73的臨床應用價值。方法 采用建立的MP-CLIA法分別檢測健康對照者及各種病人血清GP73濃度，并進行分組比較分析。分別計算MP-CLIA和ELISA 2種方法檢測GP73診斷HCC的受試者工作特征(receiver operating characteristic， ROC)曲線下面積。測定50例肝硬化病人和69例HCC病人血清GP73和甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)濃度，比較GP73和AFP對HCC的臨床診斷效能。同時，對69例HCC病人進行分期比較GP73濃度，對其他良性肝病和其他腫瘤組分別與健康對照組比較分析血清GP73濃度。 結(jié)果 MP-CLIA與ELISA 兩種方法測定血清GP73在HCC診斷中的ROC曲線下面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。肝細胞癌組、肝硬化組和健康對照組的血清GP73濃度差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。肝細胞癌中T1期、T2期、T3期和T4期的血清GP73濃度分別為1.88 nmol/L，2.72 nmol/L，3.22 nmol/L和3.44 nmol/L，早期HCC組與肝硬化組和晚期HCC組比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。自身免疫性肝炎、脂肪肝、病毒性肝炎和HCC高危人群血清GP73濃度與健康對照組相比，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。其他腫瘤組的GP73濃度與對照組和HCC組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論 MP-CLIA法測定血清GP73結(jié)果可靠，GP73是一個HCC早期診斷的血清標志物。

高爾基蛋白73； 化學發(fā)光法； 肝細胞癌

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)是目前世界上致死率高的惡性腫瘤之一，也是我國最常見的惡性腫瘤之一。臨床上很難早期發(fā)現(xiàn)HCC，往往發(fā)現(xiàn)時就是晚期，已失去了最好的救治機會，因此臨床迫切需要一個HCC早期診斷指標。目前甲胎蛋白(alpha-fetoprotein，AFP)仍然是臨床上最常用的HCC篩查監(jiān)測血清標志物，其診斷HCC的敏感性比較低為39%～64%，這就要求臨床尋求更靈敏的早期HCC篩查標志物。高爾基體蛋白73(Golgi protein 73，GPB)是2000年發(fā)現(xiàn)的一種定位高爾基體的跨膜糖蛋白，又稱為Ⅱ型高爾基體膜蛋白。因其相對分子量為73 000，故稱為GP73。在正常情況下，GP73主要在膽管上皮細胞中表達，很少在肝細胞中表達。但在HCC病人血清中GP73濃度明顯升高[1]。近幾年，國內(nèi)外已廣泛開展GP73在HCC診斷方面的研究[2]。但其血清檢測方法僅限于酶聯(lián)免疫方法，缺乏特異靈敏線性范圍寬的自動化方法。筆者已在前期研究[3]中建立了靈敏、特異和檢測范圍寬的磁顆粒化學發(fā)光法(magnetism particulate chemiluminescence immunoassay，MP-CLIA)，在本研究中進一步探討MP-CLIA檢測GP73在HCC診斷和其他疾病中的臨床應用，從而揭示血清GP73作為HCC早期預警的臨床意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究選取121例2012年12月到2013年12月來北京同仁醫(yī)院體檢科的健康體檢人員作為健康對照組，平均年齡(44.4±9.1)歲，男性63例，女性58例。肝細胞癌(HCC)組，收集2012年5月至2014年7月HCC首次診斷住院病人69例，診斷符合2012版《原發(fā)性肝細胞癌的臨床診斷標準》[4]，平均年齡(53.9±5.8)歲，男性36例，女性33例，T1期7例，T2期16例，T3期 25例，T4期21例，早期HCC 25例(T1+ T2)，晚期46例(T3+T4)；肝硬化組(50例)，平均年齡(44.4±9.1)歲，男性63例，女性58例，診斷符合2012版《慢性乙型肝炎防治指南》[5]中肝硬化診斷標準，并排除有肝占位病變；病毒性肝炎組(85例)，平均年齡(49.1±9.1)歲，男性44例，女性41例，入組標準乙型肝炎(以下簡稱乙肝)病毒表面抗原陽性且乙型肝炎病毒肝E抗原陽性的病人，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase， ALT)高于正常值2倍，根據(jù)臨床、B 超、CT 等綜合檢查排除肝硬化和肝占位病變；脂肪性肝炎組(102例)：平均年齡(45.7±6.8)歲，男性59例，女性43例，臨床影像學診斷為脂肪肝中重度病人，并排除有肝占位病變、肝炎、肝硬化；自身免疫性肝炎組(30例)：平均年齡(40.5±7.1)歲，男性13例，女性17例，入組標準是自身抗體陽性血中抗核抗體和抗平滑肌抗體陽性，ALT高于正常值2倍，B超提示有肝、脾腫大，并根據(jù)臨床、B 超、CT 等綜合檢查排除有肝占位病變、肝炎、肝硬化；肝細胞癌高危人群組(50例)，平均年齡(55.8±5.6)歲，男性29例，女性21例，入組標準是單純乙肝表面抗原陽性，有肝細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌家族史的高危人群。B超顯示沒有肝硬化跡象；其他惡性腫瘤組(50例)：平均年齡(50.4±9.1)歲，男性26例，女性24例，病理診斷，并排除肝癌、肝炎、肝硬化、肝膽囊腫。

1.2 樣本收集

病人入院生物化學待檢清晨空腹靜脈血4 mL，離心分離血清后完成正常檢測項目的剩余血清，置于-80 ℃以下冰箱保存，待檢測GP73和AFP。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院倫理委員會批準。

1.3 MP-CLIA法測定血清GP73

在試管中加樣本15 μL，加入異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate isomer I，F(xiàn)ITC)FITC標記抗體45 μL，堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)標記抗體45 μL，混勻，37 ℃ 溫育16 min。加入抗FITC磁微粒試劑30 μL，混勻，37 ℃溫育10.5 min。放置磁板上分離后棄去上清。加入300 μL稀釋后的洗液進行清洗，重復清洗2次。棄上清液后放到半自動化學發(fā)光免疫分析儀上進行檢測。

1.4 ELISA法測定血清GP73

用加液器在微孔板每孔加入50 μL樣本稀釋液。分別在相應孔中加入校準品或待測樣本20 μL，輕輕振蕩混勻。用封板膜封板后置37 ℃溫育60 min。每孔中加入酶聯(lián)試劑100 μL，輕輕振蕩混勻。溫育：用封板膜封板后置37 ℃溫育30 min。用洗滌液充分洗滌5 次。每孔加入顯色液A、B液各50 μL，輕輕振蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。測定：每孔加終止液50 μL，混勻，設定酶標儀波長于450 nm 處，用空白孔調(diào)零點后測定各孔A值。使用log-log 線性擬和計算結(jié)果。采用化學發(fā)光免疫分析儀及試劑盒檢測AFP。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析。計量資料不符合正態(tài)分布，采用獨立樣本非參數(shù)檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗；診斷臨界值、敏感度和特異度采用ROC判定；敏感度、特異度比較采用r檢驗，曲線下面積比較采用Z檢驗。采用Spearman方法進行相關分析。多組比較采用Kruskal-WallisH檢驗，兩兩比較采用Mann-WhitneyU檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 健康對照組、病毒性肝炎組、肝硬化組和HCC組GP73血清濃度

血清GP73濃度在病毒性肝炎組、肝硬化組和HCC組依次升高，在健康對照組、肝炎組、肝硬化組和HCC組之間，血清 GP73 濃度均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖1)。

圖1 3組肝病與健康對照組之間血清GP73濃度比較

GP73:Golgi protein 73.

2.2 肝硬化組和HCC組血清GP73和AFP比較

在69例肝細胞癌病人血清中檢出GP73陽性例數(shù)為43例，陽性檢出率為62.3%：檢出AFP陽性例數(shù)為33例，陽性檢出率47.8%，GP73的陽性檢出率要高于AFP，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在50例肝硬化病人血清中檢出GP73陽性例數(shù)為14例，陽性檢出率為28.0%；檢出AFP陽性例數(shù)為6例，陽性檢出率為12.0%，GP73的陽性檢出率要明顯高于AFP，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。比較肝細胞癌組和肝硬化組GP73和AFP相關性，肝細胞癌組GP73和AFP呈明顯的正相關(P=0.037)，但肝硬化組GP73和AFP無明顯的相關(P>0.05)，詳見表1。

2.3 血清GP73診斷HCC的ROC分析

以健康對照組、病毒性肝炎組和脂肪肝組為對照，繪制用ELISA法和CLIA法測定血清GP73對HCC診斷的ROC曲線(圖2A)。從ROC曲線確定CLIA法測定GP73診斷HCC的臨界值為1.66 nmol/L，敏感度為75.2%，特異度為85.6%，曲線下面積為0.83。而ELISA 法測定GP73診斷HCC的臨界值1.80 nmol/L，敏感度為73.8%，特異度為83.6%，曲線下面積為0.820。2個方法測定GP73得到的曲線下面積差異有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

繪制GP73和AFP聯(lián)合檢測診斷HCC的ROC曲線，圖2B顯示敏感度為77.5%，特異度為95.1%，ROC曲線下面積為0.90，與GP73的ROC曲線下面積0.83比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.4 GP73與HCC分期的關系

HCCT1期、T2期、T3期和T4期的血清GP73濃度分別為1.88 nmol/L、 2.72 nmol/L、3.22 nmol/L和3.44 nmol/L，但各組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖3)。

表1 肝硬化組和HCC組血清GP73和AFP比較

圖2 ELISA和CLIA 2種方法檢測GP73并診斷HCC的ROC曲線分析

A: two methods for GP73 diagnosis of HCC with ROC; B:combined diagnosis of HCC with ROC by GP73 and AFP.ELISA：enzyme linked immunosorbent assay； CLIA：chemiluminescence immunoassay； GP73：Golgi protein 73； HCC：hepatocellular carcinoma； ROC：receiver operating characteristic； AFP：alpha-fetoprotein.

圖3 HCC組四期血清GP73變化

早期HCC(T1期和T2期)和晚期HCC(T3期和T4期)2組GP73濃度分別為2.14 nmol/L和3.33 nmol/L，發(fā)現(xiàn)晚期比早期HCC組GP73濃度顯著性提高(P<0.05)比對早期HCC和肝硬化的血清GP73水平，2者差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

2.5 血清GP73在其他肝臟疾病及其他癌癥組中的意義

脂肪性肝炎組、自身免疫性肝炎組、病毒性肝炎和肝細胞癌高危組血清GP73濃度均與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(圖4A)。測定AFP，結(jié)果顯示在HCC高危人群，血清GP73濃度與健康對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05圖4)，與病毒性肝炎組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。GP73在HCC高危人群組陽性率2%，而AFP沒有陽性。

其他腫瘤組與健康對照組之間血清GP73濃度比較，如圖4B所示，其他腫瘤的GP73濃度比較與對照組和HCC組均差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

3 討論

HCC是我國常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率及病死率高，主要的病因?qū)W是乙型肝炎病毒感染。早診、早治是改善其預后的關鍵。AFP是目前使用最廣泛的診斷HCC的血清標志物，但其敏感度約56.3%，作為早期HCC診斷的手段尚不理想。因此，尋找在肝硬化發(fā)展為HCC的早期階段新的血清腫瘤標志物具有重要社會和經(jīng)濟意義，可以更好地指導臨床治療，并提高病人的生存質(zhì)量，節(jié)省大量醫(yī)療資源。有研究[1]表明，GP73在HCC診斷方面的敏感度優(yōu)于AFP，有望成為新型血清HCC早期診斷標志物。

GP73是一個高爾基跨膜糖蛋白，在蛋白酶作用下發(fā)生水解反應，裂解其胞外結(jié)構(gòu)域，釋放到細胞外液中，從而為能夠在血清中檢測出GP73提供依據(jù)。2000年，Kladney等[6]首先闡述了GP73在正常情況下主要由膽管上皮細胞表達，而在肝細胞中表達很少甚至不表達。Marrero 等[7]對352例血清標本進行蛋白質(zhì)印跡技術分析，發(fā)現(xiàn)HCC病人血清 GP73濃度顯著高于肝硬化病人，早期發(fā)現(xiàn)HCC的敏感度明顯高于AFP，提示 GP73可能成為一種有潛在價值的 HCC 診斷標志物。

圖4 GP73在其他肝臟疾病及其他癌癥組中的比較

A: serum GP73 level in benign liver disease group; B: serum GP73 level in HCC and other cancers group;GP73:Golgi protein 73.

在本研究中，取代蛋白印跡這半定量的方法，用MP-CLIA檢測健康體檢者及HCC等許多臨床樣本血清GP73濃度。為了研究血清GP73在HCC的診斷價值，本研究比較了健康對照組與病毒性肝炎病人、肝硬化病人和HCC病人的血清GP73 濃度，它們依次呈上升趨勢，各組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HCC病人血清 GP73 濃度顯著高于前3組，與文獻[6]報道一致。研究初步表明血清GP73可能是一個血清學HCC診斷指標。推測在病毒性肝炎期，血清 GP73的升高可能是一種生理性或者自然狀態(tài)下的肝細胞受損后修復過程，而在肝硬化和HCC階段，血清GP73濃度升高可能代表的是一種病理性的肝細胞受損后修復過程。此外，本研究分別用ELISA法和MP-CLIA法測定各組血清GP73濃度，通過計算ROC曲線下面積等指標評價2種方法，結(jié)果顯示2種方法的曲線下面積差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，證明本研究前期研究建立的化學發(fā)光法臨床樣本-驗證成功。因為GP73診斷HCC的ROC曲線下面積為0.70～0.95，本方法測定的GP73對HCC的診斷效能是中等水平。結(jié)果與文獻[8-9]報道一致，表明MP-CLIA方法可靠，血清GP73可能作為診斷HCC的血清腫瘤標志物，能在臨床推廣使用。

AFP作為 HCC 篩查和診斷的經(jīng)典標志物，目前仍在臨床工作中被廣泛地應用。但是，臨床工作的難點就是不能有效鑒別AFP呈低濃度(AFP<2.90 nmol/L)的HCC病人和肝硬化病人，特別是影像學陰性而AFP呈低濃度的 HCC 病人，不能早期診斷會導致HCC較差的預后。本研究在36例AFP呈低濃度的肝細胞癌病人中GP73檢出陽性(GP73≥1.65 nmol/L)的病人有20例，占AFP低濃度肝細胞癌病人的44%。表明GP73對AFP低濃度的肝細胞癌病人有一定的診斷價值[10]，提示GP73對HCC早期診斷可能有很好的篩查價值。

本研究還發(fā)現(xiàn)，隨著HCC分期的提升，T1期、T2期、T3期 和T4期4期血清GP73濃度也逐步升高，但各組間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，這提示GP73可能是早期診斷標志物，這與國內(nèi)報道[11]一致。在分析血清GP73和良性肝臟疾病的關系中，我良性肝臟疾病組血清GP73濃度均與健康對照組相比有顯著性增高。研究[12-14]報道，血清GP73濃度與慢性肝炎病理分期有很強相關性。各良性肝病組血清 GP73 表達與ALT 有一定相關性，提示可能GP73 的表達、調(diào)節(jié)與肝臟細胞通透性損傷有關系。

本研究中也同時檢測GP73和AFP，結(jié)果顯示HCC高危人群組GP73濃度與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。GP73在HCC高危人群組陽性率2%，而AFP沒有陽性，從而一定程度上說明GP73對HCC早期預警可能有些意義，當然這需要擴大樣本，同時追蹤隨訪進行驗證。

理想的肝細胞癌血清標志物不僅需要有較高的敏感度，可以將早期HCC診斷出來，也需要有較高的特異度，可以將HCC與肝臟良性疾病(包括肝炎、肝硬化)相區(qū)分，同時還需與其他部位的腫瘤區(qū)別開。目前近年來的研究[15-17]發(fā)現(xiàn)，GP73不僅在HCC中高表達，在胃癌、前列腺癌、肺癌、腎癌等多種腫瘤組織中呈高表達狀態(tài)，在多種腫瘤的診斷中具有一定臨床價值。這在一定程度上消減了GP73對于HCC的診斷價值。本研究50例其他腫瘤的GP73濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其他腫瘤GP73濃度與健康對照組和肝細胞癌組差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，也說明GP73在肺癌、結(jié)直癌和胃癌也一定程度升高，與正常對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義。由于病例有限，結(jié)果應進一步擴大臨床樣本驗證。

總之，本研究利用MP-CLIA檢測血清GP73，發(fā)現(xiàn)GP73在HCC病人中濃度顯著升高，本方法測定的GP73對HCC的診斷效能是中等水平，是一個較好的肝細胞癌早期診斷標志物，期待大規(guī)模多中心的臨床驗證。

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編輯 慕 萌

Chemiluminescence immunoassay for Golgi protein 73 in human serum and its clinical application

Bai Jing1， Zhang Lijun2， Zhan Yutao3， Guo Duo4， Liu Xiangyi1*

(1.DepartmentofLaboratory，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity,Beijing100073，China; 2.DepartmentofHepatobiliarySurgery，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100073，China; 3.DepartmentofGastroenterology，BeijingTongrenHospital，CapitalMedicalUniversity，Beijing100073，China; 4.DepartmentofHumanAnatomyandHistoembryology，SchoolofBasicMedicalSciences，CapitalMedicalUniversity，Beijing100069，China)

Objective To detect serum Golgi protein 73(GP73) by chemiluminescence immunoassay(MP-CLIA) and further investigate its clinical applications with a variety of clinical samples including hepatocellular carcinoma (HCC)， liver cirrhosis and hepatitis. Methods In our study， the serum GP73 level was measured among healthy controls and patients groups by MP-CLIA. The MP-CLIA and ELISA method were evaluated in HCC diagnosis by means of calculating the area under the receiver operating characteristic (ROC). We also measured serum GP73 and alpha-fetoprotein (AFP) in 50 cirrhosis and 69 HCC patients and further compared the effectiveness GP73 and AFP of clinical diagnosis for HCC. We investigated the early diagnosis value of serum GP73 by comparing with different pathological stages of 69 HCC. We also compared the serum GP73 level of healthy controls with that of other benign liver diseases and other cancers. Results It was shown that there was no statistical difference (P>0.05) as to the ROC between the above two methods. It was also shown that the levels of serum GP73 were statistically significant among HCC group， liver cirrhosis group and control group (P<0.05). Serum GP73 level in T1， T2， T3， and T4 stage of HCC were 1.88nmol/L， 2.72nmol/L， 3.22nmol/L and 3.44 nmol/L， respectively. The concentration of serum GP73 in early stage of HCC was significantly different from advanced stage of HCC and liver cirrhosis (P<0.05). As a result， there were also statistical differences of serum GP73 between control group and autoimmune hepatitis， fatty liver， hepatitis， high-risk for HCC group as well as other cancer groups， respectively (P<0.05). Conclusion By clinical preliminary verification， GP73， whose level enhanced in the serum from HCC patients by MP-CLIA， is proved to be a sensitive serum marker in early diagnosis for HCC.

Golgi protein 73; chemiluminescence immunoassay; hepatocellular carcinoma

首都臨床特色項目(z141107006614007)， 首都醫(yī)科大學科研基金-校自然基金(2015ZR07)。This study was supported by Capital Characteristic Clinic Project(z141107006614007)，Research Fund of Capital Medical University-School Natural Foundation(2015ZR07).

時間：2017-07-16 17∶16 網(wǎng)絡出版地址：http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.3662.r.20170716.1716.010.html

10.3969/j.issn.1006-7795.2017.04.015]

R446.1

2016-11-02)

*Corresponding author， E-mail：13693328516@163.com