羅曉輝， 朱心怡， 陳曉青， 鄭曉梅，羅詩怡， 沈芷琦， 陳文榮

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

?

不同成熟期楊梅果實(shí)微生物的多樣性*

羅曉輝， 朱心怡， 陳曉青， 鄭曉梅，羅詩怡， 沈芷琦， 陳文榮

(浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院,浙江 金華 321004)

以不同發(fā)育期的楊梅果實(shí)(黑炭)為實(shí)驗(yàn)材料，測(cè)定了楊梅果實(shí)在成熟及劣變過程中有關(guān)果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)的變化規(guī)律；并利用變性梯度凝膠電泳分離菌群的技術(shù)，研究了楊梅果實(shí)從發(fā)育早期至成熟腐爛發(fā)霉期間微生物菌群的變化規(guī)律.結(jié)果顯示：楊梅果實(shí)軟化及劣變迅速；發(fā)育早期無可培養(yǎng)微生物侵染，當(dāng)果實(shí)發(fā)育至轉(zhuǎn)色期時(shí)才檢測(cè)到微生物菌群；通過基因序列測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，楊梅果實(shí)發(fā)育過程中存在18種優(yōu)勢(shì)菌，細(xì)菌6種、真菌12種，其中熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)、甲基桿菌屬(Methylobacterium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、出芽短梗霉菌(Aureobasidiumpullulans)和曲霉屬(Aspergillus)一直存在至果實(shí)成熟時(shí)期.研究發(fā)現(xiàn)，楊梅果實(shí)的腐爛發(fā)霉主要由伯克氏菌屬(Burkholderia)、魏斯氏菌(Weissellacibaria)、腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(Aspergillusniger)的快速繁殖引起.

楊梅；果實(shí)品質(zhì)；病原微生物；變性梯度凝膠電泳

楊梅(MyricarubraSieb. et Zucc.)是楊梅科楊梅屬常綠植物，為我國(guó)著名的特產(chǎn)水果果樹，也是我國(guó)南方地區(qū)良好的經(jīng)濟(jì)生態(tài)樹種[1].楊梅的栽培地主要分布在北緯18°～33°，即我國(guó)長(zhǎng)江流域以南地區(qū)，主要為浙江、江西和廣東等13個(gè)省，其中栽培面積、產(chǎn)量和品質(zhì)等均以浙江為最[2].楊梅除具有食用價(jià)值外，還具有園林觀賞價(jià)值及藥用價(jià)值[3].

楊梅果實(shí)的成熟集中在我國(guó)的初夏時(shí)節(jié)，此時(shí)氣候?yàn)楦邷囟酀?，且楊梅果為聚合果，果肉多漿，采后果實(shí)劣變快而不易保藏[4-6].隨著果實(shí)的成熟，楊梅果實(shí)的軟化為病原微生物的侵染提供了條件[7]，從而導(dǎo)致果實(shí)迅速腐爛，喪失其商品價(jià)值.因此，研究楊梅果實(shí)發(fā)育過程中微生物菌群多樣性的變化規(guī)律，可為研發(fā)合適的生物保鮮劑提供理論基礎(chǔ).

目前，研究報(bào)道楊梅果實(shí)病害主要由真菌引起，主要病原菌有桔青霉(PenicilliumcitrinumThom)、綠色木霉(TrichodermaviridePers. ex Fr.)、尖孢鐮刀菌(Fusariumoxysporum)等[8-9].針對(duì)病原菌侵染的狀況，常用鑒定微生物菌種的方法主要是形態(tài)學(xué)方法，但自然生長(zhǎng)條件下可培養(yǎng)的菌種僅占自然環(huán)境中總微生物的10%左右，微乎其微[10].近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，一些新的生物技術(shù)，如PCR技術(shù)、原位雜交、熒光定量和變性梯度凝膠電泳(denaturing gradient gel electrophoresis,DGGE)等，亦被用于微生物的鑒定.其中，DGGE技術(shù)能夠較準(zhǔn)確地反映出樣品中優(yōu)勢(shì)種群的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律[11].并且，隨著研究領(lǐng)域的不斷發(fā)展，Myers 等[12]大膽地對(duì)DGGE技術(shù)進(jìn)行了創(chuàng)新，加入“GC夾板”和異源微生物DNA，從而使DGGE技術(shù)得到了進(jìn)一步的完善.本實(shí)驗(yàn)采用DGGE技術(shù)分離鑒定了不同成熟期楊梅果實(shí)中的微生物菌群，并采用質(zhì)粒重組轉(zhuǎn)化、藍(lán)白斑篩選等技術(shù)手段，結(jié)合基因序列測(cè)定和序列比對(duì)，以達(dá)到菌種的鑒定，旨在為進(jìn)一步研究楊梅果實(shí)病害及其生物防治提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

楊梅(M.rubraSieb. et Zucc.黑炭)分別于2014-06和2015-06中旬開始，在浙江省蘭溪市同一個(gè)果園中的同一棵樹上摘取不同發(fā)育時(shí)期和腐爛期的楊梅果實(shí)作為實(shí)驗(yàn)材料(見圖1),其中A，B，C，D和E分別表示發(fā)育期、轉(zhuǎn)色前期、轉(zhuǎn)色后期、成熟期和腐爛期的楊梅果實(shí).

圖1 不同發(fā)育時(shí)期的楊梅

1.2 果實(shí)品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

1.2.1 硬度

用硬度計(jì)(GY-3型)測(cè)定果實(shí)的硬度，每個(gè)果實(shí)在赤道兩端各測(cè)一次，每個(gè)階段隨機(jī)選取10個(gè)果實(shí)，求平均值.

1.2.2 可溶性固形物和可滴定酸含量

每個(gè)階段取50 g果實(shí)榨汁后過濾，果汁用來測(cè)定可溶性固形物和可滴定酸的含量.用毛細(xì)滴管吸取楊梅汁液，滴入可溶性固形物測(cè)定儀中，讀數(shù)并記錄.可滴定酸含量測(cè)定采用酸堿滴定法，用0.1 mol/L氫氧化鈉溶液滴定25 mL果汁，結(jié)果以檸檬酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)表示.

1.2.3 花青素含量

采用pH示差法[13]測(cè)定.

1.3 楊梅果肉中微生物的提取及鑒定

1.3.1 微生物DNA的提取及測(cè)定

取各階段的楊梅果實(shí)5顆放入無菌聚乙烯(PE)袋中，加入30 mL 1×PBS滅菌緩沖液，放置旋轉(zhuǎn)儀中低速旋轉(zhuǎn)1.25 h，轉(zhuǎn)移上清液至50 mL滅菌離心管中靜置0.5 h，轉(zhuǎn)移上清液至2 mL離心管中，13 000 r/min離心，去上清，留沉淀.

取上述沉淀0.25 g，通過MO試劑公司的PowerFoodTMMicrobial DNA Isolation Kit試劑盒提取微生物DNA.將提取所得楊梅果實(shí)中微生物的總DNA進(jìn)行濃度測(cè)定，測(cè)定時(shí)取1 μL樣液進(jìn)行測(cè)定，剩余部分放置在-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?

1.3.2 總DNA的PCR擴(kuò)增

本實(shí)驗(yàn)為得到足夠量的楊梅果實(shí)中微生物菌群的有效DNA，采用2次重復(fù)PCR擴(kuò)增的方法對(duì)提取所得總DNA進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增目的DNA為細(xì)菌16S及真菌ITS的部分核糖體核苷酸序列.

細(xì)菌所用引物為534：5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′和341-GC：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′.PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物534 0.5 μL，引物341-GC 0.5 μL，Ex Tag酶0.125 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足.PCR反應(yīng)程序采用降落PCR，條件為：94 ℃ 4 min，20×(94 ℃ 1 min，65 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min),每個(gè)循環(huán)降溫0.5 ℃，5×(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

真菌所用引物為28S1r：5′-TATGCTTAAGTTCAGCGGGTA-3′和5.8Sf-GC：5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGGTGAATCATCGATTCTTTGAAC-3′.PCR反應(yīng)體系為25 μL：10×buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，引物28S1r 0.5 μL，引物5.8Sf-GC 0.5 μL，Ex Tag酶0.125 μL，DNA模板2 μL，ddH2O補(bǔ)足.PCR反應(yīng)程序采用降落PCR，條件為：94 ℃ 4 min，20×(94 ℃ 1 min，60 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min)每個(gè)循環(huán)降溫0.5 ℃，5×(94 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min)，72 ℃ 10 min，10 ℃保存.

1.3.3 電泳

取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物各5 μL，2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.3.4 二次PCR

以第一次PCR產(chǎn)物為模板，反應(yīng)體系為50 μL，即第一次體系的2倍.

細(xì)菌PCR反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 4 min，4×(94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min)每個(gè)循環(huán)降溫0.5 ℃,72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

真菌PCR反應(yīng)體系為95 ℃ 4 min，4×(95 ℃ 1 min，50 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min)每個(gè)循環(huán)降溫0.5 ℃，72 ℃ 10 min，16 ℃保存.

1.4 變性梯度凝膠電泳分析

經(jīng)大量的預(yù)實(shí)驗(yàn)不斷地調(diào)整變性梯度凝膠電泳的濃度范圍，最終，細(xì)菌16S V3 DGGE選用35%～70%的梯度，而真菌ITS DGGE選用40%～65%的梯度，作為正式實(shí)驗(yàn)的濃度梯度.二次PCR產(chǎn)物15 μL和上樣緩沖液(3×)7.5 μL，加樣前混合.電泳條件：50 V，14 h，電泳液溫度為60 ℃，染色20 min.

1.5 DGGE條帶的序列分析

在紫外線照射下，將電泳條帶回收用蒸餾水浸沒，水浴1 h后用不帶GC夾的引物(細(xì)菌：534和341；真菌：5.8Sf和28S1r)進(jìn)行降落PCR擴(kuò)增，將PCR產(chǎn)物純化后與PMD-18-T載體連接，克隆成功后送上海生工生物工程股份有限公司測(cè)序.

2 結(jié)果與分析

2.1 各時(shí)期楊梅果實(shí)的硬度及可溶性固形物、可滴定酸和花青素的含量變化

果實(shí)硬度及可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)的含量是衡量楊梅果實(shí)品質(zhì)的重要標(biāo)準(zhǔn).從圖2可知：楊梅在成熟過程中果實(shí)硬度呈逐漸降低的趨勢(shì)(見圖2中(a))；而可滴定酸含量雖然也呈下降趨勢(shì)，但在成熟期前已經(jīng)降到最低點(diǎn)(見圖2中(b))；花青素含量隨果實(shí)發(fā)育和成熟進(jìn)程而迅速增加，并在成熟后有一上升過程，之后隨著品質(zhì)劣變而顯著下降(見圖2中(c))；可溶性固形物含量亦隨著果實(shí)成熟進(jìn)程而不斷增加，并在果實(shí)成熟后保持較高的含量(見圖2中(d)).根據(jù)以上分析可以得知，楊梅果實(shí)在成熟期時(shí)果實(shí)品質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)成分都達(dá)到最佳，隨后進(jìn)入腐爛期時(shí)開始降低.

不同小寫字母表示0.05水平上差異顯著圖2 不同發(fā)育期楊梅果實(shí)的硬度及可溶性固形物、可滴定酸和花青素含量的變化

2.2 基因組DNA的提取及PCR擴(kuò)增

取上述各階段楊梅微生物基因組DNA進(jìn)行濃度稀釋至15 ng/μL，分別進(jìn)行16S V3 降落PCR和 ITS降落PCR擴(kuò)增.取PCR產(chǎn)物5 μL進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)果如圖3所示：擴(kuò)增產(chǎn)物與目的片段的長(zhǎng)度相似，細(xì)菌在230 bp左右，真菌在300 bp左右.各時(shí)期條帶亮度有差異，且真菌出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，這可能是由于樣品DNA濃度較低、PCR反應(yīng)特異性較差導(dǎo)致的，但不影響變性梯度凝膠電泳的進(jìn)一步操作.

2.3 變性梯度凝膠電泳與分析

16S V3和ITS變性梯度凝膠電泳結(jié)果見圖4.

2015Y與2014Y分別表示2015年和2014年的樣品；圖中1—15表示割膠回收條帶圖4 變性梯度凝膠電泳圖

DGGE電泳后割膠條帶進(jìn)行測(cè)序比對(duì)，并用BLAST在GenBank中搜索相近序列，經(jīng)序列比對(duì)后楊梅微生物菌群如表1和表2所示.

2015Y與2014Y分別表示2015年和2014年的樣品圖3 降落PCR電泳圖

條帶編號(hào)菌種相似度/%序列號(hào)閾值1Pseudomonasfluorescens熒光假單胞菌99KC920987.13552Methylobacteriumradiotolerans甲基桿菌98KC902793.12893Burkholderia伯克氏菌屬98JF958162.13354Prinsepia扁桃木屬100KC571835.13155Rhizobialesbacterium根瘤菌目菌100JQ617869.13116Weissellacibaria魏斯氏菌100KF023199.13117P.fluorescens熒光假單胞菌100KC920987.1357

表2 ITS PCR-DGGE后割膠條帶的分析結(jié)果

由表1和表2可知，楊梅果實(shí)在其生長(zhǎng)發(fā)育初期至成熟腐爛發(fā)霉過程中，其優(yōu)勢(shì)菌總共有18種，其中細(xì)菌6種，真菌12種.根據(jù)圖4(a)可知,楊梅果實(shí)在發(fā)育至轉(zhuǎn)色前期(B)時(shí)出現(xiàn)了4種細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群，分別為熒光假單胞菌(P.fluorescens)、甲基桿菌(M.radiotolerans)、根瘤菌目菌(R.bacterium)和扁桃木屬(Prinsepia)，并且在果實(shí)發(fā)育至成熟的過程中菌群種類變化不明顯.然而，當(dāng)果實(shí)發(fā)育至腐爛發(fā)霉時(shí)，楊梅果實(shí)的菌群發(fā)生了明顯的變化，如：熒光假單胞菌(P.fluorescens)幾乎消失；伯克氏菌屬(Burkholderia)和魏斯氏菌(W.cibaria)則明顯增強(qiáng).

同時(shí)，在果實(shí)發(fā)育過程中，楊梅果實(shí)的真菌菌群也有類似的結(jié)果.由表2可知，楊梅果實(shí)發(fā)育至轉(zhuǎn)色期時(shí)出現(xiàn)了10種優(yōu)勢(shì)真菌菌種，分別為擲孢酵母屬(Sporobolomyces)、梗孢屬(Dissoconium)、出芽短梗霉菌(A.pullulans)、灰葡萄孢霉(B.fuckeliana)、青霉屬(Penicillium)、煙草赤星病菌(A.alternate)、黑附球菌(E.nigrum)和曲霉屬(Aspergillus).由圖4(b)可以明顯地看出，當(dāng)果實(shí)發(fā)育至腐爛發(fā)霉時(shí)，楊梅果實(shí)中的真菌種類及其數(shù)量發(fā)生了明顯的變化，如：早期的擲孢酵母屬和梗孢屬菌群弱化；而腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(Aspergillusniger)則增強(qiáng).實(shí)驗(yàn)中基因測(cè)序比對(duì)結(jié)果的相似度均在98%以上，說明結(jié)果比較可靠.

綜合以上結(jié)果：楊梅果實(shí)在果實(shí)發(fā)育早期無優(yōu)勢(shì)菌群出現(xiàn)，直至轉(zhuǎn)色期時(shí)才出現(xiàn)優(yōu)勢(shì)菌群，且這些優(yōu)勢(shì)菌一直伴隨著楊梅果實(shí)發(fā)育至完全成熟的階段；而在果實(shí)發(fā)育至腐爛發(fā)霉的過程中，楊梅果實(shí)中的微生物菌群發(fā)生了較大的變化，主要是前期的部分菌群弱化，如擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，而加速果實(shí)腐爛的菌群加強(qiáng)，如腐皮殼屬(Diaporthe)和黑曲霉(A.niger)，加速了楊梅果實(shí)的腐爛變質(zhì).

3 討 論

隨著微生物研究領(lǐng)域的不斷延伸，內(nèi)生菌的分離培養(yǎng)越來越得到研究者的關(guān)注.石晶盈等[14]采用平板培養(yǎng)法成功地篩選培養(yǎng)出番木瓜的內(nèi)生菌群，并利用分離菌成功地抑制了木瓜炭疽病的發(fā)生.自Fischer首次提出利用變性梯度凝膠電泳分離微生物菌群以來，DGGE技術(shù)廣泛應(yīng)用于環(huán)境土壤微生物的分離鑒定，如王君等[15]對(duì)高溫功能微生物的分離、農(nóng)田土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的鑒定等，而利用DGGE分離楊梅果實(shí)內(nèi)生菌尚未見相關(guān)報(bào)道.

根據(jù)PCR-DGGE圖譜可知，不同階段的條帶分布相似，但粗細(xì)及亮度有所差異，表明楊梅果實(shí)各發(fā)育期菌群結(jié)構(gòu)相似，但數(shù)量略有不同.條帶粗亮說明該菌群數(shù)量多，為優(yōu)勢(shì)菌群.DGGE技術(shù)與傳統(tǒng)的瓊脂糖凝膠電泳分離菌群的方法相比，變性梯度凝膠電泳能夠很好地把不同分子量的DNA電泳分離，可精確至一個(gè)堿基的變化；同時(shí)，通過DGGE割膠回收電泳后的條帶，回收率高，對(duì)DNA的損傷小.這為提取果肉中微量的微生物DNA提供了有力的技術(shù)手段.由16S V3 DGGE和ITS DGGE圖可以得出，楊梅果實(shí)在其生長(zhǎng)發(fā)育早期果實(shí)內(nèi)部及其表面無附著菌落，可能是：由于果實(shí)生長(zhǎng)分裂早期細(xì)胞代謝旺盛，抵抗外界菌群侵染的能力強(qiáng)，使菌群無法在其上生長(zhǎng)；同時(shí)，早期果實(shí)的生長(zhǎng)主要以4月為主，楊梅果實(shí)的生長(zhǎng)環(huán)境相對(duì)于6月的高溫高濕季節(jié)，環(huán)境中的微生物代謝緩慢，不易入侵至楊梅幼果，最終使楊梅果實(shí)在早期發(fā)育過程中無有害菌附著.

目前，楊梅的微生物種群研究相對(duì)較少.戚行江等[16]采用培養(yǎng)基培養(yǎng)成功地分離出了20種真菌，其中主要的致病菌有酵母類、青霉菌、芽枝霉、曲霉菌和鐮孢霉.文獻(xiàn)[17]對(duì)云南楊梅的微生物研究報(bào)道了6類新的微生物種類：微紫青霉(Penicilliumjanthinellum)、托姆青霉(P．thomii)、灰葡萄孢(Botrytiscinema)、尖鐮孢(Fusariumoxysporium)、鏈格孢(Alternariaalternata)和立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani).上述結(jié)果與本研究結(jié)果相比，楊梅果實(shí)腐敗變質(zhì)的菌種有部分相同，如酵母類、曲霉等.然而，本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)了新的菌種，如伯克氏菌屬(Burkholderia)、魏斯氏菌(W.cibaria).這很可能與楊梅的生長(zhǎng)環(huán)境有關(guān).楊梅果實(shí)上的微生物由外界的寄生菌及其自身內(nèi)部的菌種共同組成，因此，針對(duì)不同地區(qū)的楊梅果實(shí)采取不同的保鮮劑防范措施是十分必要的.

[1]周延鋒.楊梅的開發(fā)利用及發(fā)展對(duì)策[J].福建輕紡,2007(6):1-6.

[2]陳亦輝,肖功年.楊梅加工技術(shù)及其產(chǎn)業(yè)發(fā)展分析[J].農(nóng)產(chǎn)品加工,2007(9):71-73.

[3]何新華,陳力耕,陳怡,等.中國(guó)楊梅資源及利用研究評(píng)述[J].果樹學(xué)報(bào),2004(5):467-471.

[4]張望舒,鄭金土,汪國(guó),等.不同成熟度楊梅果實(shí)采后呼吸速率,乙烯釋放速率和品質(zhì)的變化[J].植物生理與分子生物學(xué)學(xué)報(bào),2005,31(4):417-424.

[5]Cantu D,Vicente A R,Greve L C,et al.The intersection between cell wall disassembly,ripening,and fruit susceptibility toBotrytiscinerea[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,2008,105(3):859-864.

[6]鞏衛(wèi)琪,房祥軍,郜海燕,等.楊梅采后病害與控制技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物技術(shù)進(jìn)展,2013(6):403-407.

[7]Luo Zisheng,Xu Tingqiao,Xie Jing,et al.Effect of hot air treatment on quality and ripening of Chinese bayberry fruit[J].Journal of the Science of Food and Agriculture,2009,89(3):443-448.

[8]戚行江,王連平,梁森苗,等.楊梅氣調(diào)貯藏保鮮后果實(shí)真菌區(qū)系研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,15(1):28-30.

[9]汪開拓.熱空氣與天然揮發(fā)性物質(zhì)對(duì)楊梅果實(shí)綠霉病的抑制作用及其機(jī)理研究[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2010.

[10]郭斌,吳曉磊,錢易.提高微生物可培養(yǎng)性的方法和措施[J].微生物學(xué)報(bào),2006(3):508-511.

[11]Muyzer G,de Waal E C,Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA[J].Applied and Environmental Microbiology,1993,59(3):695-700.

[12]Myers R M,Sheffield V C,Lerman L S,et al.Attachment of a 40-base-pair G+C-rich sequence (GC-clamp) to genomic DNA fragments by the polymerase chain reaction results in improved detection of single-base changes[J].Proceedings of the National Academy of Sciences,1989,86(1):232-236.

[13]Salvador A,Fiszman S M.Textural and sensory characteristics of whole and skimmed flavored set-type yogurt during long storage[J].Journal of Dairy Science,2004,87(12):4033-4041.

[14]石晶盈,劉愛媛,李雪萍,等.番木瓜果實(shí)內(nèi)生細(xì)菌MGP3菌株的鑒定及拮抗作用[J].微生物學(xué)報(bào),2011,51(9):1240-1247.

[15]王君,馬挺,劉靜,等.利用PCR-DGGE技術(shù)指導(dǎo)高溫油藏中功能微生物的分離[J].環(huán)境科學(xué),2008,29(2):462-468.

[16]戚行江,梁森苗,周利秋,等.微容氣調(diào)環(huán)境對(duì)楊梅的保鮮效果研究[J].浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào),2003,15(4):237-240.

[17]張宏,桂明英,張?zhí)?等.云南楊梅貯藏期真菌病害研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2007(4):503-506.

(責(zé)任編輯 薛 榮)

The microbial diversity in different maturity stages of Chinese bayberry

LUO Xiaohui, ZHU Xinyi, CHEN Xiaoqing, ZHENG Xiaomei,LUO Shiyi, SHEN Zhiqi, CHEN Wenrong

(CollegeofChemistryandLifeSciences,ZhejiangNormalUniversity,Jinhua321004,China)

The Chinese bayberry sampled at different ripening and deterioration stages were subjected to the assay of fruit quality related indicators. Meanwhile, the Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) technology was applied to separate and identify microbial DNA in the fruits. The results showed that the fruit softened and deteriorated quickly. In the early stages of fruit development, no cultivable bacteria infection was observed. The cultivable microbe emerged in turn color period, and a total of 18 dominant microbe was detected during the whole fruit ripening process, which included 6 bacteria species and 12 fungi species. Among them,Pseudomonasfluorescens,Methylobacteriumradiotolerans,Sporobolomyces,AureobasidiumpullulansandAspergillusexisted ever since early stage to mature period. Meanwhile, the results also showed the dominant bacteria resulted in bayberry fruit rotting wereBurkholderia,Weissellacibaria,DiaportheandAspergillusniger, and their rapid propagations led to fruits decay.

Chinese bayberry; fruit quality; pathogenic microorganisms; DGGE

10.16218/j.issn.1001-5051.2017.01.013

2016-03-28；

2016-05-20

浙江省科技計(jì)劃公益技術(shù)研究項(xiàng)目(2013C32074)；浙江省重大科技專項(xiàng)(2013C02004)

羅曉輝(1990-),男,安徽合肥人,碩士研究生.研究方向：生物化學(xué)與分子生物學(xué).

陳文榮.E-mail： cwr@zjnu.cn

S667.6

A

1001-5051(2017)01-0085-06