唐 豪白雅琴陳伯祥陳冬梅楊 明郭慧琳袁 勇

(1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.甘肅省畜牧產(chǎn)業(yè)管理局,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;4.甘肅省農(nóng)牧廳機(jī)關(guān)后勤服務(wù)中心,甘肅蘭州 730000)

山羊痘病毒P32基因的克隆與序列分析

唐 豪1白雅琴2*陳伯祥3陳冬梅4楊 明3郭慧琳1袁 勇2

(1.甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心,甘肅蘭州 730046;2.甘肅省畜牧產(chǎn)業(yè)管理局,甘肅蘭州 730000;3.甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所,甘肅平?jīng)?744000;4.甘肅省農(nóng)牧廳機(jī)關(guān)后勤服務(wù)中心,甘肅蘭州 730000)

山羊痘是由山羊痘病毒（Goat pox virus，GTPV）引起的一種急性、熱性、接觸性傳染病，病羊以發(fā)熱、全身起痘、呼吸道和消化道損傷以及淋巴結(jié)腫大為特征。該病的暴發(fā)和流行不僅對(duì)當(dāng)?shù)仞B(yǎng)羊業(yè)和農(nóng)村經(jīng)濟(jì)造成巨大的損失，還可嚴(yán)重影響國際貿(mào)易，因此被OIE列為必須報(bào)告的疫病，也列為我國動(dòng)物疫病一類。近年隨著山羊痘疫情在世界各地尤其東亞地區(qū)的暴發(fā)流行，國內(nèi)外學(xué)者加大了對(duì)山羊痘病毒編碼蛋白的研究力度，以期研制出更為敏感特異的新型診斷試劑和安全高效的新型疫苗。

山羊痘基因組大小為143～147 kb，P32基因位于GTPV基因組的64～65kb處。P32具有抗原特異性，P32是含有一個(gè)抗原決定簇，由319～324個(gè)氨基酸組成的囊膜蛋白，羧基端有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，對(duì)細(xì)胞有毒害作用。山羊痘病毒P32的結(jié)構(gòu)蛋白，具有免疫原性，免疫羊等動(dòng)物后可產(chǎn)生具有保護(hù)性的抗體。目前，我國缺乏高效準(zhǔn)確的山羊痘病毒的檢測方法或試劑盒，使該病難以控制。為此，我們開展了山羊痘病毒P32基因的克隆與序列分析，為下一步建立敏感、快速、準(zhǔn)確簡單易行的GTPV檢測方法和P32蛋白的后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 毒株

山羊痘毒株（GTPV-Shan-1）由甘肅省畜牧獸醫(yī)研究所保存，并在原代綿羊睪丸細(xì)胞中培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑與載體

T4 DNA連接酶、PCR試劑、TaKaPa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0試劑盒、pMD18 - T載體購自寶生生物工程（大連）有限公司，SE.DNA kit（OMEGA bio-tek）購自O(shè)MEGA 公司；大腸桿菌DH5α菌種購自Solarbio。

1.2 方法

1.2.1 P32基因的PCR擴(kuò)增

根據(jù)Genbank中收錄的GTPV基因序列，遵循引物設(shè)計(jì)原則，應(yīng)用在線軟件分析P32，設(shè)計(jì)一對(duì)引物用于擴(kuò)增P32基因，上游引物P1 5’-AACTAATTATCAAAAATGGCAG-3’；下游引物P2：5’-TGGATGGGATACATAGTAAGAA-3’，預(yù)期擴(kuò)增目的片段大小846bp。引物由寶生生物工程（大連）有限公司合成。

取200μl病毒細(xì)胞培養(yǎng)物，用病毒DNA提取試劑盒提取病毒基因組DNA，然后取5μl病毒基因組DNA為模板，加入4μl dNTP混合物，5μl 10×PCR buffer、上下游引物各1μl、0.25μl EX Taq酶，最后補(bǔ)水至50μl。PCR反應(yīng)條件：94℃5min；94℃50s；55℃50s，72℃60s，35個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10min，4℃終止反應(yīng)。PCR產(chǎn)物在10g/L的瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測。

1.2.2 連接及轉(zhuǎn)化

按照TaKaPa DNA Fragment Purification Kit Ver.2.0的說明書操作，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化，與pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。在涂有氨芐西林的LB瓊脂平板上，挑選單個(gè)菌落接入含氨芐西林的LB培養(yǎng)液中，提取質(zhì)粒DNA樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增檢測后將重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序。

1.2.3 序列分析

應(yīng)用DNAStar、BLAST（NCB I）軟件與GenBank登錄的相應(yīng)序列進(jìn)行比較，分析不同來源山羊痘病毒株P(guān)32 基因核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列的同源性。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增及初步鑒定

采用P1 /P2引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從山羊痘病毒感染細(xì)胞培養(yǎng)物的核酸樣本中擴(kuò)增出1 條約846 bp大小的DNA帶，而正常細(xì)胞顯現(xiàn)陰性反應(yīng)，與預(yù)期大小相符合（圖1）。

表1 P32基因核苷酸序列的同源性比對(duì)

圖1 P32基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析

圖3.2 P32重組質(zhì)粒擴(kuò)增鑒定

2.2 PCR產(chǎn)物克隆與重組質(zhì)粒鑒定

從瓊脂糖凝膠中回收PCR產(chǎn)物，與pMD18-T載體相連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α。挑選抗Amp+菌落進(jìn)行搖振培養(yǎng)，提取質(zhì)粒DNA樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖電泳，得到兩條帶，與預(yù)期結(jié)果一致。

2.3 P32基因核苷酸序列測定及同源性分析

將鑒定的重組質(zhì)粒送大連寶生物工程有限公司測序，山羊痘病毒（GTPV-Shan-1）的P32基因?yàn)?032bp。將此P32基因核苷酸序列及推導(dǎo)的氨基酸序列與國內(nèi)外不同來源山羊痘病毒株的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建了系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果見表1和圖1。

圖1 P32基因序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

結(jié)果表明，山羊痘病毒株S-1株的P32 基因序列與山羊痘毒FZ株和G20-LKV株核苷酸序列的同源性分別達(dá)到99.3%和99.2%。與國內(nèi)外不同來源的山羊痘病毒分離株相比較，P32基因核苷酸序列的同源性達(dá)到97.8%以上。同源性分析結(jié)果表明，山羊痘病毒的P32基因具有高度保守性。

3 討論與分析

2002年，Tulman等對(duì)山羊痘病毒的全基因組序列測定工作完成，P32 基因定位于病毒基因組的64～65 kb處，全長969個(gè)核苷酸，編碼323個(gè)氨基酸；羊痘病毒的P32 基因具有高度保守性，世界各地不同分離株的P32 基因核苷酸序列同源性達(dá)到97%。

本試驗(yàn)對(duì)山羊痘shan-1株進(jìn)行PCR擴(kuò)增、連接、轉(zhuǎn)化并測序，其核苷酸序列與國內(nèi)分離病毒FZ 株和G20-LKV株的P32基因的同源性達(dá)到99.2%以上，與印度、哈薩克斯坦分離株的同源性達(dá)到97.8%～99.1%，顯示了山羊痘病毒P32基因的高度保守性。從P32基因的核苷酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，山羊痘S-1株與這為進(jìn)一步研究山羊痘病毒P32基因表達(dá)產(chǎn)物免疫學(xué)活性、結(jié)構(gòu)與功能奠定了良好的工作基礎(chǔ)。

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甘肅省科技支撐計(jì)劃－農(nóng)業(yè)類，項(xiàng)目編號(hào)：1104NKCL097

唐豪（1983-），男，大學(xué)學(xué)歷，助理獸醫(yī)師，主要從事動(dòng)物疫病的防控技術(shù)的研究與推廣工作。

白雅琴（1969-），女，大學(xué)學(xué)歷，高級(jí)畜牧師，主要從事家畜的改良與新品種的推廣工作。