許 潔,周長朋，鄭文鳳，王春玲

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心，山東 威海 264205)

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高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀測定鹽酸黃酮哌酯中的1-(2-羥乙基)哌啶殘留

許 潔*,周長朋，鄭文鳳，王春玲

(迪沙藥業(yè)集團(tuán)國家認(rèn)定企業(yè)技術(shù)中心，山東 威海 264205)

建立了鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶的高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)定量分析方法。鹽酸黃酮哌酯藥物用0.1%甲酸溶解后，經(jīng)Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)色譜柱分離，以乙腈-0.1%甲酸水作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，采用電噴霧正離子掃描方式，以選擇反應(yīng)監(jiān)測(SRM)模式進(jìn)行檢測。結(jié)果表明，1-(2-羥乙基)哌啶在10～100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，加標(biāo)回收率為98.9%～106.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均不大于3.0%，方法檢出限(S/N=3)為6.0 mg/L，方法定量下限(S/N=10)為20 mg/L。該方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，適用于鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的測定。

高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜儀；鹽酸黃酮哌酯；1-(2-羥乙基)哌啶

鹽酸黃酮哌酯(Flavoxate hydrochloride，F(xiàn)X)，化學(xué)名3-甲基黃酮-8-羧酸-2-哌啶乙酯鹽酸鹽(合成路線見圖1)，是一種平滑肌松弛藥，具有選擇性解除泌尿生殖系統(tǒng)平滑肌痙攣的作用，對(duì)尿頻、尿急、尿痛以及尿失禁癥狀均有明顯的改善作用，臨床上常用于治療下尿路感染、梗阻性疾病以及尿道綜合征[1-3]。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS)具有選擇性強(qiáng)、靈敏度高、定量準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，近年來已被廣泛應(yīng)用于藥品中的雜質(zhì)研究，其中四極桿/線性離子阱(QTRAP)質(zhì)譜屬于混合型串聯(lián)質(zhì)譜，除具有三重四極桿的傳統(tǒng)定量功能外，還可進(jìn)行多級(jí)子離子掃描，提供化合物結(jié)構(gòu)信息[10-13]。因此，本文基于高效液相色譜-四極桿/線性離子阱質(zhì)譜(HPLC-QTRAP-MS/MS)技術(shù)，建立了測定鹽酸黃酮哌酯藥物中1-(2-羥乙基)哌啶的分析方法。該方法操作簡單、靈敏度高、回收率好，填補(bǔ)了國內(nèi)鹽酸黃酮哌酯藥物中1-(2-羥乙基)哌啶定量檢測研究的空白，為鹽酸黃酮哌酯藥物的質(zhì)量控制及安全性評(píng)價(jià)提供了可靠的檢測方法。

圖1 鹽酸黃酮哌酯的合成路線圖Fig.1 Graphical synthetic route of flavoxate hydrochloride

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Thermo LTQ-XL型高效液相色譜-四極桿/離子阱質(zhì)譜儀(美國Thermo公司)；BT-25S型電子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；Milli-Q超純水儀(美國Millipore公司)；超聲清洗器(昆山超聲儀器公司)；0.22 μm有機(jī)系濾膜(天津津騰實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

1-(2-羥乙基)哌啶(純度≥99%，上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；甲酸(色譜級(jí)，美國Sigma公司)；乙腈(色譜級(jí)，德國Merck公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水(電阻率為18.25 MΩ·cm)；鹽酸黃酮哌酯精品(迪沙藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。

1.2 溶液的配制

對(duì)照品溶液：取1-(2-羥乙基)哌啶適量，精密稱定，用水溶解并定容，配制成1.0 mg/mL濃度的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃避光保存。取適量標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水配制成10.0 mg/L濃度的標(biāo)準(zhǔn)中間液，作為對(duì)照品溶液，4 ℃避光保存。上機(jī)前用0.1%甲酸水稀釋成適當(dāng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

供試品溶液：取鹽酸黃酮哌酯精品適量，精密稱定，置于100 mL容量瓶中，加0.1%甲酸水超聲溶解并定容，配制成0.1 mg/mL濃度的供試品溶液，過0.22 μm濾膜，待測。

1.3 色譜條件

(2)LVQ神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)比BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)在進(jìn)行地下水源熱泵系統(tǒng)EER等級(jí)劃分的預(yù)測中速度更快，且穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性更高。

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)；流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液(A)和乙腈(B)。采用梯度洗脫模式：0～3.00 min，5%B；3.00～5.00 min，5%～95% B；5.00～8.00 min，95% B；8.01～20.00 min，5% B。流速：0.2 mL/min，柱溫：25 ℃；進(jìn)樣體積：10 μL。

1.4 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源(ESI)；正離子檢測模式；掃描方式：選擇反應(yīng)掃描(SRM)模式；離子源溫度：320 ℃；輔助氣溫度：300 ℃；鞘氣：35 psi；輔助氣：15 psi；毛細(xì)管電壓：3 500 V；定量方式：外標(biāo)法定量；定量離子對(duì)：130.0→111.9；碰撞能量(CE)：40 V。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

1-(2-羥乙基)哌啶屬于極性分子，對(duì)其采用ESI離子源比APCI離子源的離子化效率更高，且1-(2-羥乙基)哌啶在水中顯堿性，因此采用電噴霧正離子模式(ESI+)進(jìn)行檢測。將1-(2-羥乙基)哌啶配制成1.0 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液，先進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜全掃描，確定其準(zhǔn)分子離子[M+H]+峰(m/z130.0)，然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子全掃描，得到碎片離子，篩選響應(yīng)值較高、基線噪音低的離子(m/z111.9)作為監(jiān)測離子，最后對(duì)鞘氣、輔助氣、碰撞能量等參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到“1.4”所述質(zhì)譜條件。

2.2 配制溶劑的優(yōu)化

鹽酸黃酮哌酯屬于酯類化合物，極易發(fā)生酯鍵水解反應(yīng)，尤其是在堿性溶液中[14-15]。El-Gindy等[16]研究證明，鹽酸黃酮哌酯易水解生成3-甲基黃酮-8-羧酸和1-(2-羥乙基)哌啶(圖2)，在0.1 mol/L NaOH溶液中0.5 h內(nèi)即可水解完全。本實(shí)驗(yàn)考察了鹽酸黃酮哌酯在不同配制溶劑中的穩(wěn)定性，分別用水、水-乙腈(95∶5)、0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-乙腈(95∶5) 4種溶液配制得到0.1 mg/mL的鹽酸黃酮哌酯樣品，分別放置0，0.5，1，2，3 h后上機(jī)檢測。研究表明，鹽酸黃酮哌酯在水和水-乙腈溶液中的水解速度較快，0.5 h內(nèi)1-(2-羥乙基)哌啶增長近5倍，在0.1%甲酸水和0.1%甲酸水-乙腈溶液中較為穩(wěn)定，3 h內(nèi)基本不水解。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，0.1%甲酸水-乙腈配制的樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的保留能力降低，因此本研究選用0.1%甲酸水作為1-(2-羥乙基)哌啶和鹽酸黃酮哌酯供試液的配制溶劑。

圖2 鹽酸黃酮哌酯在NaOH溶液中的水解機(jī)理Fig.2 Hydrolysis mechanism of flavoxate hydrochloride in sodium hydroxide

2.3 色譜條件的優(yōu)化

對(duì)3種常用的C18色譜柱Agilent Eclipse XDB(2.1 mm×100 mm，3.5 μm)、Thermo Accucore(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)和Agilent Zorbax SB-Aq(2.1 mm×100 mm，1.8 μm)進(jìn)行考察。由于1-(2-羥乙基)哌啶的極性較大，出峰時(shí)間較早，在3種色譜柱上均能和鹽酸黃酮哌酯主峰達(dá)到有效分離，但1-(2-羥乙基)哌啶在Agilent Eclipse XDB柱上的峰形較寬且有拖尾現(xiàn)象，在Thermo Accucore柱上不能有效保留?？紤]到本實(shí)驗(yàn)的梯度洗脫程序中較長時(shí)間為高水相比例，Agilent Zorbax SB-Aq柱具有親水性表面，可以有效防止固定相的塌陷，在相同檢測樣品數(shù)量下使用壽命明顯高于Agilent Eclipse XDB柱和Thermo Accucore柱。另外，Agilent Zorbax SB-Aq柱可使極性化合物在高含水量的流動(dòng)相中有強(qiáng)保留，從而延長1-(2-羥乙基)哌啶的出峰時(shí)間，因此本實(shí)驗(yàn)選用Agilent Zorbax SB-Aq柱作進(jìn)一步的色譜條件優(yōu)化。

采用正離子掃描模式，在流動(dòng)相乙腈-水體系中加入適量的甲酸可以提高其離子化效率[17]。本實(shí)驗(yàn)考察了流動(dòng)相A(甲酸水)中分別添加0.02%，0.05%和0.1%甲酸時(shí)對(duì)1-(2-羥乙基)哌啶峰形、響應(yīng)強(qiáng)度以及保留時(shí)間等方面的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)流動(dòng)相A中甲酸含量為0.02%時(shí)，雖然1-(2-羥乙基)哌啶的保留時(shí)間有所延長，但其峰形較寬而且拖尾嚴(yán)重，響應(yīng)值較低；提高甲酸含量后，目標(biāo)化合物的峰形均較好，但在0.1%甲酸條件下其響應(yīng)值更高，且1-(2-羥乙基)哌啶的保留時(shí)間為1.60 min，與鹽酸黃酮哌酯主峰(RT=7.1 min)的分離效果較好。因此，本實(shí)驗(yàn)最終選擇乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，采用Agilent Zorbax SB-Aq柱進(jìn)行分離。

2.4 線性關(guān)系、檢出限與定量下限

用0.1%甲酸水溶液將10 mg/L的1-(2-羥乙基)哌啶標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋后配制成質(zhì)量濃度分別為10，25，50，75，100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在最佳檢測條件下進(jìn)行測定，以1-(2-羥乙基)哌啶的峰面積(y)對(duì)其質(zhì)量濃度(x,μg/L)進(jìn)行線性回歸。結(jié)果表明，1-(2-羥乙基)哌啶在10～100 μg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 7)，線性方程為y=1 396.1+1 161.1x；以3倍信噪比(S/N=3)和S/N=10分別計(jì)算方法檢出限為6.0 mg/L，定量下限為20 mg/L。

2.5 重復(fù)性

按照“1.2”方法平行配制同一批號(hào)6份鹽酸黃酮哌酯供試品溶液，進(jìn)行LC-MS測定，考察6份樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)。結(jié)果顯示，6份鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶保留時(shí)間的RSD為0.65%，峰面積的RSD為2.6%。方法的重復(fù)性良好，可以滿足1-(2-羥乙基)哌啶的分析要求。

2.6 樣品加標(biāo)回收率與相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

以已知1-(2-羥乙基)哌啶含量的鹽酸黃酮哌酯樣品的加標(biāo)回收率考察方法的準(zhǔn)確度。在鹽酸黃酮哌酯樣品中按80%限度、100%限度和120%限度3個(gè)水平添加1-(2-羥乙基)哌啶對(duì)照品，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行樣品前處理和測定，每個(gè)加標(biāo)水平平行測定3個(gè)樣品。由表1可知，鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶濃度為63.40 mg/L，加標(biāo)回收率為98.9%～106.8%，RSD均小于3.0%。

表1 鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶的加標(biāo)回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recoveries and RSDs of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine ethanol in flavoxate hydrochloride

圖3 鹽酸黃酮哌酯樣品中1-(2-羥乙基)哌啶的SRM色譜圖Fig.3 SRM chromatogram of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine in flavoxate hydrochloride sample

2.7 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本方法對(duì)小試3批、中試3批及工藝驗(yàn)證3批共9批鹽酸黃酮哌酯樣品進(jìn)行分析測定，所有樣品均按照“1.2”方法現(xiàn)用現(xiàn)配。9批樣品中均檢出1-(2-羥乙基)哌啶殘留，含量為53～117 mg/kg，均符合鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶雜質(zhì)的限量要求(≤500 mg/kg)，圖3為某樣品的SRM色譜圖。

3 結(jié) 論

本文首次建立了鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的HPLC-MS/MS定量檢測方法，該方法利用LC-MS/MS的高選擇性，有效去除了其他雜質(zhì)的干擾，確保了方法的高靈敏度，且精密度、回收率和定量下限均能滿足限度要求，適用于鹽酸黃酮哌酯中1-(2-羥乙基)哌啶殘留的定量檢測。

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Determination of 1-(2-Hydroxyethyl)piperidine in Flavoxate Hydrochloride by HPLC-QTRAP-MS/MS

XU Jie*,ZHOU Chang-peng,ZHENG Wen-feng,WANG Chun-ling

(National Enterprise Technology Center of Disha Pharmaceutical Group，Weihai 264205，China)

A high performance liquid chromatography-quadrupole ion trap tandem mass spectrometric(HPLC-QTRAP-MS/MS) method was developed for the quantification of 1-(2-hydroxyethyl) piperidine residue in flavoxate hydrochloride.After dissolved with 0.1% formic acid,the flavoxate hydrochloride sample was loaded onto an Agilent ZORBAX SB-Aq C18(2.1 mm×100 mm，1.8 μm) column to separate with a mobile phase of 0.1% formic acid-acetonitrile.The electrospray was operated in positive ion mode,and the sample was monitored in the select reaction monitoring(SRM) mode.As a result,the calibration curve of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine showed a good linearity(r=0.999 7) in the range of 10-100 μg/L.The recoveries were in the range of 98.9%-106.8%,with relative standard deviations(RSDs) not more than 3.0%.The limit of detection(LOD,S/N=3) for the method was 6.0 mg/L,and the limit of quantitation(LOQ,S/N=10) was 20 mg/L.The method has the advantages of simple operation,high sensitivity and good reproducibility,and could be used for the detection of 1-(2-hydroxyethyl)piperidine in flavoxate hydrochloride.

high performance liquid chromatography-quadrupole ion trap tandem mass spectrometry(HPLC-QTRAP-MS/MS)；flavoxate hydrochloride; 1-(2-hydroxyethyl)piperidine

2017-02-22；

2017-03-17

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.012

O657.63;TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0906-05

*通訊作者：許 潔，碩士，工程師，研究方向：理化檢測及藥物分析，Tel：0631-3857373，E-mail：xwjxuwenjing1987@126.com