宋印清，王 敏，王彤彤，周 劍，楊夢瑞

(中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

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反門控去耦技術在定量1H NMR測定苯乙醇胺A純度中的應用

宋印清，王 敏*，王彤彤*，周 劍，楊夢瑞

(中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與檢測技術研究所，北京 100081)

采用定量核磁中反門控去耦的方法對苯乙醇胺A的純度進行測定。通過對氘代溶劑和內(nèi)標物、定量峰的選擇，以及弛豫延遲時間(D1)，采樣次數(shù)和采樣溫度等定量核磁條件的優(yōu)化，最終確定測試條件為：激發(fā)脈沖角度30，時間域數(shù)據(jù)點32 K，測定溫度293 K，脈沖的弛豫延遲為33.64 s，采樣次數(shù)64，線寬0.3 Hz。在此實驗條件下，穩(wěn)定性可達24 h，耐用性良好。以樣品和內(nèi)標的峰面積比對其摩爾比繪制標準曲線，結果顯示，兩者的摩爾比在0.333～3.333范圍內(nèi)線性關系良好，相關系數(shù)(r2)為0.999 9。該方法專屬性強，準確，簡便，適用于該類型化合物含量的測定。

苯乙醇胺A；定量核磁；反門控去耦；純度

苯乙醇胺A又名克倫巴胺，是一種β-受體激動劑，具有β-受體激動劑的典型結構。它是一種人工合成的化學物質(zhì)，是福莫特羅的同分異構體，其結構(見圖1)與萊克多巴胺類似[1]。苯乙醇胺A是2010年新發(fā)現(xiàn)的一種瘦肉精，具有營養(yǎng)再分配的作用，添加到飼料中可加速脂肪的分解和轉化，提高動物的瘦肉率、減少飼料使用，降低成本[2]；但人食用上述物質(zhì)會產(chǎn)生心律失常、心慌、心悸、甲狀腺機能亢進等中毒癥狀[3]，可誘發(fā)和加重心腦血管病人的病情，因此我國頒布了1519號公告，禁止將苯乙醇胺A等11種物質(zhì)添加于飼料和動物飲用水中。國內(nèi)外針對苯乙醇胺A的測定主要以高效液相色譜和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法為主。

圖1 苯乙醇胺A的結構式 Fig.1 Structural formula of phenylethanolamine A

圖2 氫譜中反轉門控去耦的脈沖序列Fig.2 Pulse sequence for inverse gated decoupling in 1H NMR

定量核磁共振(Quantitative nuclear magnetic resonance,qNMR)不需要待測物對照品，僅以已知含量的藥物或化學物質(zhì)為參比即可對待測物含量進行測定[4]。該方法具有前處理步驟簡單、快捷等優(yōu)點，已被各國藥典所收錄[5-6]。近年來，qNMR技術已被廣泛用于定量分析，主要包括藥物的含量測定[7-8]、異構體[9]和食品領域[10]。qNMR包括1H，13C，19F，31P，14N，15N-NMR等，其中1H由于豐度和靈敏度高，適用范圍廣，因此被國內(nèi)外研究機構廣泛報道[11-13]。核磁共振中常規(guī)的去耦方式[14]包括寬帶去耦、門控去耦和反門控去耦。寬帶去耦無耦合，有奧弗豪塞爾核效應(NOE)；門控去耦既有耦合現(xiàn)象也有NOE現(xiàn)象，對于氫譜和碳譜定量和解析均有明顯的影響；反門控去耦技術是指去耦器在弛豫延遲期關閉而在采樣期打開，脈沖序列如圖2所示，該技術既無耦合現(xiàn)象也無NOE現(xiàn)象，最適于氫譜和碳譜的定量。本文在定量氫譜中運用反門控去耦技術測定了違禁獸藥苯乙醇胺A的純度，并用于苯乙醇胺A純度標準物質(zhì)的制作。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Bruker AVANCE Ⅲ型400 MHz核磁共振儀(瑞士Bruker公司)；UMX2型電子天平(分度值0.1 μg，瑞士梅特勒公司)；苯乙醇胺A(Laboratorien Berlin Adlerhof GmbH，德國)；氘代甲醇(純度99.8%，美國Sigma公司)；尼泊金乙酯(中國計量科學研究院，GBW(E)100064)， 5 mm核磁管(WG-1000-7， 美國Wilmad公司)。苯甲酸 (中國計量科學研究院，GBW(E)100064)，鄰苯二甲酸氫鉀 (中國計量科學研究院，GBW(E)100064)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品配制方法 分別精確稱量約1.0～10.0 mg樣品和3.0 mg內(nèi)標物各3份置于同一棕色玻璃瓶，用1.0 mL氘代甲醇振蕩完全溶解后，轉移至直徑為5 mm的核磁試管中，待測。

1.2.2 核磁實驗參數(shù)與圖譜處理方法1H NMR測定參數(shù)：進行3D勻場和自動調(diào)諧，激發(fā)脈沖角度30，采集時間4.0 s，時間域數(shù)據(jù)點64 K，掃描寬度20 ppm， 弛豫延遲 (D1≥5T1)，自動調(diào)節(jié)增益， 中心頻率(位于定量峰和內(nèi)標峰的中心位置)， 窗函數(shù)0.3 Hz。

圖譜的處理方法：通過Topspin 2.1軟件進行數(shù)據(jù)采集，利用ACD Lab軟件進行處理，均依次采用自動和手動相位調(diào)整，自動和手動基線校準及根據(jù)氘代甲醇的氫譜數(shù)據(jù)進行化學位移校正。在基線與峰的重合擴大± 0.1 Hz范圍內(nèi)進行積分。

1.2.3 計算方法 取苯乙醇胺A和尼泊金乙酯，按樣品制備方法平行配制3份樣品，樣品振蕩溶解后，在優(yōu)化條件下記錄圖譜，每個樣品平行測量5次，并取平均值。

式中：PNMR為采用核磁共振法測得的被測物純度；Ix和Istd分別為樣品和內(nèi)標物指定峰的積分面積；nx和nstd分別為樣品和內(nèi)標物指定峰的核群核個數(shù)；Mx和Mstd分別為樣品和內(nèi)標物的分子量；mx和mstd分別為樣品和內(nèi)標物的質(zhì)量；Pstd為內(nèi)標物的純度。

2 結果與討論

2.1 氘代溶劑與內(nèi)標物的選擇

氘代溶劑應使樣品和內(nèi)標有良好的溶解度?？紤]到苯乙醇胺A的極性大，因此選擇氘代甲醇作為溶劑。內(nèi)標物選擇的依據(jù)為：易溶于氘代試劑，化學結構穩(wěn)定，屬于國家級標準物質(zhì)，且不與待測化合物反應。由于兩種內(nèi)標苯甲酸和鄰苯二甲酸氫鉀均呈酸性，易與苯乙醇胺A發(fā)生化學反應，生成季銨鹽，因此不適合作為本實驗的內(nèi)標。國家級標準物質(zhì)尼泊金乙酯不與苯乙醇胺A發(fā)生化學反應，易溶于氘代甲醇中，且定量峰分布均勻，與苯乙醇胺A均含有苯環(huán)結構，因此采用尼泊金乙酯作為內(nèi)標。

圖3 苯乙醇胺A和尼泊金乙酯混合物的氫譜圖Fig.3 qNMR spectra of phenylethanolamine A and ethyl paraben mixture

No.PhenylethanolamineAEthylparabenT1(s)δ(ppm)T1(s)δ(ppm)18.152.9107.863.05827.441.9156.803.11737.281.3284.302.08046.901.7571.353.62854.481.45163.781.61072.770.65381.850.23391.690.568101.150.712

determination longitudinal relaxation delay time(T1):(T1 delay=0.01,0.05,0.1,0.25,0.5,1,2,4,8,15μs)were measured by inversion recovery method,and the T1values of different peaks were obtained by data fitting(縱向弛豫時間T1測定方法：采用反轉恢復法測定T1，利用軟件Topspin 2.1進行采樣(T1delay=0.01， 0.05，0.1， 0.25， 0.5， 1， 2， 4， 8， 15 μs)， 經(jīng)過數(shù)據(jù)擬合得到不同峰的T1值)

2.2 氫譜定量峰的選擇

定量峰必須滿足在積分范圍中無干擾，且信號的化學位移和縱向弛豫時間(T1)盡可能接近內(nèi)標物的信號峰，以減少誤差。在兩者混合物氫譜中發(fā)現(xiàn)(如圖3)，苯乙醇胺A的高場區(qū)可能受到微量雜質(zhì)的影響，而苯環(huán)區(qū)基線平穩(wěn)，受到雜質(zhì)影響的幾率較小。同時苯乙醇胺A的化學位移在δH8.15處共振譜線的縱向弛豫時間為2.910 s，而內(nèi)標物尼泊金乙酯在δH7.86處縱向弛豫時間為3.058 s，兩者之間十分接近，且兩峰之間的化學位移相差大于0.4 Hz，滿足qNMR對內(nèi)標和檢測物標定譜線選擇的條件 (表1)。確定兩定量峰后，將定量氫譜的中心頻率設在δH8.00 處，以降低偏共振效應(Off-resonance effect)的影響。

2.3 核磁條件的優(yōu)化

2.3.1 脈沖弛豫延遲時間(D1)的選擇 根據(jù)文獻報道[15]，D1/T1比值增加，會提高實驗的精確度。為了保證定量峰的自旋核能夠達到99%以上弛豫，必須使D1/T1≥5，因此需進一步優(yōu)化兩者比值，以滿足定量核磁的要求。在優(yōu)化的定量峰條件下，縱向弛豫時間T1=3.058 s，分別考察不同D1/T1(5、8、11、14、17)條件下樣品與內(nèi)標物的定量峰面積比，其結果分別為1.723、1.725、1.727、1.727、1.727。D1/T1= 11時，樣品與內(nèi)標物的定量峰面積比值無明顯變化，能夠滿足定量要求，因此選擇D1= 33.64 s。

2.3.2 采樣次數(shù)的選擇 取1.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯內(nèi)標，D1= 33.64 s，在不同采樣次數(shù)(8、16、32、64、128次)條件下，分別測定定量峰8.15 ppm與基線9.0 ppm間的信號強度，利用Topspin 2.1軟件計算S/N。結果表明，譜圖的信噪比S/N與采樣次數(shù)的平方根成正比，擴大采樣次數(shù)有利于提高采樣的信噪比。由于核磁共振定量要求S/N≥250，因此確定采樣次數(shù)為64次。

2.3.3 采樣溫度的選擇 取約1.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯內(nèi)標，在上述優(yōu)化條件下，對采樣溫度(T=15、20、25、30、35 ℃)進行優(yōu)化。實驗數(shù)據(jù)表明采樣溫度對內(nèi)標物和樣品的積分面積影響很小，可以忽略不計。

2.4 方法學驗證

2.4.1 線性范圍 分別精密稱取樣品約1.0、2.0、4.0、6.0、10.0 mg，內(nèi)標物尼泊金乙酯3.0 mg，置于同一離心管中，按照“1.2”的方法平行配制5份樣品溶液，按照“2.3”優(yōu)化后的條件測量氫譜。以樣品/內(nèi)標摩爾比為橫坐標(x)，樣品/內(nèi)標定量峰面積比為縱坐標(y)進行線性擬合。結果表明，樣品與內(nèi)標的摩爾比在0.333 3～3.333 3范圍內(nèi)，氫信號與樣品量成正比，方法的線性關系良好，回歸方程為y=1.013 7x-0.001 6，相關系數(shù)(r2)為0.999 9。

2.4.2 精密度 精密稱取4.0 mg苯乙醇胺A和3.0 mg尼泊金乙酯，按照“2.3”優(yōu)化后的條件測量日內(nèi)和日間的氫譜和碳譜。結果顯示，定量氫譜中苯乙醇胺A與尼泊金乙酯峰面積(NA/NA)的日內(nèi)相對標準偏差(RSD)為0.15%，日間RSD為0.18%。相對于其他去耦方式，反門控去耦[16]可以造成13C對1H的耦合作用，因此該方法的精密度更適合于定量氫譜。

2.4.3 方法比較 利用“2.4.2”制備在核磁管中的樣品，與常見定量氫譜進行方法比對，結果顯示：常見定量氫譜采用寬帶去耦方式，其日內(nèi)相對標準偏差為0.35%，高于反門控去耦的日內(nèi)相對標準偏差(0.15%)，原因可能是受到衛(wèi)星峰的影響。

2.5 方法的應用

取購于國外公司的兩份苯乙醇胺A標準品，分別進行精確稱量，并加內(nèi)標物尼泊金乙酯于試管中，完全溶解后注入核磁管中，在上述優(yōu)化條件下進行測定，分別測得兩種樣品中苯乙醇胺A的含量為99.3%(RSD=0.18%)和99.5%(RSD=0.11%)，表明該方法結果準確、可靠。

3 結 論

通過反門控去耦消除衛(wèi)星峰，有利于譜線積分區(qū)域的設定，在譜線相對比較接近時可抑制衛(wèi)星峰信號對標定峰定量積分的影響。因此，定量核磁方法中的反門控去耦技術有望成為定量方法，相信隨著該技術在分析領域應用的不斷深入，能為不同領域成分和含量分析開拓新的思路和方法。

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Application of Inverse Gated Decoupling Technique in Quantitative1H NMR Determination of Purity of Phenylethanolamine A

SONG Yin-qing,WANG Min*,WANG Tong-tong*,ZHOU Jian,YANG Meng-rui

(Institute of Quality Standard and Testing Technology for Agro-products,Chinese Academy of Agriculture,Beijing 100081,China)

A high accuracy method of qNMR with inverse gated decoupling technique was established to determine the content of phenylethanolamine A.Considering the choice of deuterated solvents,internal standards and quantitative peaks,and the optimization of relaxation delay,aquisition number and temperature,the final measurement conditions of qNMR spectra were as follows:flip angle:30,date point:32 K,detection temperature:293 K,a relaxation delay:33.64 s,acquisition times:64 times,line broadening:0.3 Hz.The experimental results showed that the stability of this condition could be maintained for 24 h.A good linear relationship was obtained between peak area ratio and molar ratio in the range of 0.333-3.333,and the correlation coefficient (r2) was 0.999 9.The established method is specific,accurate and simple,and could be used for the content determination of this kind of compounds.

phenylethanolamine A；qNMR；inverse gated decoupling;purity

2016-12-22；

2017-03-11

中國農(nóng)業(yè)科學院創(chuàng)新工程；農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風險評估標準物質(zhì)研制與質(zhì)量控制規(guī)范研究(2015)(GJFP201501503)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.018

O482.532；TQ460.72

A

1004-4957(2017)07-0933-04

*通訊作者：王 敏，研究員，研究方向：標準與標準物質(zhì)，Tel：010-82106546，E-mail:wangmincaas@126.com 王彤彤，博士，助理研究員，研究方向：有機合成，Tel：010-82106545，E-mail：wangttong123@126.com