楊愿愿，應(yīng)光國，趙建亮，劉有勝，柳王榮

(1.中國科學(xué)院 廣州地球化學(xué)研究所 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640; 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

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固相萃取/超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定不同水體中5種人造甜味劑、6種造影劑及咖啡因

楊愿愿1,2，應(yīng)光國1*，趙建亮1，劉有勝1，柳王榮1

(1.中國科學(xué)院 廣州地球化學(xué)研究所 有機(jī)地球化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640; 2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049)

建立了快速檢測不同水樣(地表水、污水處理廠進(jìn)水和出水)中5種人造甜味劑、6種造影劑和咖啡因的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法。利用HR-X固相萃取柱對過濾后的水樣進(jìn)行富集凈化。采用Zorbax SB-C18色譜柱分離，電噴霧正模式(ESI+)和負(fù)模式(ESI-)下分別以乙腈-水(10 mmol/L乙酸銨，0.01%甲酸)和乙腈-水(5 mmol/L乙酸銨，1 mmol/L Tris)為流動相，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測。各目標(biāo)化合物在5～5 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.998。地表水、污水處理廠進(jìn)水和出水的回收率為70%～120%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.8%～19.0%，方法檢出限(MDL)分別為0.43～13.8、1.80～34.8、2.30～134 ng/L。應(yīng)用該方法對廣州某污水處理廠進(jìn)水和出水及受納河流河水進(jìn)行檢測，除阿斯巴甜、碘他拉酸、碘普羅胺、碘美普爾外，其他物質(zhì)均有檢出且濃度較高。該方法準(zhǔn)確、靈敏、操作簡便，適用于多種環(huán)境水樣中人造甜味劑、造影劑和咖啡因的分析檢測。

人造甜味劑；造影劑；咖啡因；超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜；水樣

污水處理廠出水中存在的多種有機(jī)污染物對水生生物及人體健康存在潛在危害，因此，污水排放對水環(huán)境的污染及其影響受到人們越來越多的關(guān)注。污水中有些化合物可以指示或示蹤污水排放，因此污水示蹤劑是研究污水污染程度的有效工具。目前，已有研究表明人造甜味劑[1-2]、造影劑[3]和咖啡因[4-5]是較為理想的污水示蹤劑。

人造甜味劑作為一種食品添加劑，多應(yīng)用于食品和飲料中，因此針對其在食品和飲料中的檢測方法已有大量報道[6-9]。近年來，人造甜味劑作為污水示蹤劑引起了人們的廣泛關(guān)注，針對其在環(huán)境介質(zhì)中的檢測方法也相繼被開發(fā)[10-11]；造影劑是一類診斷用藥，可用于血管、內(nèi)臟等體內(nèi)軟組織的醫(yī)學(xué)成像，目前已建立了多種環(huán)境中造影劑的檢測方法[12-13]；咖啡因作為一種興奮劑多存在于茶葉、咖啡、功能飲料、食品和藥品中，其主要檢測方法有液相色譜法(HPLC)[14]、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(GC-MS)[15]及液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[16]?？傮w而言，上述3類化合物的使用范圍和理化性質(zhì)差異較大，且其水溶性較大，提取、分析難度較大。因此其在環(huán)境介質(zhì)中的同時檢測方法鮮有報道。然而在篩選污水示蹤劑時，需對這3類物質(zhì)在環(huán)境中的分布進(jìn)行全面調(diào)查。為簡化操作、縮短分析時間以及節(jié)省分析成本，需要開發(fā)一種能夠同時檢測不同水體中人造甜味劑、造影劑和咖啡因的分析方法。

本研究利用固相萃取對水樣進(jìn)行前處理，采用UPLC-MS/MS對樣品進(jìn)行檢測，建立了能夠同時檢測不同水樣中人造甜味劑、造影劑和咖啡因的方法，以期為污水示蹤劑的篩選提供準(zhǔn)確高效的檢測手段。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1200 UPLC/6460 Triple Quard MS超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Agilent公司)；固相萃取裝置(美國Alltech公司)；MTN-2800D氮吹儀(天津奧特賽恩斯儀器有限公司)。

標(biāo)準(zhǔn)品：安賽蜜(ACE)、甜蜜素(CYC)、阿斯巴甜(ASP)、三氯蔗糖(SUC)、泛影酸(DTZ)、碘帕醇(IOD)、碘普羅胺(IOP)、碘美普爾(IOM)、碘海醇(IOX)、咖啡因(CAF)購于德國Dr. Ehrenstorfer公司，糖精鈉(SAC)購于美國Supelco公司，碘他拉酸(ITA)購于美國藥典委員會(USP)；氘代內(nèi)標(biāo)：安賽蜜-d4(ACE-d4)、阿斯巴甜-d5(ASP-d5)、糖精-d5(SAC-d5)、甜蜜素-d11(CYC-d11)、三氯蔗糖-d6(SUC-d6)、泛影酸-d6(DTZ-d6)、碘帕醇-d8(IOD-d8)、碘普羅胺-d3(IOP-d3)、碘美普爾-d3(IOM-d3)、碘海醇-d5(IOX-d5)均購于加拿大Toronto Research Chemicals公司，咖啡因-d3(CAF-d3)購于美國o2si公司。甲醇(色譜純，德國Merck公司)；甲酸、乙酸銨(色譜純，德國CNW公司)；離子對試劑Tris(色譜純，美國Sigma-Aldrich公司)；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q水。

HR-X固相萃取柱(500 mg/6 mL，Chromabond公司)；HLB固相萃取柱(500 mg/6 mL，Waters公司)；玻璃纖維濾膜(GF/F，孔徑70 mm，英國 Whatman公司)；尼龍過濾器(13 mm × 0.22 μm,上海安譜公司)。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

所有標(biāo)樣和內(nèi)標(biāo)均溶于甲醇中配成單標(biāo)儲備液，各標(biāo)樣的濃度均為100 mg/L，各內(nèi)標(biāo)的濃度均為10 mg/L。用甲醇分別配制濃度為10 mg/L的混合標(biāo)樣儲備液和濃度為1 mg/L的混合內(nèi)標(biāo)儲備液。工作液則在使用前由儲備液稀釋而得。所有儲備液均置于-18 ℃ 冰柜中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品前處理

固相萃取前，水樣經(jīng)70 mm GF/F濾膜過濾，以去除水樣中的顆粒物及懸浮物。然后準(zhǔn)確量取一定體積的水樣(污水處理廠進(jìn)水200 mL；出水500 mL；地表水500 mL)，向其中加入混合內(nèi)標(biāo)(使水樣中各內(nèi)標(biāo)質(zhì)量濃度均為100 μg/L)，搖勻。固相萃取柱依次用10 mL甲醇和10 mL超純水(4 mol/L硫酸調(diào)至pH 3.0)活化，水樣以5～10 mL/min的流速通過固相萃取柱。水樣加載完后，在真空條件下抽干柱子2 ～3 h。以8 mL甲醇洗脫，洗脫液氮吹近干，以甲醇定容至1 mL，過0.22 μm有機(jī)相尼龍濾膜，在-18 ℃下保存。儀器分析前，取出100 μL樣品，吹干后用相應(yīng)模式的緩沖液重新定容，采用UPLC-MS/MS進(jìn)行檢測。

1.4 色譜-質(zhì)譜條件

目標(biāo)化合物采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行測定，離子源為電噴霧(ESI)離子源，其中人造甜味劑在ESI(-)模式下分析，造影劑和咖啡因在ESI(+)模式下分析，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式。色譜柱為Zorbax SB-C18(100 mm×3 mm，1.8 μm)，柱溫：40 ℃，流速：0.3 mL/min，進(jìn)樣量：20 μL。

ESI(+)模式下流動相：A為水(10 mmol/L乙酸銨，0.01%甲酸)，B為乙腈，梯度洗脫程序：0～ 6 min，2% B；6～8 min，2%～ 60% B；8～13 min，60% B；13～18 min，60%～2% B。干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：10.0 mL/min；霧化器壓力：206.9 kPa；電噴霧電壓：200 V。ESI(-)模式下流動相：A為水(5 mmol/L乙酸銨，1 mmol/L Tris)，B為乙腈。梯度洗脫程序：0～3 min，5% B；3～5 min，5%～ 90% B；5～16 min，90%～5% B。干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流量：6.0 mL/min；霧化器壓力：344.8 kPa；電噴霧電壓：200 V。

使用Opitimizer軟件(美國Agilent公司)對各單標(biāo)及內(nèi)標(biāo)進(jìn)行掃描，選擇豐度最高的兩組母離子/子離子對分別作為定量和定性離子并記錄其對應(yīng)的碎裂電壓(Fragmentor)和碰撞能(Collision energy)。各目標(biāo)化合物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜采集參數(shù)見表1。

表1 目標(biāo)化合物的UPLC-MS/MS優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Mass transitions and retention times for target compounds in UPLC-MS/MS

*quantitative ion；I.S.：internal standard

2 結(jié)果與討論

2.1 儀器條件的優(yōu)化

流動相是影響峰形、響應(yīng)值、分離度、柱壓和分析時間的重要因素。本文分別以甲醇和乙腈作為有機(jī)相進(jìn)行對比，發(fā)現(xiàn)乙腈作為有機(jī)相時，各物質(zhì)的峰形較好。ESI(+)模式下，在流動相中加入緩沖鹽和弱酸可以調(diào)節(jié)流動相的pH值，并為目標(biāo)化合物提供質(zhì)子，從而提高化合物的響應(yīng)值，對流動相中乙酸銨和甲酸的濃度進(jìn)行優(yōu)化，確定了最優(yōu)的流動相為乙腈-水(10 mmol/L乙酸銨，0.01 %甲酸)；在ESI(-)模式下，流動相中加入離子對試劑Tris可以顯著提高各人造甜味劑的響應(yīng)值[17]，本文對流動相中Tris和乙酸銨的濃度進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)的流動相為乙腈-水(5 mmol/L乙酸銨，1 mmol/L Tris)。在優(yōu)化的質(zhì)譜與色譜條件下，目標(biāo)化合物的總離子流圖見圖1。

圖1 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 μg/L)的總離子流圖Fig.1 Total ion chromatograms(TIC) of mixed standard solution(100 μg/L)

圖2 不同pH值下目標(biāo)化合物的絕對回收率Fig.2 Absolute recoveries of target compounds under various pH values

2.2 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

2.2.1 固相萃取小柱的選擇 以超純水為基質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，對HLB和HR-X兩種固相萃取柱的萃取效率進(jìn)行考察。由于本文采用同位素內(nèi)標(biāo)對回收率進(jìn)行校正，因此兩種固相萃取柱對各目標(biāo)化合物均有較好的相對回收率(82%～125%)。通過絕對回收率對兩種柱進(jìn)行對比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除ASP和SUC外，HR-X柱對其他10種化合物的絕對回收率均高于HLB柱，因此本文采用HR-X柱進(jìn)行固相萃取。

2.2.2 樣品pH值的選擇 樣品的pH值對萃取效率有較大的影響，因此本文考察了不同pH值(3.0，5.0，7.0)下各目標(biāo)化合物的萃取效率。結(jié)果顯示，各目標(biāo)化合物在3個pH值條件下的相對回收率均在70%～120%之間，但在pH 7.0時絕對回收率均較低，pH 3.0時，甜味劑ACE、SAC、CYC、ASP和離子型造影劑ITA、DTZ有較高的絕對回收率，尤其是ASP在pH 3.0條件下的絕對回收率顯著提高(圖2)，因此實(shí)驗(yàn)選擇樣品的pH值為3.0。

2.3 線性范圍與相關(guān)系數(shù)

分別用正、負(fù)模式的緩沖液配制5，10，50，100，200，500，1 000，2 000，5 000 μg/L系列濃度的造影劑和咖啡因的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液以及人造甜味劑的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，內(nèi)標(biāo)濃度均為100 μg/L。在優(yōu)化條件下，采用內(nèi)標(biāo)法，以待測物的峰面積與對應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X，μg/L)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。結(jié)果顯示，各目標(biāo)化合物在5～5 000 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)(r2)為0.998 8～0.999 9。

2.4 精密度、準(zhǔn)確度、檢出限與定量下限

采用優(yōu)化的方法對地表水、污水處理廠出水和進(jìn)水進(jìn)行加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，由于不同類型的水樣中各目標(biāo)化合物的本底值差別較大，因此，各類化合物在不同水樣中的加標(biāo)濃度不同。目標(biāo)化合物在地表水、污水處理廠出水和進(jìn)水中的回收率分別為70.1%～117%、72.9%～117%和71.7%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)均小于20%?；赨PLC-MS/MS對最低加標(biāo)濃度的樣品進(jìn)行分析得到信噪比，以3倍信噪比對應(yīng)的濃度為方法檢出限(MDL)，10倍信噪比對應(yīng)的濃度為定量下限(MQL)。由表2～4可知，地表水、污水處理廠出水和進(jìn)水中MDL分別為0.43～13.8、1.80～34.8、2.30～134 ng/L，MQL分別為1.45～45.8、6.02～116、7.67～445 ng/L。

表2 地表水中各目標(biāo)化合物的回收率(R)、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限與定量下限Table 2 Recoveries,matrix effects，method detection limits(MDLs) and method quantification limits(MQLs) of target compounds from surface water

表3 污水處理廠出水中各目標(biāo)化合物的回收率、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限與定量下限Table 3 Recoveries,matrix effects,MDLs and MQLs of target compounds from effluent

*indicated that the spiked concentrations were 100,500,1000 ng/L,respectively

表4 污水處理廠進(jìn)水中各目標(biāo)化合物的回收率、基質(zhì)效應(yīng)、方法檢出限與定量下限Table 4 Recoveries,matrix effects,MDLs and MQLs of target compounds from influent

*indicated that the spiked concentrations were 100,500,1000 ng/L,respectively

此外，本文還考察了目標(biāo)化合物在不同類型水樣中的基質(zhì)效應(yīng)(ME)，計算公式為ME=[(CS-CN)/CSp-sol]×100%。其中CS為相應(yīng)基質(zhì)提取液中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后各目標(biāo)化合物的濃度；CN為相應(yīng)基質(zhì)提取液中各目標(biāo)化合物的濃度；CSp-sol為起始流動相中添加相應(yīng)濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液后各目標(biāo)化合物的濃度。結(jié)果顯示，目標(biāo)化合物在地表水(除了CYC，65%)、污水處理廠進(jìn)水(除了SUC為124%)和出水(除了IOD為160%)中未受到明顯的基質(zhì)干擾(70%～120%)。

2.5 實(shí)際樣品的測定

采用本方法對廣州某污水處理廠的進(jìn)出水及受納河流上下游的地表水進(jìn)行分析檢測。結(jié)果表明，ASP，ITA，IOM和IOP在各水樣中均未檢出，其余8種化合物在所有水樣中普遍存在且濃度較高，其中ACE，SAC，SUC和CAF的濃度達(dá)μg/L級(見表5)。

表5 不同水樣中各目標(biāo)化合物的濃度Table 5 Concentrations of target compounds in different water samples (ng/L)

*no detected

3 結(jié) 論

本文建立了檢測不同水體(地表水、污水處理廠進(jìn)水和出水)中5種人造甜味劑、6種造影劑及咖啡因的UPLC-MS/MS方法，該法具有靈敏度高、重現(xiàn)性好、基質(zhì)干擾小等優(yōu)點(diǎn)，為全面普查人造甜味劑、造影劑及咖啡因在地表水、污水處理廠進(jìn)水和出水中的含量水平及其分布特征提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[1] Buerge I J，Buser H R，Kahle M，Muller M D，Poiger T.Environ.Sci.Technol.，2009,43(12)：4381-4385.

[2] Tran N H，Hu J，Li J，Ong S L.WaterRes.，2014,48(1)：443-456.

[3] Wolf L，Zwiener C，Zemann M.Sci.TotalEnviron.，2012,430(15)：8-19.

[4] Buerge I J，Poiger T，Müller M D，Buser H R.Environ.Sci.Technol.，2003,37(4)：691-700.

[5] Buerge I J，Poiger T，Müller M D，Buser H R.Environ.Sci.Technol.，2006,40(13)：4096-4102.

[6] Zhu Y，Guo Y Y，Ye M L，James F S.J.Chromatogr.A，2005,1085(1)：143-146.

[7] Ferrer I，Thurman E M.J.Chromatogr.A，2010,1217(25)：4127-4134.

[8] Liu X X，Ding L，Liu J X，Zhang Y，Huang Z Q，Wang L B，Chen B.Chin.J.Chromatogr.(劉曉霞，丁利，劉錦霞，張瑩，黃志強(qiáng)，王立兵，陳波. 色譜)，2010,28(11)：1020-1025.

[9] Liu L M，Peng J D.J.Instrum.Anal.(劉麗敏，彭敬東. 分析測試學(xué)報)，2008,27(5)：549-552.

[10] Ordonez E Y，Quintana J B，Rodil R，Cela R.J.Chromatogr.A，2012,1256(21)：197-205.

[11] Gan Z，Sun H，Wang R，F(xiàn)eng B.J.Chromatogr.A，2013,1274(25)：87-96.

[12] Sacher F，Raue B，Brauch H.J.Chromatogr.A，2005,1085(1)：117-123.

[13] Echeverria S，Borrull F，F(xiàn)ontanals N，Pocurull E.Talanta，2013,116：931-936.

[14] Dong L L，Yu L，Li M，Wang L C.J.Instrum.Anal.(董麗麗，于玲，李敏，王立川. 分析測試學(xué)報)，2013,32(6)：742-746.

[15] Verenitch S S，Lowe C J，Mazumder A.J.Chromatogr.A，2006,1116(1 /2)：193-203.

[16] Hillebrand O，Nodler K，Licha T，Stuter M，Geyer T.WaterRes.，2012,4(2)：395-402.

[17] Scheurer M，Brauch H J，Lange F T.Anal.Bioanal.Chem.，2009,394(6)：1585-1594.

Rapid Determination of Five Artificial Sweeteners,Six Iodinated X-ray Contrast Agents and Caffeine in Different Water Samples by Solid Phase Extraction with Ultra Performance Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry

YANG Yuan-yuan1,2,YING Guang-guo1*,ZHAO Jian-liang1,LIU You-sheng1,LIU Wang-rong1

(1.State Key Laboratory of Organic Geochemistry,Guangzhou Institute of Geochemistry,Chinese Academy of Sciences, Guangzhou 510640,China;2.The University of Chinese Academy of Science,Beijing 100049,China)

An ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometric(UPLC-MS/MS) method was developed for the rapid determination of 5 artificial sweeteners,6 iodinated X-ray contrast agents and caffeinein in various water samples(surface water,inflow and effluent for wastewater treatment plant). The filtered water samples were extracted,and purified through HR-X solid phase extraction cartridges and separated on a Zorbax SB-C18column. The determination of analytes was performed under multiple reaction monitoring(MRM) mode using acetonitrile-water(10 mmol/L ammonium acetate,0.01% formic acid) and acetonitrile-water(5 mmol/L ammonium acetate,1 mmol/L Tris) as mobile phases in positive ionization mode and negative ionization mode,respectively. The calibration curves of the target compounds were linear in the range of 5-5 000 μg/L with correlation coefficients more than 0.998. The recoveries of the target compounds in surface water,inflow and effluent were all between 70% and 120%,with relative standard deviations(RSD) of 0.8%-19.0%. The method detection limits(MDL) for three types of water samples were in the ranges of 0.43-13.8 ng/L,1.80 -34.8 ng/L and 2.30-134 ng/L,respectively. The method was successfully applied in the determination of artificial sweeteners,iodinated X-ray contrast agents and caffeine in different actual water samples collected from a wastewater treatment plant and its receiving river from Guangzhou city. Except for aspartame,iothalamic acid,iopromide and iomeprol,the other compounds were all detected with high concentrations. The established method is accurate,sensitive and simple,and is suitable for the determination of artificial sweeteners,iodinated X-ray contrast agents and caffeine in various environmental water samples.

artificial sweeteners；iodinated X-ray contrast agents；caffeine；ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry(UPLC-MS/MS)；water samples

2016-06-21；

2017-01-13

東江流域飲用水源型河流水質(zhì)安全保障技術(shù)集成與綜合示范(2014ZX07206-005)；國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(U1401235)

10.3969/j.issn.1004-4957.2017.07.006

O657.63；O741.6

A

1004-4957(2017)07-0876-06

*通訊作者：應(yīng)光國，博士，研究員，研究方向：環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)，Tel：020-85290200，E-mail：guang-guo.ying@gig.ac.cn；guangguo.ying@gmail.com