余紅璐,任亞君,熊枝繁

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430077;*通訊作者,E-mail:xiongzhifan@126.com)

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PTP1B和Sam68在結(jié)直腸癌中的表達(dá)及其意義

余紅璐,任亞君,熊枝繁*

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院消化內(nèi)科,武漢 430077;*通訊作者,E-mail:xiongzhifan@126.com)

目的 觀察蛋白酪氨酸磷酸酶1B(PTP1B)及Sam68(Src-associated substrated during mitosis of 68KD)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展中的表達(dá)及其相關(guān)性,探究其與結(jié)直腸癌臨床病理特征的關(guān)系。 方法 采用免疫組織化學(xué)(SABC)法檢測53例結(jié)直癌組織及20例癌旁正常組織中PTP1B、Sam68的表達(dá)情況,并結(jié)合臨床病理學(xué)資料進(jìn)行統(tǒng)計分析;采用Western blotting方法檢測12例結(jié)直腸癌組織及對應(yīng)癌旁正常組織中的PTP1B及Sam68蛋白表達(dá)情況。 結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示PTP1B、Sam68在結(jié)直腸癌組織的陽性表達(dá)率明顯高于正常大腸組織,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.001)。PTP1B、Sam68的表達(dá)均與分化程度、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)(P<0.05);相關(guān)性分析顯示,PTP1B與Sam68表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.463,P<0.001)。Western blotting檢測結(jié)果顯示結(jié)直腸癌組織中PTP1B和Sam68的蛋白表達(dá)量明顯高于癌旁正常組織(P<0.05)。 結(jié)論 PTP1B、Sam68可能與大腸癌的發(fā)生、浸潤及轉(zhuǎn)移有關(guān),兩者共同促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。

結(jié)直腸癌; 蛋白酪氨酸磷酸酶1B; Sam68; 免疫組織化學(xué); Western blotting

結(jié)直腸癌(colorectal cancer,CRC)是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅著人類的生命和健康。近年來隨著人們生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)直腸癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增加的趨勢。PTPlB是一種典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,在糖代謝和脂代謝信號通路中起重要作用,被認(rèn)為是抗2型糖尿病和肥胖的潛在靶點。糖尿病相關(guān)的研究顯示，PTP1B可通過胰島素信號通路中的絲氨酸/蘇氨酸激酶途徑抑制胰島素受體及其底物絲氨酸殘基的磷酸化從而導(dǎo)致胰島素受體下調(diào)引發(fā)糖尿病[1]。在脂代謝方面,PTP1B過表達(dá)可通過誘導(dǎo)VLDL過多生成而影響脂蛋白分泌,從而引起脂代謝紊亂而致糖尿病[2]。越來越多的研究表明PTPlB與腫瘤具有相關(guān)性[3]?，F(xiàn)有文獻(xiàn)[4]表明,其對腫瘤的作用具有雙向性,即可以促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,也可以抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,這主要取決于其相應(yīng)的作用底物及所處的細(xì)胞環(huán)境,PTPlB可作用于p-Catenin、 p130Cas、Jak2和Met等分子發(fā)揮抑癌基因作用,作用于Src、 p62dok、cortactindras、Crk Ⅱ等分子則發(fā)揮癌基因的作用。Chen等[5]已證實在結(jié)直腸癌中PTP1B主要發(fā)揮癌基因的作用。Sam68蛋白(Src-associated substrated during mitosis of 68KD)是RNA激活蛋白家族成員之一,研究表明Sam68蛋白能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[6]。Sam68可作為一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和RNA激活蛋白參與細(xì)胞周期的調(diào)控,它通過影響細(xì)胞增殖和凋亡與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化高度相關(guān)[7]。Liao等[8]已證實在結(jié)直腸癌中存在Sam68的過度表達(dá),其過表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌的發(fā)生與發(fā)展。

目前,國內(nèi)外關(guān)于PTP1B致癌機(jī)制的研究尚未明了,其與Sam68之間關(guān)系尚不清楚。我們應(yīng)用免疫組化及Western blotting方法檢測PTP1B及Sam68在大腸癌組織中的表達(dá)，并分析兩者之間的相關(guān)性,探討其與大腸癌發(fā)生、發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬梨園醫(yī)院、協(xié)和醫(yī)院2005-2014年病理科存檔石蠟包埋組織33例及2014-09～2015-05手術(shù)切除的大腸癌組織20例,同時取距離腫瘤>10 cm正常組織20例作為對照,新鮮組織標(biāo)本取材后一份用4%多聚甲醛固定,一份立即置于-80 ℃冰箱中凍存。所有病例術(shù)前未行任何抗腫瘤治療,均無糖尿病、糖耐量異常病史,術(shù)后均經(jīng)病理證實。大腸癌53例,男33例,女20例;年齡31-75歲,平均年齡54.0歲;其中結(jié)腸癌26例,直腸癌27例;高中分化癌36例,低分化癌17例;TNM分期中Ⅰ期+Ⅱ期35例,Ⅲ期+Ⅳ期18例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有18例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的有35例。

1.2 主要試劑

鼠抗人多克隆PTP1B抗體及兔抗人單克隆Sam68抗體購自abcam公司,免疫組化用PTP1B抗體及Sam68抗體 均按1 ∶500稀釋,Western blotting所用PTP1B抗體及Sam68抗體 按1 ∶1 000稀釋。所有二抗購自美國Pierce公司,三抗購自Sigma公司。ECL發(fā)光液、BCA蛋白濃度測定試劑盒及DAB試劑盒均購自Thermo Scientific公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 免疫組化(SABC)法檢測PTP1B及Sam68的表達(dá) 所有53例標(biāo)本均由4%多聚甲醛固定,常規(guī)脫水,透明,石蠟包埋,4 μm連續(xù)石蠟切片,烤片,脫蠟,入水,破膜,抗原位于胞質(zhì)則用pH6.0檸檬酸液中微波熱修復(fù),抗原位于胞核則用pH9.0 EDTA液中微波修復(fù);PBS清洗;加 3%H2O2于37 ℃溫箱中避光反應(yīng) 30 min,PBS清洗;;加4%BSA于37 ℃溫箱反應(yīng)30 min,甩液,加一抗,4 ℃孵育過夜后室溫復(fù)溫2 h,PBS清洗;加二抗,37 ℃溫箱孵育1 h,PBS清洗;加SABC液37 ℃孵育1 h,PBS清洗;DAB顯色,蘇木素復(fù)染,脫水,透明,封片。 以PBS代替一抗為陰性對照,以購買試劑時所附陽性圖片為陽性對照。

1.3.2 免疫組化結(jié)果判定 每例切片隨機(jī)抽取5個高倍鏡視野,腫瘤細(xì)胞陽性率分值為:<10%,0分;10%-25%,1分; 26%-50%,2分;51%-75%,3分;>75%,4 分;染色強(qiáng)度評分為:無色,0分;淡黃色,1分;棕黃色,2分;棕褐色,3分。 兩者得分相乘,≤2分為陰性;≥3分為陽性。

1.3.3 Western blotting法檢測PTP1B及Sam68的表達(dá) 將-80 ℃冰箱中凍存的組織標(biāo)本取出稱重,每100 mg加入500 μl蛋白裂解液,置勻漿器中反復(fù)研磨,使組織充分勻漿化,冰上充分裂解30 min,12 000 r/min離心收集上清,用BCA法測上清蛋白濃度。將蛋白于10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,電轉(zhuǎn)膜1.5 h,5%脫脂牛奶封閉2 h后,分別加入PTP1B鼠抗人多克隆抗體(1 ∶1 000),Sam68兔抗人單克隆抗體(1 ∶1 000)及GAPDH小鼠抗人單克隆抗體(1 ∶2 000),4 ℃孵育過夜,TBST漂洗,分別加辣根酶標(biāo)記山羊抗兔及山羊抗小鼠二抗(1 ∶2 000),37 ℃搖床孵育2 h,TBST漂洗,加入ECL發(fā)光試劑暗室曝光,所得條帶利用IPP軟件分析,共檢測分析12例。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析,其中相關(guān)性分析采用Spearman等級相關(guān)分析,用百分率表示計數(shù)資料,運(yùn)用χ2檢驗分析PTP1B及Sam68的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系,PTP1B及Sam6蛋白在癌組織與正常組織中的相對表達(dá)量比較采用t檢驗,P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測PTP1B、Sam68蛋白在大腸癌和正常組織中的表達(dá)

PTP1B主要表達(dá)在細(xì)胞的胞質(zhì)和/或胞核,為棕黃色顆粒(見圖1)。PTP1B在正常組織、大腸癌組織中表達(dá)的陽性率分別為10.0%(2/20)和69.8%(37/53),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。Sam68主要表達(dá)在細(xì)胞的胞核,為棕黃色顆粒(見圖2);Sam68在正常組織、大腸癌組織中表達(dá)的陽性率分別為15.0%(3/20)、69.8%(37/53),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

A.正常大腸組織 B.大腸癌組織圖1 免疫組化檢測PTP1B在大腸癌組織及正常大腸組織中的表達(dá) (×400)Figure 1 Expression of PTP1B in colorectal cancer tissues and normal colorectal tissues (×400)

A.正常大腸組織 B.大腸癌組織圖2 免疫組化檢測Sam68在大腸癌組織及正常大腸組織中的表達(dá) (×400)Figure 2 Expression of Sam68 in colorectal cancer tissues and normal colorectal tissues (×400)

2.2 PTP1B、Sam68在大腸癌中的表達(dá)與大腸癌臨床病理特征的關(guān)系

PTP1B、Sam68的表達(dá)在不同性別、年齡、部位,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);而在不同分化程度、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05,見表1)。

2.3 PTP1B、Sam68在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

經(jīng)Spearman等級相關(guān)性分析,兩者在大腸癌組織中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.463,P<0.001,見表2)。

2.4 Western blotting法檢測結(jié)直腸癌組織中PTP1B、Sam68蛋白表達(dá)水平

結(jié)果顯示,PTP1B在大腸癌組織中的表達(dá)水平(0.503 3±0.182 3)明顯高于癌旁正常組織(0.221 4±0.067 3),兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.362,P<0.05,見圖3);Sam68在大腸癌組織中的表達(dá)水平(0.387 9±0.190 8)也明顯高于對應(yīng)的癌旁正常組織(0.161 8±0.089 9),兩組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.191,P<0.05,見圖4)。

表1 PTP1B及Sam68在大腸癌中的表達(dá)及與大腸癌臨床病理特征之間的相關(guān)性 例(%)

Table 1 Expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer patients with different clinicopathological features cases(%)

臨床病理特征 nPTP1BSam68陽性χ2P陽性χ2P性別1467022614670226 男3325(758)25(758) 女2012(600)12(600)年齡1187017200070993 ≤60歲3623(639)25(694) ≥60歲1714(824)12(706)部位2908008802580611 結(jié)腸2621(808)19(731) 直腸2716(593)18(667)分化程度4031004540310045 高中分化3622(611)22(611) 低分化1715(882)15(882)TNM分期3970004661020014 Ⅰ期+Ⅱ期3522(629)22(629) Ⅲ期+Ⅳ期1816(889)17(944)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移3970004661020014 有1816(889)17(944) 無3522(629)22(629)

表2 PTP1B、Sam68在大腸癌組織中表達(dá)的相關(guān)性

Table 2 Correlation between the expression of PTP1B and Sam68 in colorectal tissues

PTP1BSam68+-rP+3160463P<0001-610

圖3 Western blotting檢測PTP1B蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 3 Expression of PTP1B protein in colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumor tissues by Western blotting

圖4 Western blotting法檢測Sam68蛋白在結(jié)直腸癌及癌旁正常組織中的表達(dá)Figure 4 Expresion of Sam68 protein in colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumor tissues by Western blotting

3 討論

在中國結(jié)直腸癌是十大惡性腫瘤之一,隨著我國現(xiàn)代化程度和生活水平的提高,人們的飲食結(jié)構(gòu)及生活方式發(fā)生了較大變化,致使結(jié)直腸癌的發(fā)病率逐年增加,發(fā)病率居第3位,死亡率居第5位。研究[9]表明,如果結(jié)直腸癌能在早期被發(fā)現(xiàn),約90%的病人可以通過外科手術(shù)治愈,但由于絕大多數(shù)患者發(fā)病早期無明顯癥狀,經(jīng)常是在進(jìn)展期才被診斷,所以嚴(yán)重影響了結(jié)直腸癌的治療和預(yù)后,因此,加強(qiáng)尋找與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后相關(guān)的分子標(biāo)志物對其診斷、臨床分期、個體化治療方案制定及預(yù)后評估具有重要臨床意義。

酪氨酸磷酸化是信號傳導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)中的重要調(diào)節(jié)步驟,參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、生存、分化、遷移和凋亡等過程[10]。酪氨酸磷酸化由蛋白酪氨酸激酶(protein tyrosine kinases,PTKs)和蛋白酪氨酸磷酸酶(protein tyrosine phosphatases,PTPs)協(xié)同調(diào)控,當(dāng)PTP表達(dá)或活性調(diào)控失常時,可導(dǎo)致信號通路紊亂,從而促進(jìn)多種疾病的發(fā)生,包括腫瘤、糖尿病和炎癥等。 蛋白酪氨酸磷酸酶1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B)是PTPs超家族成員之一,最初是作為一個分子量為37 kDa的催化結(jié)構(gòu)域從人胎盤組織中所提取,PTP1B基因定位于人20號染色體q13,在許多癌癥中發(fā)現(xiàn)該區(qū)域存在癌基因和基因增殖。PTP1B是一種典型的非跨膜性蛋白酪氨酸磷酸酶,在代謝信號通路中起重要作用,被認(rèn)為是抗 2型糖尿病和肥胖的潛在靶點。越來越多的研究[3]表明PTP1B與腫瘤具有相關(guān)性,其在腫瘤的發(fā)生中具有促進(jìn)作用。例如,PTP1B在胃癌細(xì)胞中過表達(dá),抑制PTP1B的表達(dá)在體內(nèi)外可明顯抑制胃癌細(xì)胞的生長,PTP1B在胃癌組織中的過表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移和TNM分期密切相關(guān)[3]。此外,PTP1B還在多種腫瘤中存在過表達(dá),如上皮來源的腫瘤、乳腺癌[11]和前列腺癌[12]。然而也有研究表明PTPlB是個腫瘤抑制因子,與癌旁正常黏膜相比,PTP1B mRNA在食管癌中的表達(dá)明顯下降[4]。因此PTP1B在腫瘤的發(fā)生中的作用仍存爭議,需要進(jìn)一步探討。近來,ZhuS等[13]的研究證實在結(jié)腸癌細(xì)胞中,PTP1B的過度表達(dá)與c-Src中529位點殘基的磷酸化抑制能力降低有關(guān),導(dǎo)致了軟瓊脂中菌落的快速形成以及免疫缺陷小鼠中腫瘤生長的加速,從而加速結(jié)腸癌細(xì)胞的生長。本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中PTP1B的蛋白表達(dá)水平及陽性率均高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),在蛋白水平證明了PTP1B是影響腫瘤發(fā)生的重要因素,此結(jié)果與國內(nèi)外報道一致,可以說明PTP1B確實是惡性侵襲性腫瘤的一個敏感性指標(biāo);同時發(fā)現(xiàn)PTP1B在大腸癌組織中的表達(dá)與性別、年齡、部位無關(guān),而與分化程度、TNM分期、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明PTP1B與結(jié)直腸癌患者癌癥進(jìn)展密切相關(guān),隨腫瘤進(jìn)展程度越高,其陽性表達(dá)率越高,這與Chen等[5]的研究一致。提示PTP1B高表達(dá)可能是結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的一個普遍性事件,高表達(dá)的PTP1B可能成為結(jié)直腸癌侵襲程度的一個判斷指標(biāo),其可能機(jī)制是PTP1B的過度表達(dá)激活了Akt、Erk1/2、FAK和Src從而促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。

Sam68是sTAR蛋白家族的代表成員之一,也稱為RNA結(jié)合蛋白,分子量約為68 kDa,在有絲分裂過程中是酪氨酸蛋白激酶Src的底物。Sam68能與多種信號傳導(dǎo)蛋白結(jié)合,包括Grb2、Nck、rasGAP、蛋白酪氨酸激酶Src和ItK。Paronetto等[14]報道,在人的前列腺癌組織中Sam68被磷酸化,而癌旁組織和良性增生組織都無Sam68的磷酸化。Sam68被Src激酶磷酸化后與RNA的結(jié)合力降低,可引起調(diào)控細(xì)胞周期的基因在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)異常,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。近年來,多項研究發(fā)現(xiàn)Sam68在人類惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào),主要包括了宮頸癌[15]、非小細(xì)胞肺癌[16]、結(jié)腸癌[8],并發(fā)現(xiàn)sam68與腫瘤細(xì)胞增殖及進(jìn)展密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn),結(jié)直腸癌組織中Sam68的蛋白表達(dá)水平及陽性率均高于癌旁正常組織,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),說明Sam68的高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生,且結(jié)合臨床病理資料分析發(fā)現(xiàn)其在大腸癌組織中的高表達(dá)與性別、年齡、部位無關(guān),而與分化程度、TNM分期及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),說明Sam68與結(jié)直腸癌患者癌癥進(jìn)展密切相關(guān),隨腫瘤進(jìn)展程度越高,其陽性表達(dá)率越高,這與Liao等[8]的研究結(jié)果一致。以上結(jié)論表明,Sam68很可能具有癌基因的特性,在大腸癌的發(fā)生中起重要作用,但其具體機(jī)制尚不明確,有待進(jìn)一步探究。

相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn),PTP1B與Sam68蛋白在大腸癌組織中表達(dá)呈正相關(guān),且隨著TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的增加,兩者的表達(dá)均升高,提示兩者共同促進(jìn)大腸癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移。之前有研究[4]表明PTP1B作用于Scr發(fā)揮癌基因的作用,而在有絲分裂中Sam68是Scr的作用底物,Sam68被Src激酶磷酸化后與RNA的結(jié)合力降低,可引起調(diào)控細(xì)胞周期的基因在轉(zhuǎn)錄后表達(dá)異常,導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。因此通過實驗結(jié)果,我們可推測出通過Scr為橋梁也許PTP1B與Sam68之間可能具有協(xié)同作用。兩者聯(lián)合檢測對大腸癌的診斷有一定意義,同時我們推測聯(lián)合應(yīng)用兩者的抑制劑可能為大腸癌的治療提供又一新的方向。但兩者在腫瘤發(fā)生進(jìn)展中相互作用的具體機(jī)制目前尚不完全明了,下一步需進(jìn)一步增加樣本量進(jìn)行研究探討。

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Expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer and its significance

YU Honglu,REN Yajun,XIONG Zhifan*

(DepartmentofDigestion,LiyuanHospitalAffiliatedtoTongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430077,China;*Correspondingauthor,E-mail:xiongzhifan@126.com)

ObjectiveTo investigate the expression of PTP1B and Sam68 in human colorectal cancer tissues,and its relationships with clinicopathological parameters.MethodsImmunohistochemistry was used to detect the expression of PTP1B and Sam68 in 53 cases of colorectal cancer tissues and 20 cases of normal tissues.The expression of PTP1B and Sam68 was compared between patients with different clinicopathological features of colorectal cancer.The expression of PTP1B and Sam68 in 12 cases of colorectal cancer tissues and matched adjacent non-tumorous tissues was detected by Western blotting.ResultsThe results of immunohistochemistry demonstrated that the positive expression rates of PTP1B and Sam68 protein in 53 cases of colorectal cancer were significantly higher than those of normol tissues(P<0.001).The expression of PTP1B and Sam68 in colorectal cancer was significantly different in patients with different differentiation,TNM stage and lymph node matastasis(P<0.05).The expression of PTP1B and Sam68 was positively correlated(r=0.463,P<0.001).Western blotting results showed that the expression of PTP1B and Sam68 protein in colorectal cancer was significantly higher than that of matched adjacent non-tumor tissues.ConclusionThe expression of PTP1B and Sam68 protein may be related to the development,metastasis and invasion of human colorectal cancer,and they may synergistically promote the development of colorectal carcinoma.

colorectal cancer; PTP1B; Sam68; immunohistochemistry; Western blotting

余紅璐,女,1990-05生,在讀碩士,E-mail:yuhonglu664@163.com

2017-02-17

R735.3

A

1007-6611(2017)06-0596-06

10.13753/j.issn.1007-6611.2017.06.019