潘劍茹，陳莉娟，何火聰，蘇穎，王香玲，李嫻，陳翠煌，吳倫巧，劉樹(shù)滔

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全長(zhǎng)SOD2重組蛋白的可溶表達(dá)、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng)

潘劍茹1，陳莉娟1，何火聰2，蘇穎2，王香玲1，李嫻1，陳翠煌1，吳倫巧1，劉樹(shù)滔1

1 福州大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，福建福州 350108 2 福建省科技廳轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室福建醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院福建省腫瘤醫(yī)院放射生物學(xué)及腫瘤放射治療學(xué)研究室，福建福州 350014

潘劍茹, 陳莉娟, 何火聰, 等. 全長(zhǎng)SOD2重組蛋白的可溶表達(dá)、純化、穩(wěn)定性與跨膜效應(yīng). 生物工程學(xué)報(bào), 2017, 33(7): 1168–1177.Pan JR, Chen LJ, He HC, et al. Expression, purification, stability and transduction efficiency of full-length SOD2 recombinant proteins. Chin J Biotech, 2017, 33(7): 1168–1177.

超氧化物歧化酶(SOD) 家族是保護(hù)細(xì)胞免受正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧 (ROS) 毒性所必需的，含Mn2+離子的超氧化物歧化酶 (Mn-SOD，SOD2) 是其中最重要的一種。本研究合成了人源SOD2全基因序列，并將其插入帶有GST的原核表達(dá)載體pGEX-4T-1中，成功構(gòu)建了GST-SOD2融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒。然后，將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，用IPTG在25 ℃下誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，得到可溶性GST-SOD2融合蛋白，經(jīng)GST親和樹(shù)脂純化得到比活為1 788 U/mg的純蛋白，分子量約為46 kDa。利用凝血酶切去GST標(biāo)簽后經(jīng)肝素親和柱純化得到了電泳純的SOD2重組蛋白，該蛋白分子量約為25 kDa，與SOD2全長(zhǎng)序列的理論分子量相符，比活為2 000 U/mg。兩種重組SOD2蛋白在生理?xiàng)l件下都具有良好的SOD活性，且都具有顯著的跨膜能力 (<0.05)。這些工作為深入研究?jī)煞N全長(zhǎng)重組SOD2蛋白的結(jié)構(gòu)與生物效應(yīng)建立了基礎(chǔ)。

Mn超氧化物歧化酶，構(gòu)建，融合蛋白，表達(dá)純化，穩(wěn)定性，跨膜效應(yīng)

超氧化物歧化酶 (SOD) 家族是保護(hù)氧利用細(xì)胞免受正常代謝過(guò)程中產(chǎn)生的活性氧 (ROS) 毒性所必需的。除了保護(hù)性蛋白質(zhì)，這些酶也是調(diào)節(jié)細(xì)胞生理學(xué)信號(hào)通路的關(guān)鍵組件。SOD催化反應(yīng)，然后用過(guò)氧化氫酶 (CAT) 和過(guò)氧化物酶除去過(guò)氧化氫。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中存在3種已知形式的SOD：主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)現(xiàn)的含銅和鋅的超氧化物歧化酶 (Cu，Zn-SOD，SOD1)，在線粒體中發(fā)現(xiàn)的含錳超氧化物歧化酶 (Mn-SOD，SOD2) 和細(xì)胞外超氧化物歧化酶 (EC-SOD，SOD3)[1]。定位在線粒體的SOD2被認(rèn)為是3種SOD中最重要的一個(gè)，因?yàn)榫€粒體是主要的ROS生產(chǎn)位點(diǎn)[2]。Mn-SOD不僅對(duì)所有需氧生物的存活都是必需的[3]，還被證明是一種強(qiáng)大的保護(hù)和治療劑，可用于抗氧化應(yīng)激相關(guān)的疾病，如腎損傷[4]、關(guān)節(jié)炎[5]、慢性炎癥肺纖維化[5]以及電離輻射所引起的輻射損傷[6-8]。

Mn-SOD在細(xì)胞中以帶有線粒體靶向信號(hào)肽的前體形式合成，通過(guò)其2 kDa的前導(dǎo)序列進(jìn)入線粒體基質(zhì)，該肽隨后被切割，產(chǎn)生在線粒體內(nèi)起關(guān)鍵作用的成熟和具有酶活性的蛋白質(zhì)[9]。對(duì)人脂肪肉瘤細(xì)胞LSA中發(fā)現(xiàn)的30 kDa的人源SOD2異構(gòu)體 (LSA-type-Mn-SOD) 的系列研究結(jié)果表明，SOD2的前導(dǎo)肽還具有介導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞的能力[10-14]。利用原核系統(tǒng)重組表達(dá)SOD2時(shí)，為了得到可溶并具有酶活的蛋白，通常會(huì)把SOD2的前導(dǎo)肽序列去掉，直接表達(dá)單體成熟的蛋白，如王峰等曾利用pET15b質(zhì)粒在大腸桿菌Rosetta-gami菌株中表達(dá)得到N端His標(biāo)簽的可溶SOD2重組蛋白，比活為1 890 U/mg[15]。

然而，這種方法雖然可得到成熟和具有酶活性的SOD2，但失去前導(dǎo)肽的SOD2卻由于分子量的限制難以進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用。因此，上述SOD2的應(yīng)用多是以轉(zhuǎn)基因的形式進(jìn)行，這限制了SOD2重組蛋白的臨床應(yīng)用。

本研究合成了人源SOD2全長(zhǎng)基因，首次將其克隆至帶有GST標(biāo)簽的pGEX-4T-1質(zhì)粒，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2，轉(zhuǎn)化后表達(dá)得到GST-SOD2融合蛋白，并對(duì)表達(dá)得到的GST-SOD2融合蛋白以及酶切得到的全長(zhǎng)SOD2重組蛋白進(jìn)行純化、鑒定及穩(wěn)定性等研究。

1 材料與方法

1.1 材料

pGEX-4T-1質(zhì)粒、大腸桿菌DH5α、大腸桿菌BL21 (DE3) 均為本實(shí)驗(yàn)室保存；酶購(gòu)自TaKaRa公司；質(zhì)粒提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；各種限制性內(nèi)切酶購(gòu)自NEB公司；GST親和柱購(gòu)自生工生物工程上海(股份) 有限公司；IPTG、考馬斯亮藍(lán)R-250購(gòu)自AMRESCO公司；蛋白marker購(gòu)于Fermentas公司；DNA marker購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；基因合成與DNA測(cè)序由生工生物工程上海(股份) 有限公司進(jìn)行。SOD和GST活力檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所。牛凝血酶購(gòu)自北京博爾西科技有限公司。BCA蛋白含量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Thermo Scientific (美國(guó))。L-02人正常肝細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.2 質(zhì)粒的構(gòu)建

全基因合成人源全長(zhǎng)SOD2的基因序列，在其上、下游分別引入RⅠ和Ⅰ酶切位點(diǎn)，將其與pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切并經(jīng)膠回收純化，然后用T4 DNA連接酶將純化的SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒片段于4 ℃連接過(guò)夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑取單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進(jìn)行RⅠ和Ⅰ雙酶切鑒定，并將RⅠ和Ⅰ鑒定正確的陽(yáng)性克隆進(jìn)行DNA測(cè)序鑒定。

1.3 GST-SOD2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將DNA測(cè)序正確的陽(yáng)性克隆菌于37 ℃培養(yǎng)至600=0.6?0.8時(shí)，分別加入IPTG和MnSO4，誘導(dǎo)GST-SOD2融合蛋白表達(dá)，同時(shí)探索了誘導(dǎo)條件對(duì)表達(dá)量的影響。取誘導(dǎo)后的菌液，10 000 r/min離心2 min，棄上清收集菌體沉淀，一部分菌體直接加入SDS-PAGE電泳樣品處理液，用于檢測(cè)全菌蛋白；另一部分加入9倍體積的緩沖液1 (10 mmol/L Na2HPO4，1.8 mmol/L KH2PO4，2.7 mmol/L KCl，pH 7.3)，冰浴超聲破碎30 min，然后10 000 r/min離心20 min，取上清電泳。

用12.5% SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色，比較不同條件下的菌體全蛋白與超聲破碎上清中的蛋白比例，分析融合蛋白在不同條件下的表達(dá)情況，篩選較好的可溶表達(dá)條件。

1.4 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化

在最佳誘導(dǎo)條件下誘導(dǎo)GST-SOD2融合蛋白的表達(dá)，收集誘導(dǎo)后菌體超聲破碎的上清液，按照GST親和樹(shù)脂說(shuō)明書進(jìn)行層析，分別收集親和柱穿透峰和洗脫峰，進(jìn)行12.5%的SDS-PAGE。

SOD2重組蛋白純化：將GST-SOD2吸附到親和樹(shù)脂上，用大量平衡緩沖液洗去雜質(zhì)，往親和樹(shù)脂中加入牛凝血酶(1 U/mg融合蛋白)，22 ℃孵育16 h，放出洗脫峰1。再用1×PBS沖洗柱子，收集洗脫峰2。將洗脫峰1和洗脫峰2合并，加入肝素親和樹(shù)脂，按照柱子說(shuō)明書，收集肝素親和柱的穿透峰，進(jìn)行12.5%的SDS-PAGE。

1.5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2的鑒定

分別使用SOD和GST活力檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白的相應(yīng)酶活力，結(jié)合SDS-PAGE測(cè)定的蛋白分子量，鑒定是否為目標(biāo)蛋白。

1.6 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

取300 μL GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白，分別置于25 ℃、37 ℃、50 ℃、60 ℃、80 ℃的水浴中保溫30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測(cè)定殘留酶活力，分析融合蛋白的熱穩(wěn)定性。

取300 μL GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白，用廣泛緩沖液分別調(diào)至pH 4、5、6、7、8，4 ℃下放置30 min，取出，待回至室溫，取樣分別測(cè)定殘留酶活力，分析融合蛋白的pH穩(wěn)定性。

1.7 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

參照文獻(xiàn)[16]，分別用FITC標(biāo)記GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白。

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的L-02細(xì)胞用含15%小牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液配成單個(gè)細(xì)胞懸液，將其接種到24孔板，每孔40 000個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h。吸去培養(yǎng)液，加PBS清洗2次，往每孔中分別加入400 μL 42 μg/mL的FITC-蛋白，37 ℃作用3 h。吸去蛋白液，用PBS清洗2次，加入250 μL細(xì)胞裂解液 (0.5% Triton-X-100+0.1% SDS)，漩渦振蕩2 min，放置4 ℃冰箱15 min后，1 200 r/min離心5 min，取200 μL上清液用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)，并以BCA試劑盒測(cè)定上清液的蛋白含量。以每μg細(xì)胞蛋白所對(duì)應(yīng)的熒光強(qiáng)度來(lái)比較兩種融合蛋白的跨膜效率。

每組數(shù)據(jù)3個(gè)平行孔，采用Excel軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，作標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算、檢驗(yàn)等。>0.05為無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 pGEX-4T-1-SOD2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將合成的人源SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒均用RⅠ和Ⅰ內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，膠回收純化酶切后的SOD2基因片段和pGEX-4T-1質(zhì)粒片段，通過(guò)T4 DNA連接酶將SOD2基因定向插入到pGEX-4T-1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中。挑單菌落培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒進(jìn)行RⅠ和Ⅰ酶切鑒定，結(jié)果見(jiàn)圖1。重組子經(jīng)酶切鑒定后得到兩條目的帶，大約為4 946 bp和669 bp，分別與pGEX-4T-1質(zhì)粒和SOD2預(yù)期分子量一致。將酶切鑒定正確的質(zhì)粒進(jìn)行DNA 測(cè)序鑒定，測(cè)序結(jié)果與預(yù)期的序列一致，證明SOD2基因已經(jīng)成功插入pGEX-4T-1載體，pGEX-4T-1-SOD2重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2的構(gòu)建

2.2 GST-SOD2融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析

將重組質(zhì)粒pGEX-4T-1-SOD2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，收集菌體進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果如圖2、圖3和圖4所示。

由圖2可知，與未誘導(dǎo)的菌體相比，誘導(dǎo)溫度為20 ℃時(shí)，當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間超過(guò)5 h時(shí)，菌體超聲破碎液的上清中可溶融合蛋白的表達(dá)量變化不大。

由圖3可知，同樣誘導(dǎo)6 h，不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-SOD2融合蛋白的表達(dá)量與可溶表達(dá)有很大影響。誘導(dǎo)溫度為16 ℃，融合蛋白的表達(dá)量較低，隨著誘導(dǎo)溫度的增加，融合蛋白的表達(dá)量隨之增加。但當(dāng)誘導(dǎo)溫度達(dá)到37 ℃時(shí)，菌體超聲破碎液的上清中融合蛋白量開(kāi)始降低，這表明可能有部分融合蛋白形成了包涵體。由圖3可知，最佳誘導(dǎo)溫度為25 ℃。

圖2 誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)GST-SOD2融合蛋白可溶表達(dá)量的影響

圖3 誘導(dǎo)溫度對(duì)GST-SOD2融合蛋白可溶表達(dá)量的影響

由圖4可知，Mn2+濃度對(duì)GST-SOD2融合蛋白的可溶表達(dá)量影響不大 (圖4A)，但它會(huì)影響GST-SOD2融合蛋白的活性 (圖4B)。隨著Mn2+濃度的增加，GST-SOD2融合蛋白的活性逐漸增加，當(dāng)Mn2+濃度達(dá)到1.5 mmol/L時(shí)，融合蛋白的活性達(dá)到最大值，隨著Mn2+濃度的繼續(xù)增加 (1.5?3.0 mmol/L)，融合蛋白的活性基本不變，但當(dāng)Mn2+濃度繼續(xù)加大時(shí)，融合蛋白的活性反而隨Mn2+濃度的加大而減小。為此，將最佳Mn2+濃度定為1.5 mmol/L。

圖4 Mn2+濃度對(duì)GST-SOD2融合蛋白表達(dá)量和活性的影響

2.3 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化與鑒定

GST-SOD2表達(dá)菌超聲破碎后，收集上清，使用GST親和柱純化后，最終得到純化的GST-SOD2融合蛋白，將吸附在GST親和柱上的GST-SOD2融合蛋白經(jīng)牛凝血酶柱上酶切及肝素柱去凝血酶后，得到純化的SOD2重組蛋白，結(jié)果如圖5所示。

GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白的理論分子量分別為51 kDa和25 kDa左右，圖5中GST-SOD2融合蛋白和SOD2重組蛋白的實(shí)際分子量分別約為46 kDa和25 kDa。由于GST-SOD2融合蛋白是由SOD2和GST兩種抗氧化酶融合而得的獨(dú)特蛋白，同時(shí)具有SOD和GST活力，因此我們進(jìn)一步使用SOD和GST檢測(cè)試劑盒分別測(cè)定了該蛋白的酶活力。結(jié)果表明，純化所得的GST-SOD2融合蛋白的SOD活力為1 788 U/mg，GST活力為150 U/mg，純化所得的SOD2重組蛋白的SOD活力為2 000 U/mg。綜合分子量與活性分析的結(jié)果，可確認(rèn)GST-SOD2融合蛋白得到正確表達(dá)，其酶切所得SOD2重組蛋白為預(yù)期的蛋白。

圖5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的純化

2.4 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

由圖6-A可以看出，溫度對(duì)兩種蛋白的SOD活力影響都很大。隨溫度的升高，GST-SOD2融合蛋白的SOD活力幾乎是直線下降，當(dāng)熱處理溫度達(dá)到60 ℃時(shí)，SOD活力基本完全喪失。與GST-SOD2相比，SOD2重組蛋白的熱穩(wěn)定性相對(duì)較高，在熱處理溫度小于40 ℃時(shí)，其活性變化不大，但當(dāng)熱處理溫度超過(guò)40 ℃時(shí)，隨溫度的升高，SOD2重組蛋白的酶活開(kāi)始迅速下降，在60 ℃水浴30 min后，活力僅余約9%，在80 ℃水浴30 min后，活力接近于0。

圖6 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的穩(wěn)定性

由圖6-B可以看出，pH對(duì)兩種蛋白的酶活也有很大影響。GST-SOD2融合蛋白的SOD活力在pH≤7的范圍內(nèi)隨pH的降低而降低，在pH 7?8的范圍內(nèi)活力緩慢增加，當(dāng)pH超過(guò)8后，活性隨pH的升高而降低。pH對(duì)SOD2重組蛋白酶活的影響趨勢(shì)與GST-SOD2融合蛋白的相似，但SOD2重組蛋白在pH 7?8的范圍內(nèi)活力基本不變，且其整體的pH穩(wěn)定性高于GST-SOD2融合蛋白。

2.5 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

為檢測(cè)兩種蛋白是否能進(jìn)入細(xì)胞，將它們進(jìn)行FITC標(biāo)記后通過(guò)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化檢測(cè)其對(duì)正常人肝細(xì)胞株L-02的跨膜效果，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知，與正常對(duì)照相比，兩種融合蛋白都有顯著的跨膜能力 (<0.05)，在42 μg/mL的劑量下，SOD2重組蛋白比GST-SOD2融合蛋白的跨膜效果略強(qiáng)一些，約為后者的1.1倍，但二者之間沒(méi)有顯著差異。

圖7 GST-SOD2融合蛋白與SOD2重組蛋白的跨膜效應(yīng)

3 討論

超氧陰離子是引起機(jī)體氧化損傷特別是放射副作用的主要原因之一，SOD是唯一一種可以清除超氧陰離子的天然酶，在抗氧化損傷方面具有重要應(yīng)用價(jià)值。人源的3種SOD中，SOD2最為重要，因?yàn)槠湓赗OS的發(fā)源地線粒體中發(fā)揮效用[2]，該蛋白在細(xì)胞中以前體形式合成，通過(guò)其信號(hào)肽進(jìn)入線粒體基質(zhì)后，去除信號(hào)肽，折疊成成熟蛋白質(zhì)發(fā)揮功能[9]?，F(xiàn)有的體外重組人源SOD2基本都去除了前導(dǎo)肽片段以得到成熟有活性的酶，但失去前導(dǎo)肽的SOD2是無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞發(fā)揮作用的，故此，SOD2功能研究雖多，但多是以轉(zhuǎn)基因的方式進(jìn)行，臨床應(yīng)用頗有不便。

本研究選用pGEX-4T-1質(zhì)粒載體，利用載體自帶的GST，融合全長(zhǎng)人源SOD2，構(gòu)建得到GST-SOD2融合蛋白。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在N端融合的GST的幫助下，GST-SOD2融合蛋白實(shí)現(xiàn)了可溶表達(dá)，其可溶表達(dá)量受誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)溫度影響。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)條件的優(yōu)化，最終確定在25 ℃時(shí)，往培養(yǎng)基中添加1.5 mmol/L Mn2+，然后利用IPTG誘導(dǎo)得到可溶的GST-SOD2融合蛋白。經(jīng)GST親和樹(shù)脂純化得到的純GST-SOD2融合蛋白比活為1 788 U/mg，比王峰等所得到的重組成熟SOD2蛋白的活性[15]略低一些。但其分子量幾乎是SOD2蛋白的2倍，因此，在同樣的摩爾濃度下，GST-SOD2的酶活為重組成熟SOD2蛋白2倍左右。在此基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步通過(guò)超聲破碎、GST親和柱吸附、凝血酶柱內(nèi)酶切及肝素親和柱去除凝血酶得到了電泳純的SOD2重組蛋白，該蛋白分子量與SOD2全長(zhǎng)序列的理論分子量相符，比活為2 000 U/mg，比王峰等所得到的重組成熟SOD2蛋白的活性[15]還略高一些。

在順利得到兩種具有酶活性的全長(zhǎng)SOD2蛋白后，本研究對(duì)兩種蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，溫度和pH對(duì)兩種蛋白都有比較大的影響，但在生理?xiàng)l件 (37 ℃，pH 7.0) 下，GST-SOD2融合蛋白分別持有73.7%和91.6%的酶活性，去除GST標(biāo)簽后，SOD2重組蛋白的溫度和pH穩(wěn)定性均有所增強(qiáng)，在37 ℃下，該蛋白具有95.7%酶活性，在pH 7?8的范圍內(nèi)，該蛋白基本保持100%酶活性。

GST是一個(gè)高度可溶的蛋白，可以利用它增加外源蛋白的可溶性及其在大腸桿菌中的表達(dá)量。作為常用的重組標(biāo)簽之一，GST天然分子量為26 kDa，與His標(biāo)簽要大得多，可能會(huì)對(duì)融合在一起的外源蛋白的結(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生影響。本研究中兩種蛋白穩(wěn)定性的差異表明GST標(biāo)簽的融合對(duì)SOD2重組蛋白的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的影響，這可能也是使GST-SOD2融合蛋白表觀分子量和理論分子量有所差別以及兩種具有全長(zhǎng)序列的SOD2重組蛋白同時(shí)具有酶活性但比活又有差異的原因。

Mancini等從人脂肪肉瘤細(xì)胞LSA中發(fā)現(xiàn)一種具有SOD2酶活性的蛋白 (LSA-type-Mn-SOD)，30 kDa的LSA-type-MnSOD的序列與正常的人SOD2幾乎完全相同，但其N端帶有完整的信號(hào)肽[10-11]。已在大腸桿菌中生產(chǎn)得到該蛋白的重組蛋白，并已證實(shí)這種形式的SOD2可通過(guò)N端信號(hào)肽的介導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞，其在清除內(nèi)部和細(xì)胞外自由基以及改善與增加的氧化應(yīng)激相關(guān)的病理狀況方面非常有效[12-14]。本研究得到的SOD2重組蛋白，N端帶有完整的信號(hào)肽，具有成熟SOD2的酶活性，還有顯著的跨膜能力，與LSA-type-MnSOD十分相似，可知其在防護(hù)氧化損傷方面具有很大的潛力。在GST-SOD2融合蛋白中，SOD2的信號(hào)肽位于兩種蛋白的中間，具有成熟SOD2的酶活性，也有顯著的跨膜能力，這表明該信號(hào)肽的介導(dǎo)跨膜能力可能像TAT穿膜肽一樣，不受其在蛋白中所處的位置影響，這有待進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來(lái)證明。

GST在增加重組蛋白的可溶性之余，本身是一種在解毒過(guò)程中具有重要作用的轉(zhuǎn)移酶，具有抗氧化活性，可催化親核性的谷胱甘肽與自由基的結(jié)合反應(yīng)，起到解毒作用[17-18]。

本所前期實(shí)驗(yàn)證實(shí)將Cu、Zn-SOD (SOD1)和TAT融合在一起后可以進(jìn)入細(xì)胞，預(yù)防細(xì)胞內(nèi)的自由基過(guò)量導(dǎo)致的氧化損傷[19]。由于造成細(xì)胞損傷的自由基通常不只1種，我們進(jìn)一步證實(shí)了將GST、穿膜肽和SOD1融合在一起得到的GST-TAT-SOD1融合蛋白比SOD1-TAT融合蛋白具有更好的放射防護(hù)效果[16]，可知復(fù)合抗氧化酶的應(yīng)用潛力強(qiáng)于單功能抗氧化酶。

與SOD2重組蛋白相比，GST-SOD2融合蛋白還具有GST活力，屬于可跨膜的復(fù)合抗氧化酶。二者的SOD比活相近，但分子量相差近1倍，在相同的摩爾濃度下后者的SOD活力比前者高出近1倍。因此，GST-SOD2融合蛋白可能具有比SOD2重組蛋白更強(qiáng)的抗氧化損傷方面的潛力。未來(lái)將進(jìn)一步對(duì)本研究中兩種全長(zhǎng)SOD2蛋白進(jìn)行結(jié)構(gòu)及生物效應(yīng)的研究，以揭示其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

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(本文責(zé)編 陳宏宇)

Expression, purification, stability and transduction efficiency of full-length SOD2 recombinant proteins

Jianru Pan1, Lijuan Chen1, Huocong He2, Ying Su2, Xiangling Wang1, Xian Li1, Cuihuang Chen1, Lunqiao Wu1, and Shutao Liu1

1 College of Biological Science and Engineering, Fuzhou University, Fuzhou 350108, Fujian, China 2 Laboratory of Radiation Oncology and Radiobiology, Fujian Cancer Hospital & Fujian Medical University Cancer Hospital, Fujian Key Laboratory of Tumor Translational Cancer Medicine, Fuzhou 350014, Fujian, China

Superoxide dismutase (SOD) family is necessary to protect cells from the toxicity of reactive oxygen species produced during normal metabolism. Among SODs, manganese-containing superoxide dismutase (Mn-SOD, SOD2) is the most important one. The DNA fragment containing the full nucleotide of full-length human SOD2 was synthesized and inserted into the prokaryotic expression vector pGEX-4T-1 with tag GST. DNA construct was then transformed intoBL21 (DE3) and expression was induced with IPTG at 25 ℃. The recombinant fusion protein GST-SOD2 (46 kDa) was purified from the bacterial lysate by GST resin column affinity chromatography. GST tag was cleaved with thrombin, and a crude SOD2 recombinant protein (25 kDa) was obtained and further purified by heparin affinity chromatography. Activities of the two SOD2 proteins were 1 788 and 2 000 U/mg, respectively. Both SOD2 proteins were stable under physiological condition and cell-penetrating (<0.05). Our findings open the possibility to study the structure and effects of two full-length recombinant SOD2 proteins.

Mn-SOD, construction, fusion protein, expression and purification, stability, transduction efficiency

January 7, 2017; Accepted:March 10, 2017

Jianru Pan. Tel: +86-591-83732462; E-mail: panjr@fzu.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81472907).

國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 81472907) 資助。