趙佳 晁開瑞 劉忠玄 劉雪峰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (巴音郭勒蒙古自治州農(nóng)科院) (東北林業(yè)大學(xué))

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中國(guó)黑孢殼屬1新紀(jì)錄種(黑孢殼目：長(zhǎng)喙殼科)1)

趙佳 晁開瑞 劉忠玄 劉雪峰

(東北林業(yè)大學(xué)，哈爾濱，150040) (巴音郭勒蒙古自治州農(nóng)科院) (東北林業(yè)大學(xué))

記述了黑孢殼屬的中國(guó)新紀(jì)錄種內(nèi)生黑孢殼菌(Melanosporadamnosa)。該種從黑龍江省孟家崗林場(chǎng)的平歐榛子(Corylusheterophylla×Corylusavellana)3年生枝條中分離獲得，通過形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行了鑒定，提供了該新紀(jì)錄種的形態(tài)學(xué)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹。標(biāo)本保存在東北林業(yè)大學(xué)。

黑孢殼屬；內(nèi)生黑孢殼菌；新紀(jì)錄種；中國(guó)

Melanospora;Melanosporadamnosa(Sacc.) Lindau; New record; China

黑孢殼屬(Melanospora)是長(zhǎng)喙殼科中最大的屬，該屬中50多個(gè)種，由Corda(1837)建立，其中包括Ceratostomachionea和2個(gè)新種Melanosporazamiae和Melanosporaleucotricha[1]。1895年，SphaerodermadamnosumSacc.由Saccardo和Berlese首次描述[2]。后期，該種的分類地位發(fā)生改變，更改到黑孢殼屬，并由Engler和Prantl(1897)重命名為Melanosporadamnosa(Sacc.) Lindau(內(nèi)生黑孢殼菌)。該物種在歐洲廣泛分布，也分布在英國(guó)，孟加拉國(guó)和突尼斯[3]。然而，M.damnosa在中國(guó)還未見報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料

修枝的3年生平歐榛子(Corylusheterophylla×Corylusavellana)枝條采集于黑龍江省孟家崗林場(chǎng)，M.damnosa(KY575977.1)菌株從其3年生枝條中分離獲得。

1.2 方法

將平歐榛子3年生枝條去皮，并剪成厚為0.2 cm的木塊，再將木塊平均分為4小塊，待用。將若干個(gè)小塊用紗布包好，放入m(CaClO)∶m(水)=1∶14的溶液中，表面消毒1 min，并用無菌水沖洗3次，然后用無菌濾紙將表面殘留的水吸干，得到試驗(yàn)樣品。每5個(gè)樣品放入馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)(去皮的馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，水1 L)中，25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)20～30 d時(shí)，形成子囊殼。通過單孢分離法，獲得單個(gè)孢子，在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)。25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d，菌絲可覆蓋整個(gè)培養(yǎng)皿；大約1個(gè)月時(shí)，單孢分離菌落形成子囊殼。

1.2.1 形態(tài)學(xué)方法

將單孢萌發(fā)形成的子囊殼，放入顯微鏡下觀察。測(cè)量子囊殼、頸長(zhǎng)、頸頂端直徑、頸基部直徑、剛毛、子囊和子囊孢子的大小。用OLYPUSBX5測(cè)量數(shù)據(jù)，并拍攝形態(tài)學(xué)圖片。使用Photoshop CS6對(duì)顯微照片進(jìn)行處理。

1.2.2 分子方法

用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒(Tiangen Biotech (Beijing) Co.,LTD.)，提取培養(yǎng)7 d的單個(gè)孢子萌發(fā)形成的菌絲中的DNA。將獲得的DNA用PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，ITS1(TCCGTAGGTGAACCTGCGG)和ITS4(TCCTCGCTTATTGATATGC)分別作為擴(kuò)增時(shí)正反向的引物。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至Sangon Biotech(北京)有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果用NCBI Blast進(jìn)行分析，并評(píng)估該測(cè)序物種和保藏在GenBank數(shù)據(jù)庫中的其他相關(guān)菌株之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。將測(cè)序結(jié)果上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫中，獲得的編號(hào)為KY575977.1。通過MEGA 5.1和Clustal X2.1軟件，使用鄰位相連法對(duì)測(cè)序菌株(KY575977.1)和GenBank數(shù)據(jù)庫中的近緣種構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)學(xué)

單個(gè)萌發(fā)的子囊孢子，在PDA培養(yǎng)基中，25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)7 d，菌落覆滿直徑為90 mm的培養(yǎng)皿。菌落白色，背面淺黃色。培養(yǎng)約1個(gè)月時(shí)，形成子囊殼。無無性階段。

子囊殼球形，單個(gè)，表生，疏生絨毛，淡黃色至橙棕色，直徑170～270 μm；頸70～150 μm，短圓錐形，基部直徑57～87 μm，頂端直徑37～52 μm，頂部有呈環(huán)狀的透明的剛毛，長(zhǎng)150～230 μm。子囊倒梨形或?qū)捁靼粜危?25～55)μm×(17～35)μm，含8個(gè)孢子，子囊很快消解。子囊孢子菱形至菱形橢圓形，棕色，光滑，兩端具萌發(fā)孔，(18～23)μm×(11～15)μm。

研究標(biāo)本：2016年5月，在黑龍江省孟家崗3年生修枝平歐榛子的枝條中分離獲得菌株(KY575977.1，圖1)。

a、b.子囊果；c、d.頸和剛毛；e.子囊；f.孢子；g.萌發(fā)的孢子；h.菌落形態(tài)(PDA培養(yǎng)基)。

2.2 分子系統(tǒng)學(xué)

在NCBI Blast系統(tǒng)中，分離菌株M. sp.(KY575977.1)的ITS1-5.8S和rDNA-ITS2區(qū)域與GenBank數(shù)據(jù)庫中的菌株M.damnosa(CBS 113681)的相似度為99%。用分離菌株與近緣菌株構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹中，分離菌株M. sp.(KY575977.1)與菌株M.damnosa(CBS 113681)在同一分支上，親緣關(guān)系最近，可信度為99(圖2)。

3 討論

本研究運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子系統(tǒng)發(fā)育學(xué)方法，將從3年生平歐榛子枝條上分離的菌株鑒定為內(nèi)生黑孢殼菌，為中國(guó)新記錄種。但在已知的記載中，該物種侵染谷物，如死亡馬鈴薯的莖[3]和玉米的莖[4]，并未在平歐榛子木材組織中發(fā)現(xiàn)。據(jù)記載，M.damnosa是Gonatobotryssimplex的有性型，并且是異宗配合[4]。但在本研究中，單個(gè)孢子萌發(fā)形成的菌落可形成子囊殼，因此該菌株為同宗配合，可能由于不同寄主或不同菌株使該物種的有性生殖特性發(fā)生改變。并且，通過后期的研究發(fā)現(xiàn)，由單個(gè)孢子萌發(fā)形成的子囊殼的數(shù)量明顯少于由多個(gè)孢子萌發(fā)形成的子囊殼的數(shù)量。同時(shí)，該分離菌株未發(fā)現(xiàn)其存在無性型。在國(guó)內(nèi)河北省，吳文平在高粱的種子上，曾分離得到該種的無性型Gonatobotryssimplex[5]，但未提到它具有有性階段。因此，M.damnosa無性型的產(chǎn)生條件，以及有性型和無性型之間的關(guān)系還需要進(jìn)一步研究。

圖2 M. sp. KY575977.1與GenBank數(shù)據(jù)庫中的近緣菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

[1] FéLIX Y M. Soil ascomycetes from different geographical regions[D]. Tarragona: Universitat Rovira I Virgili,2015.

[2] SACCARDO P A, BERLESE A N. Una nuova malattia del Frumento[J].Rivista Patologia Vegetale,1895,4:56-66.

[3] CANNON P F, HAWKSWORTH D L. A re-evaluation ofMelanosporacorda and similar pyrenomycetes, with a revision of the British species[J]. Botanical Journal of the Linnean Society,1982,84(2):115-160.

[4] NADER G V.Gonatobotryssimplexand its teleomorph,Melanosporadamnosa[J]. Mycological Research,1989,93(1):67-74.

[5] 吳文平.河北省絲孢菌研究Ⅴ.節(jié)簇孢屬、小枝雙孢屬和斯佩霉屬[J].河北省科學(xué)院學(xué)報(bào),1991,8(4):58-62.

趙佳，女，1992年8月生，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，碩士研究生。E-mail:573737927@qq.com。

劉雪峰，東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，研究員。E-mail:757489401@qq.com。

2017年2月22日。

S763.15

1)國(guó)家林業(yè)局林業(yè)公益性行業(yè)科技專項(xiàng)(201004079)。

A Newly Recorded Species of the GenusMelanospora(Melanosporales, Ceratostomataceae) in China//Zhao Jia(Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China); Chao Kairui(Bayinggolin Mongol Autonomous Prefecture Academy of Agricultural Sciences); Liu Zhongxuan, Liu Xuefeng(Northeast Forestry University)//Journal of Northeast Forestry University，2017,45(7)：98-100.

責(zé)任編輯：程 紅。

A species ofMelanosporadamnosabelonging to the generaMelanosporais presented, and the species is newly recorded from China. This species was separated from triennial branches stems of stumped hazelnuts in the Mengjiagang Town, Heilongjiang Province, and was identified and characterized using morphological and molecular methods. Photographs of adults, figures of the genital structures and phylogenetic tree were provided. The specimens are stored in Northeast Forestry University.