蘇振霞，肖 輝，李 燦

(1．淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005;2．江蘇高校海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005;3．江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性試驗(yàn)

蘇振霞1，2，肖 輝3，李 燦1

(1．淮海工學(xué)院海洋學(xué)院，江蘇 連云港 222005;2．江蘇高校海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 連云港 222005;3．江蘇省海洋資源開(kāi)發(fā)研究院，江蘇 連云港 222005)

為探討水產(chǎn)養(yǎng)殖中氟喹諾酮類藥物殘留對(duì)水生生物的毒性效應(yīng)，本試驗(yàn)研究了鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)的毒性作用。試驗(yàn)設(shè)置5個(gè)藥物濃度組和1個(gè)試驗(yàn)對(duì)照組。結(jié)果顯示，各藥物濃度組對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)均有抑制作用，并且隨藥物處理濃度的增大，藻細(xì)胞的生長(zhǎng)逐漸降低。葉綠素a、b含量隨著鹽酸恩諾沙星處理濃度的增大而下降。蛋白核小球藻在經(jīng)過(guò)不同濃度的恩諾沙星處理96 h后，各組蛋白質(zhì)含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，并且蛋白質(zhì)含量隨著恩諾沙星濃度的升高逐漸減少。超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA則隨著恩諾沙星藥品濃度的升高而升高。表明鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的脅迫引起其可溶性蛋白質(zhì)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力和膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的變化。

鹽酸恩諾沙星;蛋白核小球藻;致毒效應(yīng)

氟喹諾酮類藥物(Fluoroquinolones，F(xiàn)Qs)于20世紀(jì)90年代應(yīng)用于水產(chǎn)業(yè)，由于該類藥物具有抗菌譜廣、口服給藥生物利用度高、不易產(chǎn)生耐藥性、殘留低、排泄快、毒副作用小等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于水生動(dòng)物細(xì)菌性疾病的治療［1］。鹽酸恩諾沙星是合成的第三代氟喹諾酮類抗菌藥物，1996年10月4日獲FDA批準(zhǔn)，是動(dòng)物專用的氟喹諾酮類藥物，也是最常用的抗菌藥物［2－4］。

蛋白核小球藻是淡水單細(xì)胞藻類中的主要天然餌料，是一種低等植物，在適當(dāng)?shù)臏囟?、光照和營(yíng)養(yǎng)條件下繁殖十分迅速。屬于綠藻門，色球藻目，小球藻屬［5］。不僅為水生動(dòng)物提供豐富餌料，而且還可以降低水體中的氮和磷濃度，調(diào)節(jié)和優(yōu)化水體中浮游生物的群體結(jié)構(gòu)，改善水體環(huán)境［6］。

我國(guó)目前對(duì)漁用藥物引起的生態(tài)環(huán)境問(wèn)題還沒(méi)有引起足夠的重視，對(duì)漁用藥物的使用缺乏系統(tǒng)而深入的藥理學(xué)和毒理學(xué)試驗(yàn)，因此養(yǎng)殖生產(chǎn)中普遍存在濫用藥物的現(xiàn)象。目前關(guān)于各種漁用藥物對(duì)水生生物的生態(tài)效應(yīng)以及對(duì)水生生態(tài)環(huán)境的潛在影響尚未有明確清晰的認(rèn)識(shí)和評(píng)價(jià)［7］。關(guān)于恩諾沙星的研究主要集中在其對(duì)病原菌的藥效學(xué)及藥物動(dòng)力學(xué)的研究方面［8－10］，因此，本文以蛋白核小球藻作為試驗(yàn)生物，就恩諾沙星對(duì)其毒性進(jìn)行了探討。

1 材料與方法

1.1 供試藻種 蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所淡水藻種庫(kù)，編號(hào)為FACHB9。

1.2 供試藥品 鹽酸恩諾沙星，純度99%，浙江朗博藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。SE培養(yǎng)液采用中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所配方。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 藻種的馴化 在無(wú)菌條件下，蛋白核小球藻在SE培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，并進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為:溫度25℃，光暗比12 h∶12 h，光強(qiáng)為2 000 Lx，靜止培養(yǎng)，每天定時(shí)人工搖動(dòng)3次。鏡檢細(xì)胞正常，進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.3.2 預(yù)備試驗(yàn) 取10 mL離心管，加入一定量的鹽酸恩諾沙星的系列質(zhì)量濃度標(biāo)準(zhǔn)液和一定量的藻液，找出使水藻死亡的最低質(zhì)量濃度和不產(chǎn)生死亡的最高質(zhì)量濃度，以確定毒性試驗(yàn)需要的質(zhì)量濃度系列。

1.3.3 毒性試驗(yàn) 從預(yù)試驗(yàn)得到的濃度之間取5個(gè)濃度梯度，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組。在200 mL錐形瓶中加入藻液、鹽酸恩諾沙星系列標(biāo)準(zhǔn)液，在進(jìn)行蛋白核小球藻的毒性試驗(yàn)時(shí)，毒性試驗(yàn)的藥物質(zhì)量濃度系列為0、15.625、31.25、50、62.5、125 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3個(gè)平行樣，混勻后恒溫25℃培養(yǎng)，12 h光暗循環(huán)，光強(qiáng)2 000 Lx，每天定時(shí)振蕩3次。蛋白核小球藻細(xì)胞初始細(xì)胞濃度為2.5×106個(gè)/ mL。從試驗(yàn)的條件和準(zhǔn)確性出發(fā)，采用建立650 nm吸光度與藻細(xì)胞濃度的關(guān)系式的方法來(lái)確定藻細(xì)胞濃度。在0、24、48、72、96 h時(shí)于各瓶中取一定量藻液測(cè)定光密度，比較其與空白對(duì)照組細(xì)胞生長(zhǎng)之間的差別。

1.3.4 光合色素含量的測(cè)定 用分光光度法測(cè)定藻色素含量。培養(yǎng)96 h，取10 mL藻液，4 000 r/min離心10 min，去上清，加入5 mL 90%丙酮，搖勻，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min離心10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以90%丙酮為對(duì)照，測(cè)量663、646 nm波長(zhǎng)處抽提液的吸光值。葉綠素含量計(jì)算公式如下［11－12］:

C－a=12．21 OD663－2．81 OD646

C－b=20．13 OD646－5．03 OD663

式中:C-a為葉綠素a;C-b為葉綠素b。以μg/ mL表示。

1.3.5 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，4 000 r/min離心10 min，去上清，取沉淀物加入5 mL磷酸鹽緩沖液，搖勻，在4℃冰箱中避光抽提24 h，再4 000 r/min離心10 min，然后，超聲波破碎儀破碎10 min。再次4 000 r/min離心10 min。然

1.3.6 SOD含量的測(cè)定 蛋白核小球藻培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，離心，超聲波破碎儀破碎。利用超氧化物歧化酶試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)，按照規(guī)定加入各個(gè)樣品，混勻，放置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以無(wú)菌水為對(duì)照，測(cè)量550 nm波長(zhǎng)處抽提液的吸光值。

SOD含量計(jì)算公式如下:

總SOD活力(U/mg·prot)后準(zhǔn)確取樣品液，按照試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)上考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒操作說(shuō)明書(shū)加入各個(gè)試劑，混勻，靜置10 min，取上清置于1 cm比色杯中，以無(wú)菌水為對(duì)照，測(cè)量595 nm波長(zhǎng)處抽提液的吸光值。

蛋白含量公式如下:

1.3.7 MDA含量的測(cè)定 蛋白小球藻培養(yǎng)96 h后，取出10 mL藻液，離心，超聲波破碎儀破碎10 min，按照試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)測(cè)量MDA的步驟，將樣品處理好后，用保鮮膜扎緊試管，每個(gè)管扎一個(gè)孔95℃水浴加熱40 min，流水冷卻。離心10 min后，取上清液以無(wú)菌水作對(duì)照，1 cm光徑532 nm測(cè)量吸光值。

MDA含量的計(jì)算公式如下:

2 結(jié)果與分析

2.1 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻生長(zhǎng)的影響

1 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的生長(zhǎng)效應(yīng)動(dòng)力學(xué)曲線

不同濃度鹽酸恩諾沙星處理后，蛋白核小球藻的生長(zhǎng)曲線發(fā)生改變，結(jié)果如圖1所示，隨著鹽酸恩諾沙星處理時(shí)間延長(zhǎng)，各濃度組的藻細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢。低濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)藻細(xì)胞生長(zhǎng)影響不大，甚至在較低濃度較短時(shí)間內(nèi)呈現(xiàn)一定的“興奮效應(yīng)”。添加藥物的試驗(yàn)組在24 h后就表現(xiàn)出藥物抑制效應(yīng)，但不同濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻產(chǎn)生不同程度的抑制效應(yīng)，體現(xiàn)出良好的劑量-效應(yīng)關(guān)系。在整個(gè)藥物處理過(guò)程中，高濃度組(≥50μg/mL)的藻生長(zhǎng)受嚴(yán)重抑制，增長(zhǎng)速度減緩，至96 h時(shí)與對(duì)照相比僅占對(duì)照組的68%，62%，43%。

2.2 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻光合色素含量的影響 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，各暴露組藻液與對(duì)照組相比，顏色明顯變淺，且鹽酸恩諾沙星濃度越高，藻液顏色越淺。暴露96 h后，各試驗(yàn)組葉綠素a、葉綠素b含量如圖2所示。蛋白核小球藻的葉綠素a、葉綠素b含量均隨鹽酸恩諾沙星濃度的增加而下降。當(dāng)鹽酸恩諾沙星濃度為15．625μg/ mL時(shí)，與對(duì)照組相比，葉綠素含量顯著減少，表明鹽酸恩諾沙星在低濃度時(shí)即對(duì)葉綠素有顯著抑制作用。其后隨著鹽酸恩諾沙星濃度的升高，葉綠素含量逐漸下降，其對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生不可逆轉(zhuǎn)的影響。

圖2 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻光合色素含量的影響

2.3 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻可溶性蛋白含量的影響 蛋白質(zhì)是細(xì)胞代謝過(guò)程中的催化劑，是細(xì)胞重要的結(jié)構(gòu)和功能物質(zhì)，蛋白質(zhì)的含量可以反映出細(xì)胞活力的高低。蛋白核小球藻在經(jīng)過(guò)不同濃度的恩諾沙星處理96 h后，各組蛋白質(zhì)含量均遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于對(duì)照組，各個(gè)處理組間，隨著恩諾沙星濃度的升高蛋白質(zhì)含量逐漸減少。尤其恩諾沙星濃度為62.5 μg/mL，蛋白質(zhì)含量極速遞減，在濃度為125μg/mL時(shí)候，小球藻中的蛋白含量最低。

圖3 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻蛋白質(zhì)含量的影響

2.4 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻SOD的影響從圖4可以看出，隨著恩諾沙星藥品濃度的升高，小球藻經(jīng)藥品處理96 h后，SOD活力隨著藥品濃度的升高而升高，當(dāng)濃度到125μg/mL時(shí)，SOD活力極速上升。主要的原因是植物體在逆境脅迫下［13］，會(huì)發(fā)生大量活性氧的積累，對(duì)細(xì)胞造成危害。SOD是清除生物體內(nèi)活性氧的關(guān)鍵酶，因而SOD活性的變化可以反映出生物體的受迫害程度。隨著藥品濃度的增加，其對(duì)藻體產(chǎn)生脅迫的程度加大，SOD活性增強(qiáng)，同時(shí)也激發(fā)藻體合成更多的SOD來(lái)清除過(guò)剩的活性氧。

圖4 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)SOD含量的影響

在藥物濃度最高時(shí)，SOD活力是其對(duì)照組的8倍，可見(jiàn)植物體因?yàn)楫a(chǎn)生了大量的活性氧從而產(chǎn)生了大量的SOD，由此推斷，生物體受破壞程度隨著恩諾沙星濃度增加而加重，在濃度為125μg/mL時(shí)達(dá)到最大。

2.5 鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻MDA的影響

膜脂過(guò)氧化的產(chǎn)物有二烯軛合物、丙二醛(MDA)、乙烷、脂類過(guò)氧化物等，其中丙二醛是膜脂過(guò)氧化的最重要的分解產(chǎn)物之一。植物在逆境脅迫下，由于其體內(nèi)活性氧的積累，可能發(fā)生膜脂過(guò)氧化作用［13－14］。因而，測(cè)定MDA可以了解膜脂過(guò)氧化的程度，可以間接測(cè)定出膜系統(tǒng)受損程度以及植物的抗逆性。由圖5可以發(fā)現(xiàn)，隨著恩諾沙星濃度的增加，蛋白核小球藻MDA含量先逐漸緩慢的升高，在藥品濃度達(dá)到62.5μg/mL時(shí)迅速上升，到濃度125μg/mL時(shí)MDA含量達(dá)到最大，與對(duì)照組差異顯著，為對(duì)照組的近3倍。由此可以表明，鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的脅迫引起其膜脂過(guò)氧化產(chǎn)物MDA含量的增加，從而說(shuō)明隨著恩諾沙星濃度增加脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)受傷害程度也加深，在藥品濃度為125μg/mL時(shí)候，其受傷害程度達(dá)到最大。

圖5 不同濃度的鹽酸恩諾沙星對(duì)MDA含量的影響

3 小結(jié)

本試驗(yàn)主要研究了恩諾沙星對(duì)小球藻的急劇毒性，從分析小球藻的生長(zhǎng)狀況、光合色素含量、蛋白含量、SOD含量、MDA含量這幾方面研究分析了恩諾沙星對(duì)小球藻的毒性作用。結(jié)果顯示，隨著藥品濃度的增加，小球藻內(nèi)可溶性蛋白的含量逐漸減少，說(shuō)明細(xì)胞活力隨藥品濃度加大而減少;而SOD、MDA與藥品濃度之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，說(shuō)明隨著藥品濃度的加大，生物體活性氧增多，受破害程度加重; MDA與藥品濃度的負(fù)相關(guān)表明，隨著恩諾沙星濃度增加脂質(zhì)過(guò)氧化強(qiáng)度和膜系統(tǒng)受傷害程度也加深。

本試驗(yàn)僅對(duì)鹽酸恩諾沙星對(duì)蛋白核小球藻的急性毒性進(jìn)行了研究，且在室內(nèi)模擬條件下進(jìn)行，無(wú)法反映出完整生態(tài)環(huán)境對(duì)藻生長(zhǎng)的影響，抗生素對(duì)藻的毒性效應(yīng)受到多種環(huán)境因子制約并與藻的種類有關(guān)，抗生素對(duì)藻類的脅迫作用是一個(gè)十分復(fù)雜的生理生化過(guò)程。本文僅是鹽酸恩諾沙星對(duì)藻類毒性效應(yīng)的初步研究，對(duì)于抗生素脅迫下更復(fù)雜的生理生化過(guò)程還有待進(jìn)一步探討。本試驗(yàn)的研究成果可以為恩諾殺星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中實(shí)際應(yīng)用提供一定的參考。

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Toxic Effects of Enrofloxacin hydrochloride on Chlorella pyrenoidosa

SU Zhen-xia1，2，XIAO Hui3，LI Can1

(1．Huaihai Institute of Technology，Lianyungang 222005，China;2．Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology，Lianyungang 222005，China;3．Jiangsu Marine Resources Development Research Insititute，Lianyungang 222005，China)

In order to study the toxic effects of fluoroquinolones on the fresh algae，Chlorella pyrenoidosa was exposed to Enrofloxacin hydrochloride of five concentrations(15．625，31．25，50，62．5，125 mg·L－1)and a control．Results showed that，Enrofloxacin hydrochloride had inhibition effect on the growth of Chlorella pyrenoidosa compared with the control．With the increase of concentrations，the growth of algae cells gradually decreased correspondingly．Enrofloxacin hydrochloride had the same effects on the contents of the chlorophyll-a，chlorophyll-b，that is，the contents of the photosynthetic pigments decreased．The activity of Superoxide dismutase(SOD)and Malondialdehyde(MDA)were increased and protein content reduced with increased concentration of Enrofloxacin．

Enrofloxacin hydrochloride;Chlorella pyrenoidosa;Toxic effects

8

A

0529-6005(2017)06-0096-04

2016-12-02

江蘇省優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目;江蘇省海資院開(kāi)放課題(JSIMR201314，JSIMR201423);淮海工學(xué)院自然科學(xué)基金(Z2014006)

蘇振霞(1978-)，女，講師，博士，主要從事水產(chǎn)藥物生態(tài)毒理學(xué)研究，E-mail:qyxx79@126．com