劉佳佳，陳 峰，2，覃健萍，周慶豐，魯俊鵬，操 勝，王占新，田 野

(1．廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527439;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

禽偏肺病毒 Taqman熒光定量 PCR方法的建立及應(yīng)用

劉佳佳1，陳 峰1，2，覃健萍1，周慶豐1，魯俊鵬1，操 勝1，王占新1，田 野1

(1．廣東溫氏食品集團(tuán)股份有限公司，廣東 云浮 527439;2．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642)

根據(jù)GenBank中aMPV-C P基因序列，設(shè)計(jì)出一對特異性引物和Taqman探針，建立了aMPV-CTaqman探針熒光定量PCR方法。對該反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，進(jìn)行特異性、敏感性及重復(fù)性試驗(yàn)，并且建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該方法只對aMPV-C檢測為陽性，具有良好的特異性;能夠檢測到(3.63×102)拷貝數(shù)，具有良好的敏感性;建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為-3.312，截距為44.66，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，循環(huán)閾值和模板拷貝數(shù)具有良好的相關(guān)性，組內(nèi)及組間重復(fù)性好。采用aMPV-C Taqman探針熒光定量方法、普通PCR方法對來自廣東、浙江地區(qū)25份番鴨疑似陽性aMPV-C的病料進(jìn)行檢測，其中前者23份陽性，后者18份陽性。這表明aMPV-C Taqman熒光定量PCR方法對樣品的檢測具有特異性和敏感性高的特點(diǎn)，更適合臨床樣品的檢測。

C亞型番鴨偏肺病毒;熒光定量PCR;Taqman熒光探針

禽偏肺病是由禽偏肺病毒(avian metapneumovirus，aMPV)引起的急性上呼吸道感染，具有高度傳染性疾病之一［1］。禽偏肺病的死亡率僅為2% ～5%，但發(fā)生細(xì)菌或者支原體等繼發(fā)感染的情況下，死亡率可高達(dá)90%，對養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失［2］。目前只在中國華南地區(qū)番鴨身上分離到偏肺病毒［3］。

目前，有許多實(shí)驗(yàn)室診斷方法，例如:病毒的分離鑒定、基因組的測定、特異性抗體的檢測等［4－6］，但是這些方法的缺點(diǎn)是靈敏性低。實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號積累實(shí)施實(shí)時(shí)監(jiān)測整個(gè)PCR進(jìn)程并對模板進(jìn)行定量分析的方法，其中Taqman探針法相較染料法特異性更高。因此本試驗(yàn)建立的aMPV-C Taqman探針熒光定量PCR對禽偏肺病毒高效、快速的診斷有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒 aMPV-C分離株(S01株)、ND分離株、DRV分離株、MPV分離株、AIV分離株、IB分離株等均由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 Taqman RT-PCR熒光定量一步法試劑盒，購自英偉創(chuàng)津;AxyPrep體液病毒DNA/ RNA小量試劑盒、DNA片段快速純化/回收試劑盒，購自愛思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司;一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2)，DNA Marker DL-2 000，購自TaKaRa公司;其他化學(xué)試劑如無水乙醇、氯仿等均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)與合成 擴(kuò)增片段位于P基因，引物由寶生物工程大連有限公司合成，探針5'端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)為FAM，3'端標(biāo)記的熒光淬滅基團(tuán)為BHQ。上游引物為:5'-GGTGAAGGCTGCTCCATTATG-3'，下游引物為5'-CCTCTCGCAAGAGACATGCA-3'，探針為 5'-FAM-AGGGAAAGACGGGAGTTBHQ-3'，全長為62 bp。

1.2.2 aMPV-C病毒總RNA的提取和目的片段的獲得 用AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒提取病毒液中的 RNA。用一步法反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2)以抽提的核酸為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄及PCR，獲得P基因目的片段。采用25μL體系，具體反應(yīng)程序?yàn)?50℃ 30 min，94℃4 min;94℃ 30 s、53℃ 30 s、72℃ 15 s，30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10 min，最后4℃終止反應(yīng)。

1.2.3 陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備 將PCR獲得的目的片段純化后克隆到pMD-19T載體中，將重組獲得的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到TOP10感受態(tài)細(xì)胞中增殖，經(jīng)菌液鑒定、抽提質(zhì)粒、酶切鑒定和測序，篩選出陽性質(zhì)粒，經(jīng)分光光度計(jì)測定其 OD值，即拷貝/μL=6.02×1023(拷貝/mol)×DNA濃度(g/μL)/MW(g/mol)，計(jì)算質(zhì)粒拷貝數(shù)。

1.2.4 反應(yīng)條件的優(yōu)化 結(jié)合使用梯度PCR儀，選出最佳的退火溫度。在其他變量不變的情況下，以出現(xiàn)最小的樣本閾值循環(huán)數(shù)(Ct值)和最高熒光值以及不出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增為標(biāo)準(zhǔn)，分別對退火溫度，循環(huán)條件，循環(huán)次數(shù)和引物濃度等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 提取的質(zhì)粒經(jīng)微量分光光度計(jì)測定其質(zhì)量濃度，并計(jì)算重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)。用滅菌超純水將制備好的陽性標(biāo)準(zhǔn)品做10倍比例稀釋，得到連續(xù)10個(gè)稀釋度的模板進(jìn)行熒光定量PCR，并做3個(gè)重復(fù)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.6 特異性試驗(yàn) 設(shè)定非aMPV-C(aMPV-B、 NDV、ALV、IBV、MPV、DRV等)及空白對照，檢測本方法的特異性。

1.2.7 敏感性試驗(yàn) 用滅菌超純水對 aMPV-C Taqman熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)模板進(jìn)行10×系列稀釋，以此計(jì)算出熒光定量PCR所能檢出的最低模板拷貝數(shù)，同時(shí)設(shè)置陰性對照。

1.2.8 重復(fù)性試驗(yàn) 取3個(gè)稀釋濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別作3個(gè)復(fù)孔，在組內(nèi)和組間分別進(jìn)行3次重復(fù)測定，將得到的Ct值通過SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算其相應(yīng)的變異系數(shù)CV%，進(jìn)而檢測該反應(yīng)體系的重復(fù)性或穩(wěn)定性。

1.2.9 檢測方法的應(yīng)用 取疑似陽性禽偏肺病毒感染的番鴨病料進(jìn)行熒光定量PCR檢測及普通PCR檢測，比較檢測結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 克隆質(zhì)粒鑒定結(jié)果 克隆的質(zhì)粒經(jīng)PCR及酶切鑒定，擴(kuò)增出一條大小約為62 bp的特異片段，與預(yù)期結(jié)果相符?？寺〉木簻y序結(jié)果表明目的基因已克隆到T載體上，并且與P基因序列同源性為100%?？寺〉馁|(zhì)粒經(jīng)微量分光光度計(jì)測定其在260 nm處的吸光度為110 ng/μL，計(jì)算其原始的拷貝數(shù)為:3.63×1010copies/μL。

2.2 反應(yīng)體系及反應(yīng)條件優(yōu)化 用10μmol/L的引物濃度和4μmol/L探針濃度，對質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的檢測可獲得較小的 Ct值和較大的ARn。熒光定量PCR的循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果表明，三溫循環(huán)及退火溫度59℃為最佳的循環(huán)條件。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 取3.63×103～3.63×108拷貝/μL的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。熒光定量PCR結(jié)束后，用7 500system software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，得到P基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.312x+44.66和相關(guān)系數(shù)R2=0.999。待測樣品的Ct值可以從儀器讀取;把待測樣品的Ct值代入表達(dá)式就可以算出它的初始拷貝數(shù)。

2.4 特異性試驗(yàn) 所建立的aMPV-C熒光定量PCR只對aMPV-C(S01)有特異性的擴(kuò)增曲線，如中插彩版圖1。

2.5 敏感性試驗(yàn) 以6倍系列稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(3.63×101～3.63×108拷貝/μL)為模板進(jìn)行熒光擴(kuò)增，在3.63×102拷貝/μL時(shí)仍有熒光曲線，表明該方法檢測靈敏度可達(dá)3.63×102拷貝/μL，如中插彩版圖2。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 3個(gè)稀釋濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品分別作3個(gè)復(fù)孔，在組內(nèi)和組間分別進(jìn)行3次重復(fù)檢測，其Ct值和變異系數(shù)如表1所示，組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于2%。

2.7 對來自不同地區(qū)25份疑似陽性aMPV-C的病料進(jìn)行Taqman熒光定量PCR及普通PCR檢測，其中前者23份陽性，陽性檢出率為92%;后者18份陽性，陽性檢出率為72%。

表1 熒光定量重復(fù)性試驗(yàn)

3 討論

常規(guī)PCR技術(shù)可以快速的、特異的檢測很少拷貝數(shù)的aMPV，但不能準(zhǔn)確定量，而且容易出現(xiàn)交叉污染產(chǎn)生假陽性、PCR后處理繁瑣［7－8］。熒光定量PCR技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)，有效解決PCR污染問題，自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于病原體檢測監(jiān)控，醫(yī)學(xué)檢測，病毒載荷量測定，基因表達(dá)研究和食品衛(wèi)生檢疫等方面。

本研究中根據(jù)aMPV-C基因組中相對保守的P基因?yàn)榘谢虺晒Φ慕⒘艘粋€(gè)Taqman探針熒光定量PCR方法，該方法檢測特異性高，只能檢測出aMPV-C，對aMPV-B、NDV、ALV、IBV、MPV、DRV等無擴(kuò)增，敏感性強(qiáng)，能檢測出2.6×102拷貝數(shù)。建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率為負(fù)3.312，截距為44.66，相關(guān)系數(shù)為R2=0.999，循環(huán)閾值和模板拷貝數(shù)具有良好的相關(guān)性，重復(fù)性試驗(yàn)組內(nèi)和組間的變異系數(shù)均小于2%。這說明所建立的aMPV-C Taqman熒光定量PCR檢測方法具有良好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，標(biāo)準(zhǔn)曲線的質(zhì)量很好，具有很強(qiáng)的實(shí)用性。該方法用于臨床病料的檢測，其陽性檢出率為92%，而普通PCR的陽性檢出率僅為72%，該方法對aMPV-C感染、增殖規(guī)律的研究奠定了重要基礎(chǔ)。

［1］ Cook J K．Avian rhinotracheitis［J］．Rev Sci Tech，2000，19 (2):602-613．

［2］ Seal B S，Sellers H S，Meinersmann R J．Fusion protein predicted amino acid sequence of the first US avian pneumovirus isolate and lack of heterogeneity among other US isolates［J］．Virus Research，2000，66(2):139-147．

［3］ Sun S，Chen F，Cao S，et al．Isolation and characterization of a subtype C avian metapneumovirus circulating in Muscovy ducks in China［J］．Vet Res，2014，45:74．

［4］ Alexander L J．Age-related macular degeneration:the current understanding of the status of clinicopathology，diagnosis and management［J］．J Am Optom Assoc，1993，64(12):822-837．

［5］ Cook J K，Cavanagh D．Detection and differentiation of avian pneumoviruses(metapneumoviruses)［J］．Avian Pathol，2002，31(2):117-132．

［6］ Johnson K，Nimmo E，Jones P，et al．Segregation of linked probes to myotonic dystrophy in a family demonstrating that 152 and APOC2 are on the same side of DM on 19q［J］．Hum Genet，1988，80(4):379-381．

［7］ Pereira C A，Monezi T A，Mehnert D U，et al．Molecular characterization of canine parvovirus in Brazil by polymerase chain reaction assay［J］．Vet Microbiol，2000，75(2):127-133．

［8］ Buonavoglia C，Martella V，Pratelli A，etal．Evidence for evolution of canine parvovirus type 2 in Italy［J］．J Gen Virol，2001，82(Pt12):3 021-3 025．

Establishment and application of Taqman fluorescence quantitative PCR method for avian metapneumovirus

LIU Jia-jia1，CHEN Feng1，2，QIN Jian-ping1，ZHOU Qing-feng1，LU Jun-peng1，CAO Sheng1，WANG Zhan-xin1，TIAN Ye1

(1．Guang Dong Wens Foodstuff Group Co．Ltd，Yunfu 527439，China; 2．South China Agricultural University，Guangzhou 510642，China)

In order to establish a method of aMPV-C Taqman probe fluorescence quantitative PCR，a pair of specific primers and Taqman probe were designed based on the P gene sequences of aMPV-C in the Genbank．Then the method system was optimized by the specific，sensitive tests，and replicative experiments，and the standard curve was established．The results indicated that the system had good specificity and sensitivity，and the aMPV-C samples including 3．63×102 copies/μL was positively tested．The cycle threshold and template copy number also had good correlation in the standard curve．It also had repeatability within the group and between the groups．25 positive aMPV-C samples were tested by two kinds of PCRs，and the results showed that23 samples were detected to be positive by the established PCR，and 18 samples were detected positive by the other PCR method．Our results suggest that the aMPV-c Taqman PCR is specific and sensitive for detecting clinical samples．

aMPV-C;real-time PCR;Taqman fluorescence probe

CHEN Feng

S852.65+1

A

0529-6005(2017)06-0034-03

2016-05-19

國家自然科學(xué)基金(31072138)

劉佳佳(1988-)，女，碩士生，研究方向?yàn)轼啿》乐?，E-mail:1255370172@qq．com．

陳峰，E-mail:chenfeng1224@126．com