劉志榮 李安平 楊 錫 楊平榮 胡旭東

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，蘭州 730070)

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清熱解毒膠囊質(zhì)量研究

劉志榮 李安平 楊 錫 楊平榮 胡旭東

(甘肅省藥品檢驗(yàn)研究院，蘭州 730070)

目的：完善提高清熱解毒膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。方法：采用薄層色譜法對(duì)處方中金銀花、梔子、連翹、麥冬、龍膽、黃芩進(jìn)行定性鑒別；同時(shí)測(cè)定處方中綠原酸和黃芩苷含量。采用CAPCELL PAK C18(5 μm，4. 6 mm ×250 mm)為色譜柱，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，流速1 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)326 nm，柱溫30 ℃。結(jié)果：薄層色譜鑒別專屬性強(qiáng)，重復(fù)性好。樣品中的綠原酸和黃芩苷峰按照擬定的試驗(yàn)方法測(cè)定分離度良好，分別在0.0479μg～0.957 μg(r=0.9999)、0.153μg～3.064 μg(r=0.9999)范圍內(nèi)與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；加樣回收率分別為92.7%(RSD=1.9)和98.9%(RSD=2.0)。經(jīng)HPLC測(cè)定，10批樣品中2個(gè)成分的含量分別為綠原酸3.74～4.51 mg·g-1，黃芩苷18.94～21.76 mg·g-1。結(jié)論：該法簡(jiǎn)便、專屬、準(zhǔn)確，可用于清熱解毒膠囊的質(zhì)量控制。

清熱解毒膠囊 TLC HPLC 綠原酸 黃芩苷

清熱解毒膠囊處方由石膏、金銀花、玄參、地黃、連翹、梔子、甜地丁、黃芩等12味中藥材組成，主要功能為清熱解毒，養(yǎng)陰生津，瀉火，可用于風(fēng)熱型感冒、流行性腮腺炎及輕、中型乙型腦炎等癥[1，2]?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中僅有理化鑒別項(xiàng)，在質(zhì)量控制中尚顯不足，如鑒別部分僅以薄層色譜鑒定了梔子、金銀花、連翹3味藥味，其余藥味都沒(méi)有設(shè)置相應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目[3]。而含量測(cè)定項(xiàng)下僅采用高效液相色譜法測(cè)定黃芩中黃芩苷的含量[3]，該標(biāo)準(zhǔn)已經(jīng)難以適應(yīng)新形勢(shì)下從嚴(yán)、綜合控制藥品質(zhì)量的要求。文獻(xiàn)報(bào)道[4-7]清熱解毒膠囊中黃芩苷、連翹苷等的含量測(cè)定較多，但關(guān)于薄層鑒別方面的文獻(xiàn)報(bào)道較少。為更好的控制藥品質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)在原有標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)上，增加了麥冬、龍膽的薄層色譜定性鑒別；增加了用HPLC法同時(shí)測(cè)定處方中綠原酸和黃芩苷的含量，并進(jìn)行相關(guān)的方法學(xué)驗(yàn)證。

1 儀器與試藥

島津LC-20A型高效液相色譜儀(配備SPD-20A檢測(cè)器和LCsolution色譜工作站)；資生堂CAPCELL PAK C18(5 μm，4. 6 mm ×250 mm)色譜柱；ME-204 電子天平，德國(guó)Sartorius R200D 型分析天平(十萬(wàn)分之一)；KH-500DE超聲波清洗器(功率250 W，頻率40 kHz，上海超聲波儀器廠)。綠原酸(批號(hào)：110753-201415)、黃芩苷(批號(hào)：110715-201318)、麥冬(批號(hào)：121013-201310)、龍膽(批號(hào)：121530-200501)、黃芩(批號(hào)：120955-201309)、連翹(批號(hào)：120908-201216)、梔子(批號(hào)：120986-201309)、金銀花(批號(hào)：121060-201107)均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品鑒定所；清熱解毒膠囊樣品由陜西步長(zhǎng)制藥有限公司提供，圖中記為膠囊(批號(hào))；乙腈(色譜純)，其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 薄層色譜定性鑒別

2.1.1 金銀花的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加甲醇5 mL，超聲處理30 min，過(guò)濾，濾液作為供試品溶液。另取金銀花對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸丁酯-甲醇-水(7∶2.5∶2.5)的上層液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖1。

圖1 金銀花樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.金銀花對(duì)照藥材；2. 缺金銀花陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

2.1.2 梔子的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加50%甲醇10 mL，超聲處理40 min，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。另取梔子對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(5∶5∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖2。

圖2 梔子樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.梔子對(duì)照藥材；2. 缺梔子陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

2.1.3 連翹的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取連翹對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5～10 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-甲醇(8∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖3。

圖3 連翹樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.連翹對(duì)照藥材；2. 缺連翹陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

2.1.4 麥冬的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加三氯甲烷-甲醇(7∶3)混合溶液10 mL，浸泡3 h后超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL三氯甲烷溶解，作為供試品溶液。另取麥冬對(duì)照藥材1 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各2～5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-甲醇-冰醋酸(80∶5∶0.1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖4。

圖4 麥冬樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.麥冬對(duì)照藥材；2. 缺麥冬陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

2.1.5 龍膽的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加甲醇10 mL，超聲處理20 min，濾過(guò)，濾液蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液。另取龍膽對(duì)照藥材0.5g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠GF254薄層板上，以乙酸乙酯-甲醇-水(10∶2∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈(254 nm)下檢視。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖5。

圖5 龍膽樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.龍膽對(duì)照藥材；2.缺龍膽陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

2.1.6 黃芩的定性鑒別

取清熱解毒膠囊內(nèi)容物2.0 g，加50%甲醇10 mL，超聲處理30 min，濾過(guò)，濾液蒸干，加2 mL甲醇溶解作為供試品溶液。另取黃芩對(duì)照藥材0.2 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。吸取上述兩種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-丁酮-甲醇-水(15∶3∶1∶1)為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以1%三氯化鐵乙醇溶液。供品試品色譜圖中，在與對(duì)照藥材色譜圖相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對(duì)照品在此處無(wú)干擾，見(jiàn)圖6。

2.2 HPLC定量測(cè)定

2.2.1 色譜條件

圖6 黃芩樣品及不同批號(hào)膠囊的薄層色譜圖1.黃芩對(duì)照藥材；2. 缺黃芩陰性樣；3. 膠囊(160301)；4. 膠囊(160210)；5. 膠囊(150503)

色譜柱為資生堂CAPCELL PAK C18(5 μm，4.6 mm ×250 mm)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫(見(jiàn)表1)，檢測(cè)波長(zhǎng)為326 nm，柱溫30 ℃，流速：1.0 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2.2 供試品溶液的制備

取供試品約0.3 g，精密稱定，置100 mL三角瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱量，超聲提取20 min，放冷，再稱量，用甲醇補(bǔ)足減失的量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液即得。

2.2.3 混合對(duì)照品溶液的制備

取綠原酸對(duì)照品和黃芩苷對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 mL含綠原酸50 μg、黃芩苷150 μg，即得。

2.2.4 干擾試驗(yàn)

按處方比例及制備工藝，配制不含金銀花和黃芩的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法制成陰性樣品溶液。在上述色譜條件下，取供試品溶液、對(duì)照品溶液及陰性對(duì)照溶液各20 μL，注入液相色譜儀，結(jié)果表明其他成分對(duì)綠原酸和黃芩苷的測(cè)定無(wú)干擾。結(jié)果見(jiàn)圖7。

2.2.5 線性范圍

精密吸取對(duì)照品混合溶液1、3、5、10、15、20、25 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積積分值，以峰面積積分值為橫坐標(biāo)(X)，對(duì)照品溶液的進(jìn)樣量(μg)為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果表明，綠原酸和黃芩苷分別在0. 0479～0.957 μg、0.153～3.064 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

圖7 供試品對(duì)照品高效液相色譜圖a.對(duì)照；b.供試品；c.金銀花陰性對(duì)照；d.黃芩苷陰性對(duì)照

成分回歸方程r線性范圍(μg)綠原酸Y=2.981×10-7-0.0010.99990.0479～0.957黃芩苷Y=4.750×10-7-0.0020.99990.153～3.064

2.2.6 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取綠原酸和黃芩苷混合對(duì)照品溶液10 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積積分值，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表3。綠原酸和黃芩苷峰面積的RSD均為0.4%，小于3%，符合中國(guó)藥典的相關(guān)要求。

表3 進(jìn)樣精密度測(cè)定結(jié)果(A：峰面積)

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取同一供試品溶液10 μL，注入液相色譜儀，測(cè)定待測(cè)成分峰面積積分值，結(jié)果供試品中綠原酸和黃芩苷峰的積分面積在1950 min內(nèi)RSD分別為0.5%、0.4%。穩(wěn)定性符合中國(guó)藥典的有關(guān)規(guī)定。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(A：峰面積)

2.2.8 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取同一批號(hào)樣品按上文擬訂的制備和測(cè)定方法平行測(cè)定6次，綠原酸及黃芩苷重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果較好，符合中國(guó)藥典的有關(guān)規(guī)定，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 樣品測(cè)定結(jié)果的重復(fù)性(批號(hào)：150503)

2.2.9 加樣回收率試驗(yàn)

取已知綠原酸、黃芩苷含量的供試品(批號(hào)：150503)9份，每份約0.15 g，精密稱定，置錐形瓶中，分別精密加入一定量的混合對(duì)照品溶液(綠原酸0.1542 mg·mL-1、黃芩苷0.7621 mg·mL-1)，按供試品溶液制備方法制備，測(cè)定，綠原酸、黃芩苷的回收率結(jié)果復(fù)合中國(guó)藥典相關(guān)規(guī)定，表明該含量測(cè)定方法可行(見(jiàn)表6、表7)。

表6 綠原酸加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表7 黃芩苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.2.10 供試品含量測(cè)定

按上述方法測(cè)定10批樣品，結(jié)果見(jiàn)表8。

表8 樣品測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 供試品提取條件的優(yōu)化

分別選擇超聲波提取、回流提取兩種提取方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果表明，超聲波提取效率最高，且簡(jiǎn)便快捷，故實(shí)驗(yàn)選用超聲提取法制備供試品溶液。對(duì)提取溶劑(甲醇、50%甲醇)進(jìn)行優(yōu)選，發(fā)現(xiàn)甲醇提取供試品中各檢測(cè)組分總含量?jī)?yōu)于50%甲醇提取，且雜質(zhì)明顯減少，因此選擇甲醇作為該供試品的提取溶劑。供試品量相同情況下對(duì)提取溶劑用量(25 mL、50 mL和100 mL)進(jìn)行優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)50 mL和100 mL用量下各檢測(cè)組分總含量基本相同，均優(yōu)于25 mL提取液，因此選擇50 mL作為該供試品的提取溶劑量。

3.2 波長(zhǎng)的選擇

由于清熱解毒顆粒組成處方較大，化學(xué)成分復(fù)雜而呈多樣性，本研究擬同時(shí)測(cè)定綠原酸和黃芩苷兩種成分，使得一次檢測(cè)就可以控制處方中金銀花及黃芩兩味藥的含量。由于上述成分的紫外吸收情況差距較大，通過(guò)比較兩種成分在200～400 nm 的紫外光譜發(fā)現(xiàn)，綠原酸和黃芩苷的最大吸收波長(zhǎng)分別為326 nm和276 nm，特征吸收的差異較大，綜合考慮并比較不同波長(zhǎng)下其色譜峰的分離情況和強(qiáng)度，本試驗(yàn)選擇326 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。結(jié)果顯示，在此條件下兩 種成分的峰面積響應(yīng)及線性關(guān)系良好，符合含量測(cè)定的要求。同時(shí)，采用單波長(zhǎng)同時(shí)測(cè)定制劑中綠原酸和黃芩苷的含量，較多波長(zhǎng)方法測(cè)定更為簡(jiǎn)便，對(duì)儀器的要求較低，有利于測(cè)定工作的開(kāi)展和實(shí)現(xiàn)。

3.3 流動(dòng)相的選擇

對(duì)不同流動(dòng)相的組成比例進(jìn)行考察，采用不同比例的甲醇-水系統(tǒng)、甲醇-醋酸水系統(tǒng)、甲醇-磷酸水系統(tǒng)、乙腈-水系統(tǒng)、乙腈-醋酸水系統(tǒng)和乙腈-磷酸水系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)在流動(dòng)相中加入一定比例的酸有助于提高待測(cè)成分與干擾峰的分離度、改善峰形，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步考察，確定采用由乙腈-0.1%磷酸水溶液組成的流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，可獲得理想的色譜圖。

4 總結(jié)

本實(shí)驗(yàn)改進(jìn)并增加了清熱解毒膠囊中藥味的薄層定性鑒別方法，并且建立了高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定清熱解毒膠囊中綠原酸和黃芩苷的方法。綠原酸和黃芩苷的含量測(cè)定方法前處理?xiàng)l件簡(jiǎn)便、快速，所建立的梯度洗脫方法靈敏、準(zhǔn)確，測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，實(shí)用性強(qiáng)。本實(shí)驗(yàn)實(shí)現(xiàn)了從多成分、系統(tǒng)化角度控制清熱解毒膠囊的質(zhì)量。

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Quality study on Qingre Jiedu capsule.

Liu Zhirong, Li Anping, Yang Xi, Yang Pingrong, Hu Xudong

(GansuProvincialInstituteofDrugControl,Lanzhou730070,China)

Honeysuckle, Fructus Gardeniae, Fructus Forsythiae, Radix Ophiopogonis, Radix Gentianae and Scutellaria Baicalensis were indentified by TLC. The content of chlorogenic acid and baicalin were determined by HPLC. The chromatographic separation was carried out on a CAPCELL PAK C18column (5 μm，4.6 mm×250 mm)with a mobile phase consisting of acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution in a gradient mode at a flow rate of 1.0 mL·min-1. The UV detection wavelength was set at 326 nm while the column temperature was at 30℃.There was a good linear relationship within the range of 0.0479-0.957μg (r = 0. 9999) and 0.153-3.064 μg (r = 0. 9999) for chlorogenic acid and baicalin, respectively. The average recoveries of the two components were 92.7% (RSD = 1.9%) and 98.9% (RSD = 2.0%), respectively. The method is simple, exclusive, accurate and can be used for determination and quality control of qingrejiedu capsules．

Qingre Jiedu capsule; TLC; HPLC; chlorogenic acid; baicalin

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)提高項(xiàng)目(53)

10.3969/j.issn.1001-232x.2017.03.017

2016-12-08