范紅晶+虞立+金偉鋒+李敏+周靜+李曉紅+張宇燕

[摘要] 探討原兒茶醛以及羥基紅花黃色素A單用與合用在高脂血癥大鼠體內(nèi)的藥動學及藥效學相關(guān)性研究。該實驗建立高脂血癥大鼠模型，尾靜脈注射液原兒茶醛（20 mg·kg^-1）及羥基紅花黃色素A（12 mg·kg^-1），采用HPLC-DAD測定不同時間內(nèi)原兒茶醛和羥基紅花黃色素A的血藥濃度，并繪制藥-時曲線；同時測定各時間點血漿中血小板活化因子（PAF），血漿a顆粒膜蛋白（GMP-140）含量，繪制時間-效應曲線；采用DAS 3.2.6軟件處理并進行相關(guān)性分析，比較分析單用及合用后原兒茶醛與羥基紅花黃色素A在模型大鼠體內(nèi)的藥動學差異以及藥效學指標的變化，評價原兒茶醛、羥基紅花黃色素A在高脂血癥大鼠體內(nèi)的影響作用。結(jié)果原兒茶醛、羥基紅花黃色素A在高脂血癥大鼠體內(nèi)單用及合用后，均符合三房室模型，模型組血漿中PAF及GMP-140明顯升高，給予藥物后在一定時間內(nèi)降低PAF及GMP-140在體內(nèi)的含量。原兒茶醛與羥基紅花黃色素A抗藥效指標的作用可能與其在體內(nèi)的水平高低有關(guān)，并且其血藥濃度與血漿中PAF及GMP-140的含量呈正相關(guān)。在高脂血癥大鼠體內(nèi)原兒茶醛和羥基紅花黃色素A具有一定的互為影響作用，并且合用后藥效學指標更好，同時也反映了原兒茶醛、羥基紅花黃色素A合用在臨床用藥的合理性。

[關(guān)鍵詞] 原兒茶醛；羥基紅花黃色素A；高脂血癥模型；藥動學；藥效學；聯(lián)合用藥

[Abstract] To study the pharmacokinetics-pharmacodynamics correlation of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A alone or their combination use in rats with hyperlipidemia. In this study， the hyperlipidemia model was established by intravenous injection of protocatechuic aldehyde （20 mg·kg^-1） and hydroxysafflor yellow A （12 mg·kg^-1）. The HPLC-DAD method was applied to determine the plasma concentration of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A at different time points and draw the drug effect-time curve. Meanwhile， the platelet activating factors （PAF） and plasma a granule membrane protein （GMP-140） contents were determined at different time points to draw the time-effect curve. Then DAS 3.2.6 software was used to process the data， analyze their correlation， and compare the difference of pharmacokinetics and pharmacodynamics of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A in hyperlipidemia rats after alone or their combined application， so as to evaluate the effect of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A on hyperlipidemia rats. According to the result， the pharmacokinetics and pharmacodynamics process of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A in hyperlipidemia rats after alone or their combination were consistent to the three-compartment model. In model group， the plasma PAF and GMP-140 were significantly increased， and the PAF and GMP-140 in vivo contents were decreased in a certain time after treatment. The effects of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A against the pharmacodynamic action may be related with their level in vivo， and their plasma concentration was positively related to the PAF and GMP-140 contents. The pharmacodynamic indexes were better after the combined use of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A， with certain influence on each other in hyperlipidemia rats；at the same time， it also reflected the rationality of protocatechuic aldehyde and hydroxysafflor yellow A combined application.

[Key words] protocatechuic aldehyde；hydroxysafflor yellow A；hyperlipidemia model；pharmacokinetics；pharmacodynamics；combination administration

丹紅注射液是由丹參、紅花所提取的經(jīng)典復方制劑[1]，具有活血化瘀、舒脈通絡等功效，目前，臨床上多用于治療多種心腦血管類疾病[2-3]。其中包括原兒茶醛和羥基紅花黃色素A等多種有效成分，二者均具有抗血栓形成，調(diào)節(jié)脂代謝抗動脈粥樣硬化，抗氧化等作用[4-6]。目前關(guān)于丹紅注射液在高脂血癥模型體內(nèi)的研究較少，尚未見到其有效成分原兒茶醛和羥基紅花黃色素A在高脂模型體內(nèi)的報道。本實驗旨在相關(guān)文獻的基礎(chǔ)上建立HPLC-DAD法，測定原兒茶醛和羥基紅花黃色素A在高脂血癥模型大鼠體內(nèi)的藥動學特征，測定相應時間點血漿中活化因子（PAF）、血漿a顆粒膜蛋白（GMP-140）活性指標研究其抗血栓能力，通過評定原兒茶醛和羥基紅花黃色素A在高脂血癥大鼠體內(nèi)中藥藥動學及藥效學過程的相關(guān)性，指導丹紅注射液為臨床用藥等提供合理參考方案。

1 材料

1.1 試劑與藥品 原兒茶醛（純度≥98%，批號140312，南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司）；羥基紅花黃色素A（純度≥98%，批號Z01010BA13，上海源葉生物技術(shù)有限公司）；對羥基苯甲酸（內(nèi)標物，純度≥99%，上海五連化工廠）；肝素鈉（批號2B010350，北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責任公司）；血小板活化因子（PAF）試劑盒（批號20160101A，上海源葉生物科技有限公司）；血漿a顆粒膜蛋白（GMP-140）試劑盒（批號20160101A，上海源葉生物科技有限公司）；總膽固醇（T-CHO）試劑盒（批號20150915，南京建成生物工程研究所）；甘油三酯（TG）試劑盒（批號20150914，南京建成生物工程研究所）；低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）試劑盒（批號20150915，南京建成生物工程研究所）；高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）試劑盒（批號2150915，南京建成生物工程研究所）；甲醇、乙腈（色譜純，Tedia公司）；水為超純水；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器 Agilent 1200型高效液相色譜系統(tǒng)（包括G1311A四元梯度泵、G1316A柱溫箱、G1315D 二極管陣列檢測器、G1315D DAD檢測器、G1322A在線脫氣機和化學工作站）；2-16PK離心機（德國Sigma公司）；XS205DU梅特勒精密天平（Mettler Toledo公司）；ND100-1氮氣吹掃儀（杭州瑞誠儀器有限公司）；QL-861渦旋混合儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；SK5210HP超聲波清洗儀器（上?？茖С晝x有限公司）；Cascada Bio MK2 超純水儀（美國Pall 公司）；SHB-ⅢA循環(huán)水式多用真空泵（河南省太康科教器材廠）；SpectraMax Plus 384酶標儀（美國MD公司）。

1.3 動物 SPF級SD雄性大鼠，體重（150±10） g，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，許可證號2013-0016。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫（26±2） ℃，濕度（45±5）%，適應性飼養(yǎng)7 d，自由飲水。普通基礎(chǔ)飼料由浙江中醫(yī)大學動物實驗研究中心提供，高脂飼料購自江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責任公司，配方為普通基礎(chǔ)飼料68%，蛋黃粉10%，膽固醇2%，豬油10%，蔗糖10%。

2 方法

2.1 溶液配制 精密稱取原兒茶醛和羥基紅花黃色素A對照品，溶于甲醇中，配制成1 g·L^-1的母液。精密稱取對羥基苯甲酸適量，并用甲醇配制為1 g·L^-1的對羥基苯甲酸溶液作為內(nèi)標母液，同時將內(nèi)標溶液稀釋5倍（0.2 g·L^-1）待用。

2.2 大鼠高脂血癥模型建立 根據(jù)大鼠的初始體重隨機選取6只作為正常對照組，喂養(yǎng)普通飼料，其余大鼠喂養(yǎng)高脂飼料，晝夜循環(huán)，每天12 h光照維持，自由飲水，于第6周禁食12 h后眼眶采血檢測血脂水平，血脂含量升高并與正常對照組差異顯著的大鼠作為成功高脂模型納入實驗，造模不成功大鼠舍棄，見表1。

2.3 分組給藥與樣品采集及預處理 將24只造模成功的SD高脂大鼠隨機分為4組，每組6只，分別為原兒茶醛組（20 mg·kg^-1）、羥基紅花黃色素A組（12 mg·kg^-1）、合用組（原兒茶醛20 mg·kg^-1+ 羥基紅花黃色素A 12 mg·kg^-1）以及模型組。藥物用0.9%的生理鹽水配制，采用尾靜脈給藥。于給藥后2，5，10，15，30，45，60，90，120，180，240，360 min眼眶取血0.5 mL，加入15 μL肝素鈉抗凝。3 000 r·min^-1離心12 min，精確量取上層血漿100 μL，即得含藥血漿樣品。大鼠含藥血漿樣品100 μL，加入15 μL內(nèi)標（0.2 g·L^-1）、300 μL甲醇，渦旋振蕩均勻5 min，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液氮氣吹干。液相進樣前，用100 μL流動相復溶，12 000 r·min^-1離心10 min，吸取上清液供HPLC測定。

2.4 色譜條件 Eclipse XDB-C₁₈色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相采用二元體系。A為0.2 %磷酸水溶液，B為乙腈，梯度洗脫0～13 min，6% B；13～15 min，6%～20% B；15～25 min，20%～30% B。進樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；流速為1 mL·min^-1。雙波長進行檢測，280 nm用于檢測原兒茶醛；403 nm用于檢測羥基紅花黃色素A。

2.5 專屬性考察 按2.4項色譜條件對處理后的空白血漿、混合對照品溶液和血漿樣品進行分析，見圖1。結(jié)果表明，在選定的色譜條件下，原兒茶醛和羥基紅花黃色素A與內(nèi)標對羥基苯甲酸分離完全，峰形良好，在27 min內(nèi)出峰完全，且和血漿內(nèi)源峰雜質(zhì)互不干擾，方法專屬性良好。

2.6 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液，用空白血漿進行稀釋，使藥物質(zhì)量濃度分別為1 000，250，62.5，15.63，3.91，1.95 mg·L^-1。取上述系列混合對照品血漿溶液，按照2.3項方法處理，2.4項方法色譜條件測定，記錄色譜圖和峰面積。分別以血漿中藥物的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），以藥物與內(nèi)標的峰面積比值為縱坐標（Y）作圖，得到2種成分的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，見表2。按照色譜峰信噪比S/N=3計，得原兒茶醛和羥基紅花黃色素A 的最低檢測限分別為1.17，1.29 mg·L^-1。

2.7 精密度試驗 在標準曲線線性范圍內(nèi)選擇各成分的低、中、高3個質(zhì)量濃度，見表3，以空白血漿配制成相應的標準血漿樣品，按照2.3項方法進行處理，按2.4條件進行色譜條件檢測。在1 d內(nèi)連續(xù)5次測定計算日內(nèi)精密度，1周內(nèi)連續(xù)5 d測定計算日間精密度。結(jié)果各成分的日內(nèi)、日間RSD均小于10%，符合生物樣品分析要求，見表3。

2.8 回收率試驗 取空白血漿配制上述各成分低、中、高3個質(zhì)量濃度的血漿樣品，每個質(zhì)量濃度平行5份，相同的樣品預處理方法和檢測條件測定。將各測定成分的峰面積與內(nèi)標峰面積之比代入回歸方程計算相應的濃度，并以測定值的平均值和配制的理論值進行比較，計算相對回收率，見表3。

2.9 穩(wěn)定性試驗 分別取原兒茶醛和羥基紅花黃色素A 在1 000，125，3.91 mg·L^-1 3個混合質(zhì)量濃度的標準血漿樣品，將含藥血漿在-20 ℃反復凍融3次，按照相同方法進行樣品預處理和測定。凍融后原兒茶醛RSD分別為97%，98%，96%；羥基紅黃色素A的RSD分別為93%，96%，92%，表明反復凍融后樣品穩(wěn)定性良好。

2.10 藥動學試驗 按照2.3項的血漿處理方法處理，按照2.4項中色譜條件進行測定，根據(jù)標準曲線得到各時間點藥物的血藥濃度，以血藥濃度為縱坐標，時間為橫坐標，繪制原兒茶醛和羥基紅花黃色素A的藥時曲線，計算藥動學參數(shù)。

2.11 藥效學試驗 按照試劑盒操作說明，分別對不同時相的血小板活化因子（PAF）和血漿a顆粒膜蛋白（GMP-140）的含量進行測定。

3 結(jié)果

3.1 藥動學試驗 由藥-時曲線以及藥動學參數(shù)可知，與單用相比較，在合用羥基紅花黃色素A后，原兒茶醛的藥動學參數(shù)血漿清除率（CL）顯著延長（P<0.01），而其他藥動學參數(shù)無顯著影響差異。在合用原兒茶醛后，羥基紅花黃色素A的一階矩血漿濃度時間曲線下面積（AUMC）、消除半衰期（t1/2）、血漿清除率（CL）均差異顯著（P<0.01）；其他藥動學參數(shù)均無明顯差異。合用與單用相比較，羥基紅花黃色素A的藥動學參數(shù)所受影響大于原兒茶醛，二者的配伍應用互相影響彼此在體內(nèi)的吸收、代謝，見圖2，表4。

3.2 藥效學試驗 實驗結(jié)果測得，正常大鼠的PAF質(zhì)量濃度為（60.93±2.64） ng·L^-1，GMP-140的質(zhì)量濃度為（29.54±0.44） μg·L^-1。而與正常組相比較，高脂血癥大鼠模型組血漿中PAF的質(zhì)量濃度為（101.44±3.37） ng·L^-1，統(tǒng)計差異顯著（P<0.01）；血漿中GMP-140質(zhì)量濃度為（47.54±0.63） μg·L^-1，統(tǒng)計差異顯著（P<0.01），其效應-時間曲線見圖3。

3.3 藥動學與藥效學結(jié)合的相關(guān)性分析 采用DAS 3.2.6 藥動學軟件，對原兒茶醛和羥基紅花黃色素A單用及合用在高脂血癥大鼠體內(nèi)血漿中PAF及GMP-140含量進行效應分析。通過計算每組的血藥濃度平均值，采用軟件以尾端校正回歸法進行智能化分析，選取最佳房室數(shù)和權(quán)重系數(shù)，作為擬合的最優(yōu)PK-PD模型。擬合結(jié)果見表5，原兒茶醛和羥基紅花黃色素A單用及合用的藥動學均以三房室擬合最優(yōu)，各成分的AIC，SBS均較小，各組擬合度均R²達到0.9，同時也表明各組成分擬合良好。

確定各組最佳房室模型后，將各成分血藥濃度和效應隨時間變化的數(shù)值輸入藥動學軟件PK-PD結(jié)合分析模塊，根據(jù)先定好的房室計算條件和不同的藥效學模型擬合，再根據(jù)藥效學評價指標R²，F(xiàn)，P等選擇最佳的藥效動力學模型。結(jié)果顯示采用Sigmoid Emax模型（Hill模型）擬合最優(yōu)，模型方程如下：E=Emax×Cγ / （ED₅₀γ+Cγ）。經(jīng)模型擬合，最終得出各組與PAF，GMP-140的結(jié)合模型參數(shù)，見表6，7。

實驗擬合結(jié)果表示，各組與PAF，GMP-140相關(guān)的藥效動力學方程擬合良好，F(xiàn)檢驗和P均小于0.05，各模型擬合出的預測值和實際值之間的離散度均較小，數(shù)值接近。

4 討論

中藥復方多成分的復雜性以及藥效作用的多靶點的特性，決定其在藥動學-藥效學集合模型研究的多樣性及復雜性[7-8]。近些年來，有關(guān)于原兒茶醛和羥基紅花黃色素A在體內(nèi)的報道較多[9-11]，但研究結(jié)果卻不盡相同，目前對于原兒茶醛及羥基紅花黃色素A在高脂血癥大鼠體內(nèi)的藥動學和藥效學相關(guān)性研究鮮少報道。在臨床中很多中藥制劑，例如丹紅注射液、冠心丹芍片、冠心靜膠囊、丹參注射液等[12]，常用于治療心腦血管類多種疾病，而其中原兒茶醛和羥基紅花黃色素A，是其中的主要有效成分，發(fā)揮不可替代的重要作用。在內(nèi)標物質(zhì)的選擇，本實驗嘗試使用對羥基苯甲酸丙酯，蘆丁作為內(nèi)標物質(zhì)，但分離效果均不明顯，因其與原兒茶醛的結(jié)構(gòu)相似，難以達到分離要求，并且血漿的內(nèi)源性雜質(zhì)干擾檢測，因此，選用對羥基苯甲酸作為本研究的內(nèi)標物質(zhì)，在本實驗確定的液相檢測條件下，血漿中的內(nèi)源物質(zhì)不干擾原兒茶醛及羥基紅花黃色素A和內(nèi)標（對羥基苯甲酸）物質(zhì)的測定，確定的檢測方法操作簡單，且精密度、重現(xiàn)性等均符合樣本生物要求。實驗結(jié)果說明，原兒茶醛和羥基紅花黃色素A在合用后血漿清除率（CL）顯著延長（P<0.01），尤其是對羥基紅花黃色素A的多個藥動學指標影響具有顯著性差異，說明合用后原兒茶醛與羥基紅花黃色素A彼此之間有一定相互影響，二者可以互相影響在高脂血癥大鼠體內(nèi)的藥動學行為參數(shù)。

高脂血癥是血栓類疾病中多種并發(fā)癥的重要因素，在疾病發(fā)生、發(fā)展的過程中，高脂血癥可促進血小板加速活化，繼而加速促進體內(nèi)血栓斑塊的形成，造成體內(nèi)血栓并發(fā)癥的發(fā)展。高脂血癥體內(nèi)所產(chǎn)生的脂代謝紊亂，以及多種氧化應激反應，易誘導血小板活化，產(chǎn)生多種重要介質(zhì)，釋放多種活性物質(zhì)，如血小板а顆粒膜蛋白-140（GMP-140）、血小板活化因子（PAF）、TXB₂、β血小板球蛋白（β-TG）等，誘導發(fā)生聚集反應[13-15]。亦有臨床研究顯示，高脂血癥的患者其血液中的血小板相關(guān)表達因子具有很高的活性。而血小板а顆粒膜蛋白-140（GMP-140）、血小板活化因子（PAF）是活化血小板中最特異和靈敏的指標物，因此本實驗在選擇藥效學指標中選擇GMP-140，PAF研究。本實驗分別檢測了原兒茶醛及羥基紅花黃色素A單用及合用后，高脂血癥大鼠在不同時間的血漿中的PAF，GMP-140的含量變化。結(jié)果表明，原兒茶醛及羥基紅花黃色素A均能夠降低血漿中PAF，GMP-140的含量，并且合用后對PAF，GMP-140的降低效果更加顯著，說明在高脂血癥模型中，血脂水平的紊亂異常，對血液的聚集有一定的顯著性影響，促進血小板聚集，血栓的形成。在給予原兒茶醛和羥基紅花黃色素A后，對血漿中PAF，GMP-140均有所影響。其中原兒茶醛可以降低血漿中PAF，GMP-140的含量，但在合用后明顯好于單用藥物組。同時羥基紅花黃色素A的合用組效果同樣也是稍好于單用組的實驗結(jié)果。說明二者在合用后，可以互相提高彼此在體內(nèi)的藥效利用程度，并且對血脂紊亂所造成的血液凝塊具有一定的抑制和保護作用，本實驗對原兒茶醛及羥基紅花黃色素A在不同時間的血藥濃度與PAF，GMP-140的活性進行PK-PD相關(guān)聯(lián)分析，表明PK-PD結(jié)合模型擬合良好（P<0.01），揭示了原兒茶醛及羥基紅花黃色素A在高脂血癥大鼠體內(nèi)的藥動學變化和藥效學變化具有良好的相關(guān)性。

由于中藥制劑成分復雜，在發(fā)揮藥效作用的時候是多種有效成分的同時發(fā)揮作用，是有效成分間相互協(xié)同作用的結(jié)果，因此，在進行中藥單體、制劑研究時，若以某種有效成分進行單獨藥動學藥效學研究，并不能完全反映中藥復方制劑的多成分、多靶點、協(xié)同作用的真實情況。因此在本實驗中，初期采用2種成分的單用及合用的藥動學-藥效學研究，并且會在后續(xù)的實驗中，建立多成分、多靶點的藥動學-藥效學研究，并建立多種合適的數(shù)學模型，進行全方位的研究分析，為指導臨床合理用藥提供參考。

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[責任編輯 張燕]