潘軍平+王俊+朱新華+吳亞夫+丁義濤

【摘要】目的：探討假性基因（MT1DP）在結(jié)直腸癌（CRC）組織及其癌旁組織中的表達(dá)水平，及假性基因（MT1DP）的表達(dá)與結(jié)直腸癌（CRC）預(yù)后的相關(guān)性。方法：我們研究了78例患者的CRC組織及其癌旁組織，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)MT1DP的mRNA表達(dá)水平，并進(jìn)一步評(píng)估其在結(jié)直腸癌中的臨床價(jià)值。結(jié)果：在78例CRC組織中有55例的MT1DP表達(dá)水平顯著下降（70.5%，P<0.001）。此外，CRC中MT1DP的表達(dá)水平與TNM分期（P=0.020）和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.005）密切相關(guān)。而且，CRC患者中低MT1DP表達(dá)者的總體生存率（OS）及無(wú)病生存率（DFS）更低（P分別為0.002和0.006）。另外，單因素和多因素Cox回歸分析進(jìn)一步明確MT1DP低表達(dá)可能是CRC患者的OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。結(jié)論：研究結(jié)果表明MT1DP低表達(dá)與CRC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，其有望成為結(jié)直腸癌患者一種新的診斷以及預(yù)后評(píng)價(jià)的生物標(biāo)志物。

【關(guān)鍵詞】結(jié)直腸癌；長(zhǎng)非編碼RNAs；MT1DP；預(yù)后

【中圖分類號(hào)】R735.3 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2095-6851（2017）06-00-01

1.引言：

大量證據(jù)表明lncRNAs表達(dá)異常與疾病的多樣性密切相關(guān)，包括人類惡性腫瘤[5，6]。在結(jié)直腸癌中，lncRNAs表達(dá)異常與腫瘤生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移密切關(guān)聯(lián)，而且其中一些在診斷與預(yù)測(cè)中頗具價(jià)值，例如：CCAT1[7]，HOTAIR[8]，UCA1[9]和MALAT1[10]在結(jié)直腸癌中高表達(dá)，而長(zhǎng)鏈非編碼RNALET[11]，MEG3[12]，GAS5[13]以及LOC285194[14]在結(jié)直腸癌組織中低表達(dá)。

最近發(fā)現(xiàn)肝癌中一種新的lncRNA，即金屬硫蛋白1D假性基因（MT1DP），它可以作為一種腫瘤抑制基因抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)。然而，結(jié)直腸癌中MT1DP表達(dá)與其潛在的臨床病理學(xué)作用之間的關(guān)系尚不明。在本研究中，我們旨在探索MT1DP在CRC組織及癌旁組織中的表達(dá)水平。以及其表達(dá)水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理學(xué)特征及預(yù)后價(jià)值的關(guān)系。

2.材料與方法：

2.1 患者的組織樣本

本研究共收集78例人體CRC組織及鄰近正常組織。所有患者均為近兩年在南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院接受結(jié)直腸癌手術(shù)的患者。入組均未接受術(shù)前放療或化療。組織樣本在外科手術(shù)離體后立即以液氮冷凍并儲(chǔ)存在-80℃用于進(jìn)一步分析?；颊咴敿?xì)的臨床特征列于表1。隨訪數(shù)據(jù)通過(guò)審查門診患者及通過(guò)電話或郵件隨訪患者。總生存期從最初的外科手術(shù)日期算起，直到死亡日期或隨訪的最后日期。該項(xiàng)目方案由南京大學(xué)和江蘇省醫(yī)學(xué)會(huì)倫理委員會(huì)通過(guò)，所有患者簽署知情同意書。

2.2 RNA分離和定量實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR（QRT-PCR）

根據(jù)TRlozol試劑說(shuō)明書（Invitrogen公司）提取組織樣本的所有RNA。RNA的濃度及純度以分光光度法在260nm和280nm處測(cè)定，只有A260/A280的OD值接近1.8～2.0的樣本進(jìn)行隨后的分析。使用PrimeScriptTMFirstStrandcDNA試劑盒（Takara，大連，中國(guó)）并根據(jù)其說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。qRT-PCR使用SYBRPremixExTaqTMII試劑盒（Takara公司），AppliedBiosystems7500PCRSystem（ABI，TX，USA）。MT1DP引物序列為5-ATTTCTGAGGCGAGAGGACT-3（正向）和5-GCAGGAGCAGCAGTTCTTCT-3（逆向）。GAPDH（內(nèi)參）序列為5-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3（正向）and5-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3（逆向）。PCR擴(kuò)增方案如下：95℃下5分鐘，在95℃下30秒進(jìn)行40個(gè)循環(huán)變性，在58℃下30秒退火，在72℃下20秒延伸。所有反應(yīng)一式三份進(jìn)行，比較循環(huán)閾值（CT）的方法和方程2-ΔΔCT用于量化MT1DP的表達(dá)水平。

3.統(tǒng)計(jì)分析：

組間差異的顯著性應(yīng)用Studentst檢驗(yàn)，檢驗(yàn)或Wilcoxon檢驗(yàn)進(jìn)行評(píng)價(jià)。建立受試者工作特征（ROC）曲線評(píng)價(jià)診斷價(jià)值。生存曲線構(gòu)建使用Kaplan-Meier方法和通過(guò)對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)進(jìn)行比較。單因素和多因素分析在Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回顧模型基礎(chǔ)上進(jìn)行。所有統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS18.0軟件（SPSS，Chicago，IL，USA）。雙側(cè)P值小于0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.結(jié)果：

4.1 MT1DP在CRC患者中表達(dá)下調(diào)

如圖1A，B所示，與癌旁組織相比，MT1DP在腫瘤組織中表達(dá)明顯下降，P<0.001。78例CRC患者中有55例腫瘤組織MT1DP的表達(dá)水平低于癌旁組織70.5%），腫瘤組織比癌旁組織中MT1DP的表達(dá)水平低1.52倍。

4.2 CRC中MT1DP下調(diào)的診斷價(jià)值

我們發(fā)現(xiàn)ROC曲線下面積（AUC）為0.714，95%可信區(qū)間（Cl）為0.636-0.783，靈敏度為88.46%（95%Cl：79.2-94.6），特異性為51.28%（95%Cl：39.7-62.8），Youden指數(shù)（J=0.3974）為最大值，P<0.001。（圖2）。

4.3 CRC患者M(jìn)T1DP表達(dá)與臨床特征的關(guān)系

我們根據(jù)78例CRC患者腫瘤組織中MT1DP表達(dá)水平的中位數(shù)為界，將78例患者分為低MT1DP組（n=39）和高M(jìn)T1DP組（n=39）。結(jié)果表明，CRC中MT1DP低水平組與TNM分期（P=0.020）及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（P=0.005）存在顯著相關(guān)性。相反的，MT1DP表達(dá)與其他臨床參數(shù)如年齡（P=0.365）、性別（P=0.610）、腫瘤大?。≒=0.103）、腫瘤位置（P=0.640）和腫瘤分化程度（P=0.147）之間無(wú)關(guān)聯(lián)（表1）。

4.4 MT1DP表達(dá)與CRC患者預(yù)后的關(guān)聯(lián)

生存分析表明，被分到兩組的患者的總存活率（OS）和無(wú)病生存率（DFS）的顯著差異是基于他們MT1DP表達(dá)水平的差異。具體表現(xiàn)為CRC患者中MT1DP低表達(dá)者的OS和DFS低于那些MT1DP高表達(dá)者（對(duì)數(shù)秩檢驗(yàn)，P=0.002和0.006，分別如圖3A，3B）。

另外，Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析用于進(jìn)一步評(píng)估MT1DP表達(dá)在CRC中對(duì)預(yù)后判斷的價(jià)值。單因素生存分析顯示，腫瘤大小、腫瘤分化程度、TNM分期、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和MT1DP表達(dá)與CRC患者的OS和DFS顯著相關(guān)（所有P<0.05）。相反的，其他臨床病理參數(shù)，如年齡、性別和腫瘤位置不是具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的預(yù)后因子（所有P>0.05，表2）。隨后，多因素Cox比例風(fēng)險(xiǎn)分析顯示MT1DP表達(dá)、TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與CRC患者的OS和DFS顯著相關(guān)（所有P<0.05，表2），這提示MT1DP可能是CRC的一個(gè)獨(dú)立預(yù)后因素。

5.討論

CRC仍是導(dǎo)致全球癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，其致死的主要原因是腫瘤的侵襲性及轉(zhuǎn)移[16-18]。根據(jù)癌癥統(tǒng)計(jì)，大約60%的CRC患者處于轉(zhuǎn)移的進(jìn)展?fàn)顟B(tài)。盡管最近已發(fā)展出多種治療方法，中晚期CRC患者預(yù)后仍然很差。

在本次研究中，我們提供了一種新的候選生物標(biāo)記物，即MT1DP，用于CRC的診斷、預(yù)后判斷和治療?；?8例CRC患者腫瘤與癌旁組織的qRT-PCR結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，MT1DP在CRC組織中顯著下調(diào)。ROC曲線表明MT1DP表達(dá)水平在CRC中具有潛在的診斷價(jià)值。我們也發(fā)現(xiàn)CRC中MT1DP低表達(dá)與TNM分期和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移密切先關(guān)，這提示MT1DP表達(dá)情況可以幫助我們預(yù)測(cè)CRC腫瘤分期和判斷進(jìn)展程度。連同前面肝癌研究中的發(fā)現(xiàn)，即MT1DP可以抑制肝癌細(xì)胞增殖和表型改變[15]，我們的數(shù)據(jù)顯示MT1DP可能在CRC致癌過(guò)程中發(fā)揮腫瘤抑制物的作用。

另一方面，我們的Kaplan-Meier分析表明MT1DP表達(dá)與CRC患者的OS和DFS密切關(guān)聯(lián)。另外，單因素和多因素Cox風(fēng)險(xiǎn)比例分析進(jìn)一步揭示MT1DP可能是CRC患者OS和DFS的獨(dú)立預(yù)后因素。因此，MT1DP可能有助于確定具有較高死亡風(fēng)險(xiǎn)的高風(fēng)險(xiǎn)CRC患者，并可能成為一種更積極的、有效的治療的候選靶點(diǎn)。

總的來(lái)說(shuō)，我們目前的研究首次報(bào)道了結(jié)直腸癌組織樣本中MT1DP水平的下調(diào)與結(jié)直腸癌患者的不良預(yù)后密切相關(guān)。此外，MT1DP有望成為結(jié)直腸癌患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。為結(jié)直腸癌患者的診斷及預(yù)后評(píng)估提供一條新途徑。

參考文獻(xiàn)

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[2]Morris V，Kopetz S.Clinical biomarkers in colorectal cancer.Clin Adv Hematol Oncol 2013；11：768-76.