穆 丹，陳榮娟

屋塵螨提取液對(duì)哮喘氣道上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的影響

穆 丹*，陳榮娟

目的 探究屋塵螨提取液(House dust mite extracets，HDM)對(duì)人支氣管上皮16-HBE細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelia-mesenchymal transition，EMT)的影響。方法 以16-HBE細(xì)胞株為研究對(duì)象，分別加入HDM和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (Transforming growth factor-β1，TGF-β1)，應(yīng)用MTT法和Western blot法，檢測(cè)細(xì)胞增殖情況以及EMT過程中E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)表達(dá)。結(jié)果 ①HDM刺激后，16-HBE細(xì)胞形態(tài)改變不顯著，同時(shí)對(duì)細(xì)胞增殖無(wú)顯著影響；與TGF-β1聯(lián)合作用后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生EMT變化，并且顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.05)。②HDM刺激對(duì)16-HBE細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)均無(wú)顯著影響；與TGF-β1聯(lián)合作用后，E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)升高(P<0.05)，效果較TGF-β1單獨(dú)應(yīng)用更為明顯。結(jié)論 HDM不能直接刺激上皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變，但可通過促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞EMT改變而發(fā)揮作用。

屋塵螨提取液；哮喘；氣道上皮細(xì)胞；間質(zhì)轉(zhuǎn)化；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1

0 引言

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見病，以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性和氣道重塑為主要特點(diǎn)，其中氣道重塑最為重要，其與哮喘嚴(yán)重程度密切相關(guān)，同時(shí)也是哮喘氣道病理改變的基礎(chǔ)[1-2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，氣道重塑可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1 (Transforming growth factor-β1，TGF-β1)誘導(dǎo)支氣管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelia-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)，進(jìn)而出現(xiàn)氣道上皮細(xì)胞特征性E-鈣黏蛋白(E-cadherin)表達(dá)減少，而間充質(zhì)細(xì)胞特征性α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin，α-SMA)、波形蛋白(Vimentin)等表達(dá)增加的現(xiàn)象[3-5]。目前，參與哮喘氣道EMT激活的關(guān)鍵機(jī)制尚不明確，因此，探討EMT的病理機(jī)制，對(duì)于阻抑氣道重塑的發(fā)生和發(fā)展具有重要的意義。屋塵螨提取物(House dust mite extracets，HDM)是一種引起哮喘的重要致敏原，被廣泛用于構(gòu)建動(dòng)物哮喘模型。已有研究發(fā)現(xiàn)，采用HDM構(gòu)建大鼠哮喘氣道重塑模型時(shí)出現(xiàn)上皮EMT，提示HDM在體內(nèi)可誘導(dǎo)氣道重塑[6-7]。然而，由于體內(nèi)環(huán)境受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等多種因素的影響，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)并不能證實(shí)HDM可直接誘發(fā)上皮細(xì)胞EMT。因此，本實(shí)驗(yàn)通過體外觀察HDM對(duì)正常人體支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE的影響，旨在進(jìn)一步明確HDM是否參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑和儀器 正常人支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；MTT、HDM購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；兔抗人α-SMA抗體、鼠抗人Vimentin單抗、鼠抗人E-cadherin單抗和兔抗人β-actin單抗、辣根過氧化物酶結(jié)合的二抗均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；高糖型DMEM培養(yǎng)基、二甲基亞砜均購(gòu)于HyClone公司，胎牛血清購(gòu)自Gibco公司；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱和全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀購(gòu)自Thermo Fisher公司；倒置光學(xué)顯微鏡(奧林巴斯CKX-41)購(gòu)自日本奧林巴斯株式會(huì)社。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞形態(tài)變化 正常人支氣管上皮細(xì)胞株16-HBE在含10%胎牛血清、終濃度分別為100 IU/mL和100 μg/mL的青鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃及5% CO2。當(dāng)細(xì)胞超過85%時(shí)棄去培養(yǎng)基，0.05%胰酶消化并收集細(xì)胞，離心，沉淀，按1∶1比例接種傳代。當(dāng)細(xì)胞傳至第3代，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合率時(shí)，以含1%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液同步化24 h，分為：①空白培養(yǎng)基對(duì)照組；②10 μg/L HDM組；③10 μg/L TGF-β1組；④聯(lián)合組：HDM (10 μg/L)+TGF-β1 (10 μg/L)，實(shí)驗(yàn)濃度通過查閱相關(guān)文獻(xiàn)確定[8]。各組細(xì)胞在相應(yīng)藥物處理后，培養(yǎng)72 h，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.2.2 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16-HBE細(xì)胞，將細(xì)胞數(shù)調(diào)整為5×104/mL，接種于96孔板中，實(shí)驗(yàn)按24 h、48 h、72 h分組，各時(shí)間組按“1.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行分組處理，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。各組于培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入5 mg/mL MTT 20 μL，培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，用酶標(biāo)儀在490 nm下測(cè)定各孔OD值，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

1.2.3 Western blot檢測(cè)E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的16-HBE細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)整為2×106/mL，按每孔100 μL接種于96孔板中，按“1.2.1”項(xiàng)下進(jìn)行分組處理，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，收集細(xì)胞用PBS洗滌2次，加入1×SDS上樣緩沖液300 μL，冰上放置30 min，超聲裂解細(xì)胞，4 ℃、15 000 r/min條件下離心10 min，收集上清為細(xì)胞裂解液。用BCA法進(jìn)行蛋白定量，10% SDA-PAGE垂直電泳分離，上樣量為25 μg/孔，轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)到聚乙烯二氟膜上，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，1∶2 000倍稀釋的兔抗人α-SMA抗體、1∶1 000倍稀釋的鼠抗人Vimentin單抗、1∶1 000倍稀釋的鼠抗人E-cadherin單抗、1∶4 000倍稀釋的兔抗人β-actin單抗室溫孵育1 h，加入1∶3 000倍稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗鼠或抗兔的二抗室溫孵育1 h，用ECL發(fā)光系統(tǒng)進(jìn)行顯影，對(duì)條帶進(jìn)行半定量分析，以β-actin作為內(nèi)參照，采用Gel-Pro Analysis圖像分析軟件測(cè)定條帶吸光度，以(條帶灰度×面積)/(內(nèi)參照的灰度×面積)作為目的蛋白表達(dá)水平的參數(shù)，對(duì)產(chǎn)物相對(duì)定量。

2 結(jié)果

2.1 HDM對(duì)16-HBE細(xì)胞形態(tài)的影響 在倒置顯微鏡下觀察各組16-HBE細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后，對(duì)照組貼壁形成規(guī)則排列的單層細(xì)胞，呈立方形、小鵝卵石形或橢圓形上皮細(xì)胞形態(tài)，胞間連接緊密，具有典型的上皮細(xì)胞鋪路石樣特征(圖1A)；HDM組部分細(xì)胞間黏附丟失，伸長(zhǎng)呈梭形，細(xì)胞簇分散，少許喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式(圖1B)；TGF-β1組部分細(xì)胞肥大，伸長(zhǎng)呈梭形，細(xì)胞間隙增大，大量細(xì)胞游離并表現(xiàn)為紡錘體型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)改變，喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式(圖1C)；聯(lián)合組細(xì)胞表現(xiàn)形態(tài)與TGF-β1組相似，較其更為明顯(圖1D)。

圖1 各組16-HBE細(xì)胞形態(tài)情況(400×)注：A.對(duì)照組，B.HDM組，C.TGF-β1組，D.聯(lián)合組

2.2 各組細(xì)胞增殖能力比較 與對(duì)照組相比，在0～72 h時(shí)，HDM組16-HBE細(xì)胞無(wú)明顯的增殖效果(P>0.05)；48～72 h時(shí)，TGF-β1組16-HBE細(xì)胞有明顯的增殖(P<0.05)；24～72 h時(shí)，聯(lián)合組16-HBE細(xì)胞有明顯的增殖(P<0.05)，并且作用時(shí)間越長(zhǎng)，對(duì)16-HBE細(xì)胞增殖效果越明顯。如表1所示。

表1 各組16-HBE細(xì)胞的增殖情況(n=4)

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

2.3 各組16-HBE細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)情況 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)16-HBE細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白表達(dá)情況，結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，TGF-β1組、聯(lián)合組E-cadherin蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，而Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。HDM組中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)與對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)果見圖2、表2。

圖2 各組16-HBE細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá) 表2 各組16-HBE細(xì)胞中E-cadherin、Vimentin和 α-SMA蛋白表達(dá)(n=4)

組別E-cadherin/β-actinVimentin/β-actinα-SMA/β-actin對(duì)照組0.92±0.140.35±0.090.24±0.06HDM組0.76±0.110.57±0.120.29±0.09TGF-β1組0.36±0.09*1.46±0.25*0.71±0.15*聯(lián)合組0.11±0.03*1.58±0.24*0.86±0.13*

注：*與對(duì)照組比較，P<0.05

3 討論

氣道上皮細(xì)胞作為呼吸系統(tǒng)主要的屏障，其重塑過程在哮喘的發(fā)病機(jī)制中的作用逐漸引起人們的關(guān)注。研究顯示，70%以上的難治性哮喘患者存在不同程度的氣道重塑[9-11]。早期研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞/肌成纖維母細(xì)胞的異常增多是氣道重塑的關(guān)鍵[12]。近年來(lái)，EMT學(xué)說(shuō)的提出為氣道重塑的機(jī)制研究提出新的思路。EMT是指氣道上皮細(xì)胞分化為間充質(zhì)細(xì)胞的一種現(xiàn)象，主要表現(xiàn)為E-cadherin蛋白表達(dá)減少或丟失，導(dǎo)致上皮失去極性，進(jìn)而獲得間質(zhì)細(xì)胞蛋白標(biāo)記如Vimentin和α-SMA，出現(xiàn)浸潤(rùn)性和游走遷移能力，可作為肌纖維母細(xì)胞一個(gè)新的來(lái)源[13-14]。因此，有效抑制氣道上皮細(xì)胞EMT改變可以作為治療哮喘的重要靶點(diǎn)。

目前，作為重要的致纖維化因子，TGF-β1在氣道重塑中的重要作用得到證實(shí)，其能誘導(dǎo)上皮細(xì)胞形態(tài)和生物學(xué)功能向間質(zhì)細(xì)胞分化，從而參與氣道纖維化而導(dǎo)致病理生理改變[15-16]。體外研究發(fā)現(xiàn)，損傷的氣道上皮細(xì)胞分泌的TGF-β1較正常細(xì)胞顯著提高；此外，亦有研究發(fā)現(xiàn)，哮喘患者氣道壁內(nèi)灌洗液的TGF-β1明顯增高[17-18]。TGF-β1可能是以自分泌的方式來(lái)介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞的EMT改變，其刺激能增加間充質(zhì)標(biāo)志物表達(dá)，同時(shí)下調(diào)上皮標(biāo)志物表達(dá)，從而提高細(xì)胞的遷移能力，這種作用主要通過蛋白激酶，如 MAPKS、P38、ERK、JNK的轉(zhuǎn)導(dǎo)來(lái)實(shí)現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，TGF-β1組較對(duì)照組能明顯促進(jìn)16-HBE細(xì)胞增殖，當(dāng)TGF-β1作用于16-HBE細(xì)胞72 h后，細(xì)胞發(fā)生典型的EMT改變，即細(xì)胞簇分散，細(xì)胞游離并轉(zhuǎn)化成紡錘體型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，喪失其原有鋪路石樣生長(zhǎng)方式。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TGF-β1組E-cadherin蛋白表達(dá)顯著降低，而Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)均顯著升高。研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道[19-20]一致，再次證實(shí)TGF-β1在氣道重塑中具有重要作用。

HDM是引起哮喘發(fā)病的主要過敏原之一，由于其誘發(fā)的哮喘模型能夠更好地反映人體的哮喘情況，因而備受關(guān)注。近年研究發(fā)現(xiàn)，HDM復(fù)制的哮喘動(dòng)物模型中出現(xiàn)氣道上皮發(fā)生EMT而參與哮喘氣道重塑[21]。然而體內(nèi)環(huán)境受神經(jīng)體液調(diào)節(jié)等多種因素的影響，HDM在動(dòng)物模型中與上皮細(xì)胞EMT發(fā)生的關(guān)系目前尚未形成定論。本研究結(jié)果顯示，HDM組對(duì)16-HBE細(xì)胞無(wú)明顯的增殖效果，并且當(dāng)HDM作用于16-HBE細(xì)胞72 h后，細(xì)胞仍大致表現(xiàn)出規(guī)則的橢圓形上皮細(xì)胞形態(tài)，僅少許細(xì)胞游離并表現(xiàn)為紡錘體型的成纖維細(xì)胞樣形態(tài)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HDM組中E-cadherin、Vimentin和α-SMA蛋白表達(dá)等方面與對(duì)照組無(wú)顯著性差異。提示HDM并不能直接刺激上皮細(xì)胞發(fā)生EMT改變。我們進(jìn)一步對(duì)HDM和TGF-β1聯(lián)合作用于16-HBE細(xì)胞進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)二者聯(lián)合作用在對(duì)細(xì)胞的增殖效果、細(xì)胞形態(tài)的EMT改變以及E-cadherin、Vimentin、α-SMA蛋白的表達(dá)均較TGF-β1單獨(dú)作用更為明顯，提示HDM可能通過促進(jìn)TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞EMT改變而發(fā)揮作用。

本研究表明，HDM并不能直接刺激氣道上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，只能間接通過TGF-β1誘導(dǎo)的上皮細(xì)胞EMT改變而發(fā)揮作用。當(dāng)然，若要進(jìn)一步明確HDM與TGF-β1誘導(dǎo)16-HBE細(xì)胞EMT之間的關(guān)系，尚需深入研究。

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Effects of house dust mite extracts on epithelial-mesenchymal transition of asthmatic airway epithelial cells

MU Dan*,CHEN Rong-juan

(the 3rd Ward of Respiratory,Liaoyang Central Hospital,Liaoyang 111000,China)

Objective To explore the role of house dust mite extracts (HDM) in the epithelial-mesenchymal transition (EMT) of human bronchial epithelial (16-HBE) cells.Methods Human bronchial epithelial cells (16-HBE) were treated with HDM and transforming growth factor-β1 (TGF-β1).After treatment for 72 h,the morphology and proliferation capacity of 16-HBE cells were investigated with light microscope and MTT method,and the expression of E-cadherin,Vimentin and α-SMA was tested by western blot.Results ①Treatment with HDM did not induce significant morphological change and proliferation of 16-HBE cells;HDM combined with TGF-β1 induced significant morphological changes and proliferation of 16HBE cells (P<0.05).②Treatment with HDM induced no significant change in E-cadherin,vimentin and α-SMA expression,but the expression of E-cadherin,vimentin and α-SMA changed significantly after the combination use of HDM and TGF-β1 (P<0.05).Conclusion HDM has no significant effect on EMT process of 16-HBE,but it can significantly enhance TGF-β1-induced EMT process.

House dust mite extracts;Asthma;Airway epithelial cell;Epithelial-mesenchymal transition;Transforming growth factor-β1

2016-11-09

遼陽(yáng)市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)三科，遼寧 遼陽(yáng) 111000

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707015