裴 祎，張曉晶，邢 浩，鄭 珂，商冠寧，王玉名，王 巍，邱恩鐸，薛 峰，王廣斌*

熊果酸抑制骨肉瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能

裴 祎1，張曉晶1，邢 浩1，鄭 珂1，商冠寧1，王玉名1，王 巍1，邱恩鐸1，薛 峰2，王廣斌2*

目的 檢測熊果酸對骨肉瘤細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移的影響。方法 將不同濃度熊果酸分別作用于人骨肉瘤細(xì)胞系U2OS細(xì)胞，MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖情況，Hochest 33258染色檢測細(xì)胞凋亡情況，Transwell實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。利用Western blot方法檢測熊果酸對相關(guān)蛋白的作用。結(jié)果 10、20、30 μg/mL熊果酸處理U2OS細(xì)胞24 h后，對其增殖的抑制率分別為39.51%±0.75%、48.91%±3.64%、56.49%±1.54%。熊果酸通過抑制cyclin d1蛋白抑制U2OS細(xì)胞的增殖，通過調(diào)節(jié)bcl-2和bax蛋白促進(jìn)U2OS細(xì)胞的凋亡。Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以劑量依賴的方式抑制U2OS細(xì)胞的遷移，其抑制作用是通過其對MMP2蛋白的抑制實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論 熊果酸可以抑制骨肉瘤細(xì)胞系U2OS細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移，可以作為臨床骨肉瘤治療的潛在化療藥物進(jìn)行進(jìn)一步探索。

熊果酸；U2OS；骨肉瘤；增殖；凋亡；遷移

0 引言

骨肉瘤是兒童及青少年最常見的惡性腫瘤之一，調(diào)查顯示，每年有大量患者死于骨肉瘤，與此同時，每年還會新增大量病例[1]。骨肉瘤的病因尚不清楚，環(huán)境、飲食習(xí)慣、遺傳等多種因素均可能導(dǎo)致骨肉瘤的發(fā)生。目前報道指出，骨肉瘤患者一般會發(fā)生一種或多種致癌基因或者抑癌基因的突變，因此，靶向治療對改善骨肉瘤患者生存率有著重要作用[2]。

熊果酸(Ursolic acid)又名烏索酸(烏蘇酸),是一種五環(huán)三萜類化合物。熊果酸在自然界廣泛分布，具有廣泛的生物活性。目前的研究指出，熊果酸可以對肝損傷起到一定的保護(hù)作用，也具有很好的抗菌抗病毒等作用，也有證據(jù)指出，熊果酸有一定的抗癌活性[3]。研究發(fā)現(xiàn),熊果酸不僅對多種致癌物質(zhì)有一定的抵抗作用,而且能夠顯著抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長。但是，熊果酸在骨肉瘤細(xì)胞中的研究目前尚無明確報道[4]。

本文以人骨肉瘤細(xì)胞U2OS作為研究對象，檢測了熊果酸對U2OS細(xì)胞生長與轉(zhuǎn)移的作用，并初步探究熊果酸通過調(diào)節(jié)哪些功能蛋白對U2OS細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移起抑制作用，為尋找新的骨肉瘤化療藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 U2OS細(xì)胞由我實(shí)驗(yàn)室長期保存，使用1640培養(yǎng)基(Invitrogen，美國)加10%胎牛血清(Gibco，美國)和1%的青鏈霉素培養(yǎng)。cyclin d1(sc-8396)、bcl-2(sc-509)、bax(sc-70407)、MMP2(sc-13594)、gapdh(sc-365062)抗體及相關(guān)二抗購自美國Santa Cruz。熊果酸購自于美國Selleck。MTT[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide]、臺盼藍(lán)購自于上海試劑總廠。

1.2 方法

1.2.1 MTT實(shí)驗(yàn) 取濃度為1×105個/mL處于對數(shù)生長期的U2OS細(xì)胞懸液200 μL，接種于96孔板中，12 h后加入不同濃度藥物處理，使用DMSO作為對照。藥物處理后分別取0、12、24、36、48、60 h 6個時間點(diǎn)添加MTT，孵育4 h后，棄去培養(yǎng)基，加入100 μL DMSO溶解結(jié)晶，于490 nm處記錄吸光值。抑制率計算公式為：抑制率(%)=1-(加藥處理細(xì)胞OD值/DMSO組OD值)×100%。

1.2.2 Hochest 33258染色實(shí)驗(yàn) 分別用不同濃度的藥物處理6孔板中的細(xì)胞24 h后，在培養(yǎng)孔中加入Hochest 33258染液，染色10 min后使用PBS清洗，隨后使用熒光顯微鏡觀察照相。

1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 取雙無培養(yǎng)基稀釋后濃度為1×104個/mL的U2OS細(xì)胞懸液200 μL接種于上室中，下室加600 μL含10%胎牛血清的培養(yǎng)基，12 h后使用藥物處理細(xì)胞，24 h后，乙醇固定10 min，0.4%臺盼藍(lán)染色。染色10 min后200倍顯微鏡觀察。

1.2.4 Western blot 藥物處理細(xì)胞24 h后收集細(xì)胞，通過裂解得到蛋白。取等量蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳。90～110 V電泳2 h、4 ℃下100 V轉(zhuǎn)膜1 h，洗膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，對應(yīng)一抗4 ℃晃動孵育過夜，洗膜后二抗室溫孵育1 h，洗膜后ECL發(fā)光儀發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，組間差異比較采用非配對t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 熊果酸對U2OS細(xì)胞增殖的影響 熊果酸可以抑制多種腫瘤細(xì)胞的生長，MTT實(shí)驗(yàn)表明，熊果酸可以顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖(P<0.05)，并且這種抑制作用有一定的劑量依賴性。cyclin d1蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖的關(guān)鍵蛋白，本研究表明，不同劑量熊果酸均可以抑制cyclin d1蛋白的表達(dá)。見圖1、圖2、表1。

圖1 熊果酸作用U2OS細(xì)胞的增殖情況

圖2 熊果酸對cyclin d1蛋白的調(diào)節(jié)作用 表1 不同時間點(diǎn)熊果酸對U2OS細(xì)胞增殖的抑制率(%)

時間DMSO10μg/mL20μg/mL30μg/mL12h033.13±2.34*36.61±2.43*40.48±0.80*#△24h039.51±0.75*48.91±3.64*#56.49±1.54*#△36h043.23±5.78*54.75±3.11*#60.53±0.24*#△48h045.02±2.48*54.83±5.02*#64.79±2.21*#△60h049.83±2.07*62.71±1.95*#70.88±0.55*#△

注：*與DMSO組比較，P<0.05；#與10 μg/mL組比較，P<0.05；△與20 μg/mL組比較，P<0.05

圖3 熊果酸對U2OS細(xì)胞凋亡的影響

2.2 熊果酸對U2OS細(xì)胞的凋亡作用 細(xì)胞的生長一般是通過增殖與凋亡雙重因素調(diào)節(jié)。Hochest 33258染色實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度熊果酸對U2OS細(xì)胞的凋亡情況均有一定的促進(jìn)作用。熊果酸可以抑制bcl-2蛋白的表達(dá)并且促進(jìn)bax蛋白的表達(dá)，說明熊果酸可能通過調(diào)節(jié)bcl-2和bax蛋白來影響U2OS細(xì)胞的凋亡。見圖3、圖4。

圖4 熊果酸對bcl-2和bax蛋白的影響

2.3 熊果酸對U2OS細(xì)胞遷移的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)表明，不同濃度的熊果酸對U2OS細(xì)胞的遷移能力均有一定的抑制作用，熊果酸作用后細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.05)。基質(zhì)金屬蛋白酶是調(diào)節(jié)細(xì)胞遷移能力的重要蛋白，其中MMP2在多種腫瘤細(xì)胞中被證明可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移，本研究表明，熊果酸可以抑制MMP2的表達(dá)。見圖5、圖6。

圖5 熊果酸對MMP2的作用

3 討論

惡性腫瘤正在成為危害人類健康的第一殺手，流行病學(xué)調(diào)查表明，我國現(xiàn)在有癌癥患者300多萬人，每年死亡人數(shù)不少于三分之一，而且每年會有超過百萬的新增病例，其中骨肉瘤作為青少年高發(fā)的腫瘤日益引起人們的關(guān)注[5]。

化療是惡性腫瘤治療中不可或缺的一部分，對于延長患者生命及改善生存質(zhì)量有很大的幫助。然而，對于大多數(shù)實(shí)體瘤的患者，化療很難大幅度提高其生存期。同時，目前現(xiàn)有的化療藥物大多存在選擇性差、毒副作用高等缺點(diǎn)。有必要尋找高效、特異性高的抗腫瘤藥物。目前，大量基礎(chǔ)研究與臨床實(shí)踐表明，中藥在腫瘤的防治與康復(fù)方面均能發(fā)揮重要作用。天然產(chǎn)物具有來源可靠、安全性高等特點(diǎn)，因此，可以作為新藥研發(fā)的主要來源。目前，來源于植物藥物的抗癌制劑約占總抗癌藥物的32%[6]。目前使用的抗癌藥中，秋水仙堿、長春堿、紫杉醇等均是由天然產(chǎn)物提取分離得到的。中藥也可以配合化療藥物使用，在降低化療藥物產(chǎn)生毒副作用的同時，也可以對化療藥物起到增敏作用[7]。近年研究表明，熊果酸具有抗癌功能，報道指出，熊果酸作用于A431細(xì)胞后，可以表現(xiàn)出細(xì)胞毒和抑制細(xì)胞生長的雙重作用，也可以通過細(xì)胞周期阻滯抑制HCT15細(xì)胞的生長，同時，熊果酸也被證明可以抑制口腔鱗癌細(xì)胞、白血病細(xì)胞和淋巴癌等多種腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能[8-12]。

圖6 熊果酸對U2OS細(xì)胞遷移能力的作用

本研究中，我們檢測了熊果酸對于骨肉瘤細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。首先，通過MTT實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以顯著抑制U2OS細(xì)胞的增殖，這種抑制作用隨著熊果酸濃度的增加而增大，隨后的Western blot實(shí)驗(yàn)證明了熊果酸可以抑制細(xì)胞周期關(guān)鍵蛋白cyclin d1，由此我們推斷，熊果酸對細(xì)胞增殖的抑制作用可能是通過對cyclin d1蛋白的抑制作用實(shí)現(xiàn)的。隨后通過Hochest 33258染色實(shí)驗(yàn)證實(shí)，熊果酸不但可以通過抑制細(xì)胞的增殖來抑制細(xì)胞的生長，也可以通過促進(jìn)細(xì)胞的凋亡來減緩腫瘤細(xì)胞的生長，熊果酸對U2OS細(xì)胞凋亡的作用可能是通過其對bcl-2和bax的調(diào)節(jié)作用實(shí)現(xiàn)的。腫瘤的高侵襲能力是腫瘤威脅人們生命健康的利器，一旦發(fā)生遠(yuǎn)隔轉(zhuǎn)移，患者的生存期往往不長。我們研究發(fā)現(xiàn)，熊果酸可以通過抑制MMP2蛋白的表達(dá)來抑制U2OS細(xì)胞的遷移能力。

綜上所述，熊果酸對骨肉瘤細(xì)胞系U2OS細(xì)胞的生長和遷移有一定的抑制作用，同時熊果酸還有毒副作用小等優(yōu)勢，這為臨床上骨肉瘤的化療提供了新的理論依據(jù)。

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Biological function of inhibition of osteosarcoma cells by ursolic acid

PEI Yi1,ZHANG Xiao-jing1,XING Hao1,ZHENG Ke1,SHANG Guan-ning1,WANG Yu-ming1,WANG Wei1,QIU En-duo1,XUE Feng2,WANG Guang-bin2*

(1.Department of Bone and Soft Tissue Surgery,Cancer Hospital of China Medical University,Liaoning Cancer Hospital & Institute,Shenyang 110042,China;2.Department of Orthopaedics,Shengjing Hospital of China Medical University,Shenyang 110004,China)

Objective To detect the effect of ursolic acid on the growth and metastasis of osteosarcoma cells.Methods Different concentrations of ursolic acid were applied to human osteosarcoma cell line U2OS cells.The cell proliferation was detected by MTT assay.Hochest 33258 assay was used to detect the apoptosis of U2OS cells.The cell metastasis was detected by Transwell assay.Western blot was used to detect the effect of ursolic acid on U2OS cells-associated proteins.Results At 24 h after treatment with 10,20 and 30 μg/mL of ursolic acid for U2OS cells,the inhibition rates of proliferation were 39.51%±0.75%，48.91%±3.64% and 56.49%±1.54%.Ursolic acid could inhibit the proliferation of U2OS cells by inhibiting cyclin d1 protein,and promote the apoptosis of U2OS cells by regulating bcl-2 and bax.Transwell experiments showed that ursolic acid could inhibit the migration of U2OS cells in a dose-dependent manner,which was achieved by the inhibition of MMP2.Conclusion Ursolic acid can inhibit the proliferation and metastasis of osteosarcoma U2OS cells,which can be further explored as potential chemotherapy drugs in osteosarcoma.

Ursolic acid;U2OS;Osteosarcoma;Proliferation;Apoptosis;Migration

2016-12-23

1.中國醫(yī)科大學(xué)腫瘤醫(yī)院 遼寧省腫瘤醫(yī)院骨與軟組織腫瘤科，沈陽 110042;2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院骨科，沈陽 110004

*通信作者

10.14053/j.cnki.ppcr.201707005