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        山東省辣椒主要病毒種類(lèi)的分子檢測(cè)與鑒定

        2017-07-31 23:47:33王少立譚瑋萍楊園園代惠潔孫曉輝喬寧竺曉平
        關(guān)鍵詞:進(jìn)化樹(shù)侵染辣椒

        王少立,譚瑋萍,楊園園,代惠潔,孫曉輝,喬寧 , ,竺曉平

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        山東省辣椒主要病毒種類(lèi)的分子檢測(cè)與鑒定

        王少立1,譚瑋萍1,楊園園1,代惠潔2,孫曉輝1,喬寧1, 2,竺曉平1

        (1山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/山東省蔬菜病蟲(chóng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東泰安 271018;2濰坊科技學(xué)院,山東壽光262700)

        【目的】鑒定山東省辣椒上的主要病毒種類(lèi),明確該地區(qū)辣椒上的主要病毒病原?!痉椒ā?014—2015年,在山東省臨沂、日照、青島、煙臺(tái)、濰坊、淄博、濟(jì)寧、菏澤、聊城、德州共10個(gè)市(區(qū))采集253份疑似感病的辣椒植株葉片,提取葉片總RNA和總DNA,利用雙生病毒的通用引物(PA/PB)、馬鈴薯卷葉病毒屬通用引物(POL-F/POL-R)及已報(bào)道侵染辣椒的主要病毒的檢測(cè)引物對(duì)樣品進(jìn)行PCR、RT-PCR分子檢測(cè)與鑒定,將擴(kuò)增得到的目的條帶經(jīng)凝膠回收試劑盒回收純化后連接到pMD18-T載體上,再送至公司進(jìn)行克隆測(cè)序。分別將所得的PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進(jìn)行檢索,利用DNAStar軟件中的Megalign將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進(jìn)行同源性比對(duì),利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進(jìn)行多序列比對(duì)分析以及鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中各分支置信度(Bootstrap)進(jìn)行1 000次重復(fù)分析?!窘Y(jié)果】 PMMoV、CMV總檢出率分別為61.66%、60.08%;TMGMV、BBWV-2、BWYV、TMV發(fā)生也比較普遍,檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV、AMV發(fā)生侵染現(xiàn)象較少,檢出率分別為11.86%、9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、3.16%、0.79%和0.40%;未檢測(cè)到CaCV、PSV、ChiRSV、TSWV和ToMMV。通過(guò)對(duì)病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),病毒復(fù)合侵染率高達(dá)89.92%,其中3種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象最多,所占比例達(dá)28.63%,4種病毒復(fù)合侵染率為25.00%,2種病毒復(fù)合侵染率為21.77%,5種病毒復(fù)合侵染率為13.31%,一個(gè)辣椒樣品最多可同時(shí)感染6種病毒,侵染率為1.21%;對(duì)山東省10個(gè)地區(qū)的辣椒病毒檢測(cè),結(jié)果表明在辣椒上檢出病毒種類(lèi)最多的為臨沂、濟(jì)寧,檢測(cè)到12種病毒,其次是煙臺(tái)、聊城,檢測(cè)到11種病毒,濰坊、菏澤檢測(cè)到9種病毒,青島、德州檢測(cè)到8種病毒,日照檢測(cè)到7種病毒,淄博檢測(cè)到6種病毒,日照地區(qū)辣椒病毒復(fù)合侵染率最高,為100%,菏澤地區(qū)復(fù)合侵染率最低,為69.23%。分別根據(jù)PMMoV的部分基因序列、PeVYV部分、、基因序列以及BWYV部分、基因序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),結(jié)果表明本研究PMMoV山東分離物SD60與中國(guó)貴州分離物的親緣關(guān)系最近,PeVYV山東分離物SDRZ31-1與意大利IT83分離物的親緣關(guān)系最近,BWYV山東分離物SD與韓國(guó)分離物L(fēng)S的親緣關(guān)系最近?!窘Y(jié)論】在山東省采集的253份辣椒樣品可被15種病毒侵染,PMMoV、CMV為主要病毒種類(lèi);在山東新檢測(cè)到的病毒有MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2;明確了山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)病毒病發(fā)生情況以及病毒種類(lèi)的主次關(guān)系。

        辣椒病毒??;辣椒輕斑駁病毒;甜菜西方黃化病毒;甜瓜蚜傳黃化病毒;復(fù)合侵染

        0 引言

        【研究意義】辣椒()作為一種重要的蔬菜作物,不僅營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高,還是重要的調(diào)味料。近年來(lái),中國(guó)辣椒種植面積不斷擴(kuò)大,年播種面積在150—200萬(wàn)hm2,占全國(guó)蔬菜總播種面積的8%—10%,居蔬菜首位[1]。隨著辣椒種植規(guī)模的逐步擴(kuò)大,辣椒病毒病也愈發(fā)嚴(yán)重,已成為危害辣椒生產(chǎn)中的首要病害,給農(nóng)民造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,制約著辣椒產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。山東省是全國(guó)6大辣椒主產(chǎn)區(qū)之一,種植規(guī)模逐年擴(kuò)大,但是辣椒病毒病的發(fā)生也比較普遍,是制約辣椒產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素。因此,明確山東省辣椒主要病毒種類(lèi),對(duì)于辣椒病毒病的防控預(yù)警具有重要意義?!厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)外報(bào)道侵染辣椒的病毒達(dá)67種[2],而國(guó)內(nèi)現(xiàn)已鑒定出侵染辣椒的病毒種類(lèi)有22種。辣椒能被黃瓜花葉病毒(,CMV)、煙草花葉病毒(,TMV)、辣椒輕斑駁病毒(,PMMoV)、辣椒斑駁病毒(,PepMoV)、辣椒脈斑駁病毒(,PVMV)、蠶豆萎蔫病毒(,BBWV)、馬鈴薯Y病毒(,PVY)、馬鈴薯X病毒(,PVX)、煙草蝕紋病毒(,TEV)、辣椒環(huán)斑病毒(,ChiRSV)、苜?;ㄈ~病毒(,AMV)、煙草脆裂病毒(,TRV)、番茄斑萎病毒(,TSWV)、花生黃斑病毒(,GYSV)、辣椒褪綠病毒(,CaCV)、番茄花葉病毒(,ToMV)、蕪菁花葉病毒(,TuMV)[3-12]、煙草輕型綠花葉病毒(,TMGMV)[13]、辣椒脈斑駁病毒(,ChiVMV)[14-15]等RNA病毒侵染;另外還被番茄黃化曲葉病毒(,TYLCV)、煙草曲莖病毒(,TbCSV)及中國(guó)辣椒黃化曲葉病毒(,PYLCCNV)[16-18]等DNA病毒侵染。近幾年發(fā)現(xiàn)侵染辣椒的病毒還有甜菜西方黃化病毒(,BWYV)[19]、番茄褪綠病毒(,ToCV)[20]。山東省作為重要的辣椒產(chǎn)區(qū),辣椒病毒病發(fā)生也比較嚴(yán)重,楊超等[21]對(duì)侵染山東辣椒的黃瓜花葉病毒進(jìn)行了研究,結(jié)果表明CMV是山東省辣椒病毒病的主要毒源之一;劉春香等[22]對(duì)壽光地區(qū)侵染辣椒的TYLCV進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該地區(qū)的辣椒TYLCV感染率較高?!颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】山東是蔬菜大省,設(shè)施和露地辣椒種植面積較大,辣椒連作導(dǎo)致病毒病暴發(fā),對(duì)辣椒的產(chǎn)量和品質(zhì)具有重大影響,對(duì)辣椒生產(chǎn)的危害日益擴(kuò)大,目前還缺少對(duì)侵染山東地區(qū)辣椒的主要病毒種類(lèi)全面系統(tǒng)的研究,也沒(méi)有山東省辣椒上病毒復(fù)合侵染情況的相關(guān)報(bào)道?!緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】明確山東辣椒病毒病病原的具體種類(lèi)和病毒種類(lèi)的主次關(guān)系,以及是否出現(xiàn)新病毒病害,為針對(duì)性地預(yù)警和防控提供理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        試驗(yàn)于2014—2016年在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院完成。

        1.1 材料

        2014—2015年,在山東省的臨沂、日照、青島、煙臺(tái)、濰坊、淄博、濟(jì)寧、菏澤、聊城、德州等地共采集花葉、畸形、壞死等疑似感染病毒病的辣椒樣品253份,于-20℃冰箱中備用。

        植物RNA提取試劑Trizol、DNA聚合酶、dNTPs及植物總RNA、DNA提取試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司;分子量標(biāo)準(zhǔn)Normal Run 250 bp-Ⅱ DNA ladder由上海捷瑞生物技術(shù)有限公司提供;凝膠回收試劑盒由AXYGEN生物技術(shù)有限公司提供;反轉(zhuǎn)錄試劑RNase M-MLV(RNase H-)、Recombinant Rnase Inhibitor由寶生物工程(TaKaRa)有限公司提供;其他生化試劑及普通化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

        1.2 總RNA和DNA提取、RT-PCR和PCR

        分別根據(jù)試劑盒說(shuō)明從辣椒樣品中提取總RNA、DNA。以辣椒感病葉片總RNA為模板,以各病毒特異性引物的下游引物為反轉(zhuǎn)錄引物,使用M-MLV合成病毒cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(5 μL):RNA模板1.5 μL,下游引物0.5 μL,Rnase-Free H2O 1.0 μL,70℃變性10 min,立即放置冰上2 min,再加入以下試劑:5×M-MLV Buffer 1.0 μL,dNTP mixture(10 mmol·L-1)0.25 μL,RTase M-MLV(RNase H-)(200 U·μL-1)0.25 μL,RNase Inhibitor(40 U·μL-1)0.125 μL,RNase-Free H2O 0.375 μL,總體積為5 μL。42℃保溫60 min,再70℃保溫15 min。

        PCR反應(yīng)體系:取上述合成的cDNA或DNA液2 μl,加入2.5 μL 10×EasyTaq Buffer,1 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1),上下游引物各1 μL,0.5 μLDNA聚合酶,17 μL ddH2O。擴(kuò)增條件:94℃3 min后,94℃ 30 s、X℃ 30 s(溫度見(jiàn)表1)、72℃ 50 s,共30次循環(huán),最后,72℃10 min。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,檢測(cè)并拍照。

        1.3 PCR產(chǎn)物的回收及測(cè)序

        將PCR電泳目的條帶參照凝膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行純化、克隆,測(cè)序由鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司完成,測(cè)序結(jié)果提交NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)序列比對(duì)。

        1.4 PMMoV、PeVYV和BWYV序列分析

        從采集的感病樣品中分別選取具有代表性PMMoV、辣椒脈黃化病毒(,PeVYV)和BWYV陽(yáng)性克隆送鉑尚生物技術(shù)(上海)有限公司測(cè)序。分別將所得PMMoV、PeVYV和BWYV序列在NCBI上利用BLAST進(jìn)行檢索,利用DNAStar軟件中的Megalign 將所得序列與GenBank中已登錄的世界各地有代表性的序列進(jìn)行同源性比對(duì),利用軟件Mega 5.05的Clustal W法進(jìn)行多序列比對(duì)分析以及鄰接法(neighbor-joining,NJ)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中各分支置信度(Bootstrap)進(jìn)行1 000次重復(fù)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 侵染山東省辣椒的主要病毒種類(lèi)及檢測(cè)結(jié)果

        對(duì)采集的253份辣椒樣品提取總RNA,利用特異性引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳檢測(cè)分析(圖1)。

        對(duì)采集的辣椒樣品進(jìn)行PCR、RT-PCR檢測(cè),結(jié)果表明(表2)檢出的病毒種類(lèi)有15種:PMMoV、CMV、TMGMV、BBWV、BWYV、TMV、ToMV、TYLCV、PVY、甜瓜蚜傳黃化病毒(,MABYV)、PeVYV、辣椒潛隱病毒1(,PCV-1)、辣椒潛隱病毒2(2,PCV-2)、AMV和ChiVMV,而未檢測(cè)到CaCV、花生矮化病毒(,PSV)、ChiRSV、TSWV和番茄斑駁花葉病毒(,ToMMV)。有5個(gè)樣品未檢測(cè)到病毒,病毒檢出率高達(dá)98.02%。

        表1 山東省辣椒病毒檢測(cè)所用引物

        山東省10個(gè)地區(qū)的辣椒病毒檢測(cè)結(jié)果表明在辣椒上檢出病毒種類(lèi)最多的地區(qū)是臨沂、濟(jì)寧,檢測(cè)到12種病毒,其次是煙臺(tái)、聊城,檢測(cè)到11種病毒,濰坊、菏澤檢測(cè)到9種病毒,青島、德州檢測(cè)到8種病毒,日照檢測(cè)到7種病毒,淄博檢測(cè)到6種病毒。

        在檢出的病毒中(圖2),PMMoV與CMV的檢出率較高,分別為61.66%、60.08%,可能是危害山東省辣椒的主要病毒;TMGMV、BBWV、BWYV和TMV的侵染現(xiàn)象普遍,總檢出率為41.90%、34.78%、33.20%和24.90%;PCV-2、ToMV、TYLCV、PVY、MABYV、CABYV、PeVYV、PCV-1、ChiVMV和AMV的侵染現(xiàn)象較少,檢出率分別為9.88%、9.09%、6.72%、5.53%、3.56%、0.79%和0.40%,其中MABYV、PeVYV、BWYV、PCV-1和PCV-2,是山東省最新檢測(cè)到侵染辣椒的病毒。

        表2 山東省辣椒上主要病毒的檢測(cè)結(jié)果

        2.2 辣椒上病毒的復(fù)合侵染情況

        在248份陽(yáng)性樣品中,僅發(fā)現(xiàn)25份樣品為單一病毒的侵染,其余樣品為2種及以上病毒的復(fù)合侵染,復(fù)合侵染率為89.92%,其中以3種病毒復(fù)合侵染所占比例最高,為28.63%,4種病毒復(fù)合侵染率為25.00%,2種病毒的復(fù)合侵染率為21.77%,5種病毒復(fù)合侵染率為13.31%,6種病毒復(fù)合侵染率為1.21%。結(jié)果表明,山東地區(qū)辣椒上病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象嚴(yán)重。

        病毒復(fù)合侵染類(lèi)型由圖3可知,2種病毒復(fù)合侵染類(lèi)型主要是CMV+PMMoV,3種病毒復(fù)合侵染類(lèi)型復(fù)雜,主要是CMV+BWYV+PMMoV,4種病毒復(fù)合侵染類(lèi)型主要是CMV+PMMoV+BWYV+BBWV,5種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象較少,其中CMV+PMMoV+TMGMV+ BBWV+TMV是主要侵染類(lèi)型,在所有樣品中只發(fā)現(xiàn)了3個(gè)樣品為6種病毒復(fù)合侵染,侵染類(lèi)型是CMV+ TMV+ToMV+TMGMV+BWYV+PMMoV、CMV+ TMV+PVY+ToMV+PeVYV+PCV-2、CMV+TMV+ TMGMV+BWYV+ PCV-1+PCV-2。

        對(duì)山東省主要辣椒產(chǎn)區(qū)的復(fù)合侵染現(xiàn)象進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)日照地區(qū)辣椒病毒復(fù)合侵染率最高,為100%,菏澤地區(qū)復(fù)合侵染率最低,為69.23%。聊城、德州、濟(jì)寧、煙臺(tái)、淄博地區(qū)以3種病毒復(fù)合侵染為主,濰坊、菏澤地區(qū)以4種病毒復(fù)合侵染為主,臨沂地區(qū)以5種病毒復(fù)合侵染為主,青島地區(qū)多以4種、5種病毒復(fù)合侵染為主,日照地區(qū)多為3種、4種、5種病毒復(fù)合侵染。

        2.3 PMMoV、PeVYV、BWYV系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

        2.3.1 PMMoV基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 將PMMoV的基因序列與NCBI上的相應(yīng)序列進(jìn)行了比對(duì),并對(duì)其進(jìn)行核苷酸相似性分析,結(jié)果表明所得到的分離物與其他序列相似性為94.7%—99.5%,其中與中國(guó)貴州分離物(KC571248)相似性最高,為99.5%。所構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)也顯示,本研究所得的PMMoV山東分離物SD60(KR261606)與中國(guó)貴州分離物(KC571248)的親緣關(guān)系最近,聚集在一個(gè)進(jìn)化枝上,并且與核苷酸相似性分析結(jié)果相同(圖4)。

        2.3.2 PeVYV基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 本研究所獲得的PeVYV部分序列(對(duì)應(yīng)基因組2 888—3 843位,共956 bp,NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中PeVYV這一段序列登錄較多)上傳到NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中,序列包括部分編碼區(qū),并獲得了相應(yīng)的登錄號(hào)(KR226803)。運(yùn)用DNAStar的Megalign軟件,將本研究所得的PeVYV的序列與世界各地的相關(guān)序列進(jìn)行核苷酸相似性分析,結(jié)果表明其與選取序列的核苷酸相似性為94.4%—97.8%,與意大利分離物IT83相似性最高,為97.8%。利用Mega 5.05的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù),如圖5所示。本研究所得的PeVYV分離物SDRZ31-1(KR226803)與意大利分離物IT83(KU886193)的親緣關(guān)系最近,聚類(lèi)在同一分支上,這與核苷酸相似性分析結(jié)果一致。

        2.3.3 BWYV基因序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 由于在NCBI核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)中,BWYV的全基因組序列較少,因此本研究選取其中長(zhǎng)411 bp的序列(對(duì)應(yīng)基因組3 562—3 972位,NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中這一段序列登錄較多),包含部分的,將該段序列與世界各地的相應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)。對(duì)BWYV序列進(jìn)行核苷酸相似性分析,結(jié)果表明與選取的國(guó)內(nèi)外序列核苷酸相似性為86.6%—98.5%,與韓國(guó)分離物L(fēng)S(KM076647)相似性最高,為98.5%。為了更好地分析BWYV的進(jìn)化歷程和親緣關(guān)系,選取世界各地有代表性的BWYV序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中,可以看出BWYV山東分離物SD與韓國(guó)分離物L(fēng)S(KM076647)的親緣關(guān)系最近,與核苷酸相似性分析結(jié)果一致,從而明確了該分離物隸屬于BWYV(圖6)。

        3 討論

        辣椒是一種重要的蔬菜,近年來(lái),中國(guó)辣椒的種植面積逐年上升,但受辣椒病毒病的危害日益嚴(yán)重,對(duì)辣椒生產(chǎn)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。北京[3]、天津[3,34]、遼寧[3]、江蘇[3]、吉林[3]、新疆[3]、重慶[4,20]、陜西[5,13]、四川[8]等地均對(duì)辣椒上的病毒種類(lèi)進(jìn)行過(guò)系統(tǒng)的研究。雖然前人對(duì)山東省侵染辣椒的CMV、TYLCV進(jìn)行過(guò)研究,但缺乏對(duì)山東省辣椒上的病毒進(jìn)行全面系統(tǒng)的調(diào)查研究。

        本研究對(duì)山東省辣椒病毒病進(jìn)行系統(tǒng)的調(diào)查與檢測(cè),結(jié)果表明目前侵染山東省辣椒的病毒種類(lèi)有15種,病毒檢出率較高,且復(fù)合侵染現(xiàn)象比較嚴(yán)重。通過(guò)對(duì)病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),其中3種病毒復(fù)合侵染現(xiàn)象最多,4種和2種復(fù)合侵染的次之,一個(gè)辣椒樣品最多被6種病毒同時(shí)侵染。PMMoV能與CMV、TMV、PVY、ToMV、BBWV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復(fù)合侵染,CMV與TMV、PVY、ToMV、BBWV、PMMoV、TMGMV、BWYV、PeVYV、MABYV、ChiVMV、TYLCV、PCV-1和PCV-2等病毒發(fā)生復(fù)合侵染,同樣地,能與10種以上病毒發(fā)生復(fù)合侵染病毒的還有TMV、TMGMV、BWYV、BBWV、PCV-2,并且這幾種病毒的檢出率都比較高,這可能與病毒的傳播方式以及辣椒的品種有關(guān)。辣椒病毒病的癥狀多種多樣,可能是由多種病毒復(fù)合侵染導(dǎo)致的,多種茄科蔬菜的大面積種植、種子土壤帶毒以及廣泛的傳毒媒介等均能導(dǎo)致復(fù)合侵染的發(fā)生,特別是傳毒介體,如CMV、TMV、BBWV、BWYV等病毒均能通過(guò)蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播,有的傳毒介體能攜帶傳播多種病毒,從而出現(xiàn)一種植物可被多種病毒侵染現(xiàn)象。病毒復(fù)合侵染能夠?qū)е轮参锟剐詥适В:Ω鼮閲?yán)重。此外,本研究發(fā)現(xiàn)采集的一些樣本疑似感染辣椒病毒,但是在該樣本中未檢測(cè)到病毒,可能是由于植物的一些生理性病害或是藥害所致。

        本研究中,PMMoV在辣椒上檢出率最高,而PeVYV和BWYV是侵染山東辣椒的新記錄,由于MABYV、PCV-1、PCV-2在NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中登錄的序列較少,沒(méi)有構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),因而分別對(duì)PMMoV的基因序列、PeVYV的部分基因序列以及BWYV的部分基因序列構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。從進(jìn)化關(guān)系上來(lái)說(shuō),PMMoV和BWYV在進(jìn)化上與寄主種類(lèi)沒(méi)有關(guān)聯(lián),可能與地域有一定關(guān)系,而PeVYV從進(jìn)化樹(shù)上不能得出其與寄主和地域來(lái)源有無(wú)關(guān)聯(lián)。

        MABYV[35]、BWYV、PeVYV[25]、PCV-1和PCV-2是山東省內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的侵染辣椒的病毒。MABYV、PeVYV、BWYV同屬于黃癥病毒科()馬鈴薯卷葉病毒屬()成員,通過(guò)蚜蟲(chóng)持久性傳播。發(fā)病植株上主要癥狀表現(xiàn)為葉脈黃化,嚴(yán)重時(shí)整個(gè)葉片黃化并向上卷曲,畸形,且發(fā)病植株矮化,果實(shí)變小。本研究發(fā)現(xiàn),這3種病毒之間復(fù)合侵染現(xiàn)象普遍,這與該屬病毒能依靠蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播有關(guān)。2011年在土耳其和突尼斯等地的辣椒上發(fā)現(xiàn)了BWYV[36],中國(guó)于2015年也報(bào)道了BWYV能侵染辣椒[18]。本研究在山東省辣椒上也發(fā)現(xiàn)了該病毒,且這一病毒的檢出率達(dá)到了33.2%,其發(fā)展已十分普遍,應(yīng)該引起足夠的重視,防止出現(xiàn)這一病毒的大暴發(fā),對(duì)這一病毒還需要進(jìn)一步研究。PCV-1和PCV-2屬于雙分體病毒科,該科成員在寄主中含量很低,不引起寄主明顯的癥狀,這兩種病毒的基因組信息和功能研究較少,還需要進(jìn)一步研究。

        本研究所測(cè)到的15種病毒,大多是可以通過(guò)蚜蟲(chóng)進(jìn)行傳播,部分病毒通過(guò)粉虱進(jìn)行傳播,且研究發(fā)現(xiàn)溫室種植的辣椒病毒檢出率明顯低于露天種植的辣椒病毒檢出率。目前山東省溫室大棚的蚜蟲(chóng)防治初見(jiàn)成效,但大田種植防治蚜蟲(chóng)環(huán)節(jié)薄弱,使蚜蟲(chóng)量增加并加速了植物病毒的傳播,導(dǎo)致病毒危害日益加重。山東省是蔬菜大省,擁有國(guó)內(nèi)先進(jìn)的工廠化育苗,并銷(xiāo)售國(guó)內(nèi)各地,因此要做好辣椒病毒病的相關(guān)調(diào)查,及時(shí)做好相關(guān)防治措施,以防止辣椒病毒病的大量暴發(fā)和傳播,造成經(jīng)濟(jì)損失。

        4 結(jié)論

        對(duì)采自山東省10個(gè)市(區(qū))的253份辣椒樣品進(jìn)行20種病毒的檢測(cè),發(fā)現(xiàn)目前侵染山東辣椒的病毒種類(lèi)有15種,其中PMMoV、CMV為主要病毒毒原,病毒檢出率均達(dá)到了60%以上,并且病毒的復(fù)合侵染現(xiàn)象比較嚴(yán)重。新發(fā)現(xiàn)了5種侵染山東省辣椒的病毒,分別為PeVYV、BWYV、MABYV、PCV-1和PCV-2。

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        (責(zé)任編輯 岳梅)

        Molecular Detection and Identification of Main Viruses on Pepper in Shandong Province

        WANG ShaoLi1, TAN WeiPing1, YANG YuanYuan1, DAI HuiJie2, SUN XiaoHui1, QIAO Ning1,2, ZHU XiaoPing1

        (1College of Plant Protection, Shandong Agricultural University/Shandong provincial key laboratory for Biology of Vegetable Diseases and Insect Pests, Taian 271018, Shandong;2WeiFang University of Science and Technology, Shouguang 262700, Shandong)

        【Objective】 The objective of this study is to identify the main viruses causing pepper virus diseases in Shandong Province, China.【Method】In 2014-2015, a total of 253 susceptible pepper plant samples were collected from 10 urban areas (Linyi, Rizhao, Qingdao, Yantai, Weifang, Zibo, Jining, Heze, Liaocheng, Dezhou) in Shandong Province. Total RNA and DNA were extracted from the leaves of pepper samples, and were subjected to detect viruses with Geminivirus universal primers (PA/PB), Polerovirus universal primers (POL-F/POL-R) and specific primers of main viruses infecting pepper have been reported by PCR and reverse transcription-PCR (RT-PCR). Each amplified fragment was purified by DNA gel extraction kit, cloned into pMD18-T vector and sequenced. The obtained sequences of PMMoV, PeVYV and BWYV were subjected to BLAST search, and compared with the representative sequences of GenBank which had been registered around the world using the Megalign in DNAStar software. Clustal W method of Mega 5.05 was used for multiple sequence alignment analysis and the phylogenetic tree were constructed by neighbor-joining (NJ) of Mega 5.05, with the bootstrap of each branch of phylogenetic tree analyzed 1 000 times. 【Result】The PMMoV and CMV had the highest detection rate, were 61.66% and 60.08%, respectively. TMGMV, BBWV-2, BWYV and TMV were popular with the detection rate of 41.90%, 34.78%, 33.20% and 24.90%, respectively. The detection rates of PCV-2, ToMV, TYLCV, PVY, MABYV, PeVYV, PCV-1, ChiVMV andAMV were 11.86%, 9.88%, 9.09%, 6.72%, 5.53%, 3.56%, 3.16%, 0.79% and 0.40%, respectively. No CaCV, PSV, ChiRSV, TSWVand ToMMV were detected. The complex infection phenomenon showed that co-infections were up to 89.92%, three kinds of viruses mixed infection occurs the highest rate, up to 28.63%, followed by four kinds of viruses mixed infection, up to 25.00%, two kinds of viruses mixed infection, up to 21.77%, five kinds of viruses mixed infection up to 13.31%, and 6 viruses detected in one sample is the extreme case, with the mixed infection rate up to 1.21%. Phylogenetic trees were constructed with partialof PMMoV, partial,andgenesof PeVYV and partialandgenes of BWYV, respectively. PMMoV Shandong isolate SD60 and the China Guizhou isolate had the closest relationship, PeVYV-SDRZ31-1 and Italy isolate IT83 shared the closest relationship, BWYV Shandong isolate SD clustered with Korean isolate LS. 【Conclusion】 Fifteen viruses were detected, among which PMMoV and CMV were the main pathogens. The newly detected viruses are MABYV, PeVYV, BWYV, MABYV, PCV-1 and PCV-2 in pepper in Shandong Province. The occurrence of viral diseases and the primary and secondary relationship of the main types of pepper viruses in Shandong province were clarified.

        pepper virus diseases;(PMMoV);(BWYV);(MABYV); complex infection

        2017-01-18;接受日期:2017-03-23

        國(guó)家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專(zhuān)項(xiàng)(201303028)、山東省科技發(fā)展計(jì)劃(2014GNC111008)

        王少立,E-mail:wangshaolisdau@163.com。通信作者竺曉平,Tel:0538-8247781-8510;E-mail:zhuxp@sdau.edu.cn

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