楊承劍，謝芳，李孟偉，梁辛，梁賢威*，李麗莉，郭艷霞，彭開(kāi)屏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

木薯渣中酵母菌的分離鑒定及發(fā)酵性能測(cè)定

楊承劍，謝芳，李孟偉，梁辛，梁賢威*，李麗莉，郭艷霞，彭開(kāi)屏

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所，廣西南寧530001）

為篩選出適合木薯渣發(fā)酵的專用酵母菌，試驗(yàn)以自然發(fā)酵的堆貯木薯渣為樣品，采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)法分離得到8株酵母菌，分別命名為Y1、Y4、Y7、Y8、Y11、Y12、Y18、Y21。通過(guò)形態(tài)學(xué)、生理生化特征鑒定及26S rDNAD1/D2區(qū)序列分析，最終鑒定出菌株Y7、Y8、Y11、Y18、Y21為皺褶假絲酵母（Candida rugosa），菌株Y1、Y4、Y12為乙醇假絲酵母（Candida ethanolica），并對(duì)其兩種代表菌株Y1和Y7進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)試，結(jié)果表明，菌株Y1和Y7的最適培養(yǎng)溫度分別為34℃和36℃，最適pH分別為6.5和6.0，培養(yǎng)16 h左右，其OD600nm值均達(dá)到最大值，分別為2.872和2.984。

木薯渣；酵母；分離；鑒定；26S rDNA

木薯（Manihot esculenta）又名樹(shù)薯，與馬鈴薯、紅薯并列為世界三大薯類作物[1-2]。木薯渣是生產(chǎn)木薯淀粉和酒精后的副產(chǎn)物，處理不當(dāng)會(huì)造成極大的浪費(fèi)，污染周邊環(huán)境。木薯渣飼料化是有效利用途徑之一，但木薯渣中含有氫氰酸，過(guò)量飼喂容易引起動(dòng)物中毒，從而導(dǎo)致生產(chǎn)性能下降[3]。研究木薯渣的飼用價(jià)值，不僅可以減少環(huán)境污染，實(shí)現(xiàn)資源就地轉(zhuǎn)化，還能緩解當(dāng)前飼料原料緊張狀態(tài)，促進(jìn)畜牧業(yè)的發(fā)展[4]。木薯渣堆貯發(fā)酵是一個(gè)復(fù)雜的微生物菌群更替過(guò)程，有大量的乳酸菌和酵母菌參與，改變其理化性質(zhì)，使其所含的粗纖維降解為動(dòng)物易消化吸收的單糖、雙糖、氨基酸等小分子物質(zhì)，從而提高木薯渣作為動(dòng)物飼料的利用率[5]。酵母是一類單細(xì)胞微生物，具有個(gè)體大、蛋白質(zhì)含量高、雜食性強(qiáng)、易分離培養(yǎng)、代謝產(chǎn)物多、綜合利用廣等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于釀酒、面點(diǎn)、飲料等食品生產(chǎn)領(lǐng)域，而飼用酵母一般有熱帶假絲酵母、產(chǎn)朊假絲酵母、啤酒酵母、紅酵母等[6]。近年來(lái)，酵母在飼料中的研究較多，但從自然發(fā)酵木薯渣中分離酵母菌并應(yīng)用于木薯渣發(fā)酵的研究仍十分有限，本試驗(yàn)擬從堆貯的木薯渣中篩選出適合木薯渣發(fā)酵的優(yōu)良酵母菌并對(duì)其發(fā)酵特性進(jìn)行研究，以期將其擴(kuò)大培養(yǎng)后發(fā)酵木薯渣，提高木薯渣的品質(zhì)和適口性，為木薯渣的飼料化利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

木薯渣樣品5份，于實(shí)驗(yàn)當(dāng)天取自廣西水牛研究所水牛種畜場(chǎng)，在取樣1 h內(nèi)到達(dá)實(shí)驗(yàn)室，5份樣品各取5 g混勻，置于500 mL裝有無(wú)菌水三角瓶中，用200目紗布過(guò)慮后備用。

酵母膏胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（yeast extract peptone dextrose，YPD）、YPD肉湯培養(yǎng)基：青島日水生物技術(shù)有限公司；酵母基因組脫氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid，DNA）快速提取試劑盒、蛋白酶K、TaqDNA：北京康為世紀(jì)科技有限公司；無(wú)水乙醇、β-巰基乙醇：天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；其他試劑（磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉）均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)：蘇州蘇潔凈化設(shè)備有限公司；SPX-150生化培養(yǎng)箱：北京科偉永興儀器有限公司；UV-8000紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)：上海無(wú)析儀器有限公司；Thermo Scientific渦旋振蕩器：雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司；YM50立式壓力蒸氣滅菌器：上海三申醫(yī)療器械有限公司；HC-2518R冷凍高速離心機(jī)：北京京立離心機(jī)有限公司；JD500-2型電子天平：梅特勒-托多利儀器有限公司；ECLIPSE 50i正置生物顯微鏡：Nikon日本公司；DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩(wěn)壓電泳儀：北京六一儀器廠；DK-8D電熱恒溫水槽：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；FR980凝膠成像儀：上海復(fù)日科技儀器有限公司；2720 thermal cycler聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)儀（polymerase chain reaction，PCR）：美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）提取試劑盒：北京康為世紀(jì)科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酵母菌的分離純化

取10 mL混合木薯渣過(guò)濾后的溶液于90 mL無(wú)菌生理鹽水中，在渦旋儀上充分混勻，按梯度分別稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5樣液。取以上5種稀釋度的樣液各20 μL，用無(wú)菌玻璃刮鏟均勻地涂布于YPD瓊脂平板上，于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48～72 h，用滅菌牙簽挑取生長(zhǎng)較快、形態(tài)、顏色不同的菌落，劃線接種于YPD瓊脂平板上，反復(fù)分離、純化，直至得到單一菌落，將純化后的菌株分別接種于滅菌后的YPD肉湯培養(yǎng)基中增殖培養(yǎng)12 h，編號(hào)、保存于20%甘油管中，置-20℃冰箱中保藏備用。

1.3.2 酵母菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定

形態(tài)特征：將菌株接種到含杜氏管的YPD肉湯培養(yǎng)基中，27℃培養(yǎng)3 d，觀察杜氏管內(nèi)是否有氣泡、是否渾濁、試管底部是否成環(huán)或成島，并制水浸片于顯微鏡下觀察，觀察記錄酵母菌的無(wú)性繁殖方式及細(xì)胞形狀[7]。

生理生化鑒定：參照《酵母菌的特性與鑒定手冊(cè)》[8]和《真菌鑒定手冊(cè)》[9]進(jìn)行。

1.3.3 菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)序列分析鑒定

DNA提?。簶悠稤NA使用酵母菌基因組DNA提取試劑盒提取，具體操作步驟按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行；

PCR擴(kuò)增：使用康為世紀(jì)2×EsTaqMasterMix進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增引物：正向引物NL1（5′-GCATATCAATAAGCG GAGGAAAAG-3′），反向引物NL4（5′-GGTCCGTGTTTC AAGACGG-3′）；

反應(yīng)體系如下：10×PCR緩沖液5 μL；正、反向引物均為10 mmol/L各2.5 μL；dNTP（10 mmol/L）4 μL；基因組DNA 1.0 μL；TaqDNA聚合酶0.5 μL；雙蒸水34.5 μL。PCR擴(kuò)增循環(huán)參數(shù)為：98℃預(yù)變性2 min；98℃變性10 s，56℃退火15 s，72℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)；再72℃延伸5 min；

電泳：使用1%的瓊脂糖凝膠電泳，電壓120 V，電泳30 min，每孔上樣1 μL。

1.3.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

將測(cè)序結(jié)果與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，選取GenBank中相似性最高的已知序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，通過(guò)Clustalx1.83比對(duì)后，再用MEGA4.0軟件采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[10]。

1.3.5 菌株的發(fā)酵性能測(cè)定

選取分離鑒定出的菌株進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)定，將菌株活化后，以3%的接種量接種到Y(jié)PD肉湯培養(yǎng)基內(nèi)，28℃培養(yǎng)過(guò)夜，在不同發(fā)酵溫度（22℃、24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃）[11]、不同pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0）培養(yǎng)24 h，以確定菌株的最適生長(zhǎng)溫度和pH值，然后分別在最適溫度和pH值條件下培養(yǎng)菌株，觀察其24 h菌株的生產(chǎn)力，期間每隔2 h取樣一次，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)在波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定其吸光度值[12]，繪出菌株生長(zhǎng)曲線的變化趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌的形態(tài)特征及生理生化鑒定

從木薯渣中篩選出的菌株在YPD平板培養(yǎng)基上大致呈現(xiàn)出2種不同的菌落形態(tài)，其主要包括：菌落是否有突起、大小、顏色、表面光滑度等[13]。挑取同一平板上菌落形態(tài)相同的菌株3～5株，經(jīng)多次純化后，其菌落形態(tài)、鏡檢結(jié)果均保持一致。選取生長(zhǎng)旺盛、形態(tài)不同的菌落，進(jìn)一步劃線分離，最終分離得到8株具有代表性的單菌落，將其分別編號(hào)為Y1、Y4、Y7、Y8、Y11、Y12、Y18、Y21。分離菌株的菌落及細(xì)胞形態(tài)特征見(jiàn)表1和圖1，生理生化鑒定結(jié)果如表2所示。

圖1 顯微鏡下酵母菌形態(tài)（40×10）Fig.1 Morphology of yeasts under microscopy(40×10)

由表1可知，菌株的菌落形態(tài)特征為表面光滑，不透明，菌落呈卵圓形。

表1 酵母菌的形態(tài)特征Table 1 Morphological characteristics of yeasts

表2 酵母菌的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of yeasts

由表2可知，所有菌株的碳源試驗(yàn)中麥芽糖、D-半乳糖、蔗糖、乳糖、淀粉均不能被同化；菌株Y7、Y8、Y11、Y18、Y21在37℃培養(yǎng)試驗(yàn)中生長(zhǎng)良好，重氮基蘭B（DBB）試驗(yàn)與脲酶試驗(yàn)均為陰性，這與Candida屬的Candida rugosa的特征極為相似，而菌株Y1、Y4、Y12則在42℃培養(yǎng)試驗(yàn)中生長(zhǎng)良好，且重氮基蘭B（diazo base blue，DBB）試驗(yàn)與脲酶試驗(yàn)均為陰性，與Candida屬的Candida ethanolica的特征相同，參照《酵母菌的特征與鑒定手冊(cè)》檢索表，可初步判定菌株Y1、Y4、Y12可能為釀酒酵母屬（Saccharomyces）或假絲酵母屬（Candida），而菌株Y7、Y8、Y11、Y18、Y21可初步判斷為假絲酵母屬（Candida）。然而，僅根據(jù)形態(tài)和生理生化特性并不能準(zhǔn)確鑒定菌株至種水平，還需要靠分子生物學(xué)鑒定來(lái)進(jìn)一步確認(rèn)[14]。

2.2 菌株的26S rDNA鑒定

將分離到的8株酵母菌基因組進(jìn)行26S rDNA區(qū)PCR擴(kuò)增[15]，對(duì)擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳順序?yàn)椋? 000 bp Marker、Y1、Y4、Y7、Y8、Y11、Y12、Y18、Y21，菌株擴(kuò)增后的電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 菌株26S rDNA PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.2 Electrophoretograms of 26S rDNA PCR amplification products of strains

由圖2可知，這8株菌擴(kuò)增出的片段長(zhǎng)度在500～750bp，條帶清晰可見(jiàn)，無(wú)雜帶，可用于菌株26S rDNA測(cè)序。將酵母菌基因PCR擴(kuò)增成功的電泳目的條帶片段回收，送生工生物（上海）有限公司進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果拼接并輸入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，運(yùn)用BLAST程序?qū)y(cè)序結(jié)果與NCBI核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中的公開(kāi)序列進(jìn)行比對(duì)（http：//blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast），并運(yùn)用MEGA4.0軟件采用Neighbour-Joining方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果如圖3所示。

從圖3可知，菌株Y7、Y8、Y11、Y18、Y21的26S rDNA與數(shù)據(jù)庫(kù)存報(bào)道的Candida rugosa菌株的26S rDNA核苷酸序列聚集于同一簇且同源性達(dá)到99%以上，菌株Y1、Y4、Y12的26S rDNA與數(shù)據(jù)庫(kù)存報(bào)道的Candida ethanolica菌株的26S rDNA核苷酸序列聚集于同一簇，且同源性達(dá)到99%以上，結(jié)合之前的形態(tài)特征及生理生化特性，確定為Y1、Y4、Y12為乙醇假絲酵母（Candida ethanolica），Y7、Y8、Y11、Y18、Y21確定為皺褶假絲酵母（Candida rugosa）。

圖3 菌株26S rDNA基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of 26S rDNA gene sequence of strains

2.3 菌株的發(fā)酵性能測(cè)定

2.3.1 篩選酵母菌的最適生長(zhǎng)溫度測(cè)定

根據(jù)圖3的結(jié)果可以看出，因菌株Y1和Y7 PCR擴(kuò)增出的目的條帶明顯處在不同位置條帶上，Y1靠近700 bp，Y7靠近500 bp，說(shuō)明這兩株菌分可能屬不同菌種，再后面通過(guò)26S rDNA測(cè)序結(jié)果Y1、Y4、Y12為乙醇假絲酵母（Candida ethanolica），Y7、Y8、Y11、Y18、Y21確定為皺褶假絲酵母（Candidarugosa），取Y1和Y7為代表菌株進(jìn)行下面的發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以避免重復(fù)實(shí)驗(yàn)。Y1（乙醇假絲酵母Candidaethanolica）和Y7（皺褶假絲酵母Candida rugosa）接種于YPD肉湯培養(yǎng)基中，以不同溫度條件下，將菌株增殖培養(yǎng)24 h后，測(cè)定其OD600nm值，結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溫度條件下分離菌株在YPD肉湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.4 Growth curve of isolated strains in broth medium under different temperature

由圖4可知，菌株Y1和Y7的OD600nm值是在24～36℃范圍內(nèi)隨著溫度的升高而逐漸增大，在36℃后變??；Y1的 OD600nm值在34℃時(shí)達(dá)到最高值2.512，Y7的OD600nm值則在36℃時(shí)達(dá)到最高值2.663。故Y1和Y7的最適生長(zhǎng)溫度分別是34℃和36℃。

2.3.2 篩選酵母菌的最適生長(zhǎng)pH測(cè)定

選取鑒定出的菌株Y1和Y7，分別在不同pH值的YPD肉湯培養(yǎng)基中，按各自最適溫度培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值，結(jié)果如圖5所示。

圖5 不同pH值條件下分離菌株在YPD肉湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.5 Growth curve of isolated strains in broth medium under different pH

由圖5可知，菌株在pH4.0時(shí)受到明顯抑制，基本不生長(zhǎng)，而在pH4.5～6.0范圍內(nèi)，OD600nm值則隨著pH值的升高而增加；Y1的OD600nm值在pH6.5時(shí)達(dá)到最高，之后逐漸下降，而Y7的OD600nm值則在pH6.0時(shí)達(dá)到最高，之后也逐漸下降。故Y1和Y7的最適生長(zhǎng)pH值分別是6.5和6.0。

2.3.3 篩選酵母菌生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

選取鑒定出的菌株Y1和Y7，分別在其最適溫度和最佳pH的YPD肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，測(cè)定其OD600nm值，結(jié)果如圖6所示。

圖6 最適溫度和pH條件下分離菌株在YPD肉湯培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)曲線Fig.6 Growth curve of isolated strains in broth medium under the optimal temperature and pH

由圖4～圖6綜合可知，菌株Y1和Y7的最適培養(yǎng)溫度分別是34℃和36℃，最適pH分別為6.5和6.0，兩株菌都在培養(yǎng)10 h左右開(kāi)始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，培養(yǎng)16 h后，其OD600nm值達(dá)到最大，分別為2.872和2.984，之后便進(jìn)入穩(wěn)定期，其OD600nm值不再繼續(xù)增加。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用傳統(tǒng)分離培養(yǎng)方法從自然發(fā)酵堆貯木薯渣樣品中分離篩選出8株酵母菌，通過(guò)形態(tài)、生理生化及26SrDNA鑒定出乙醇假絲酵母（Candida ethanolica）3株，皺褶假絲酵母（Candida rugosa）5株，分別選取其中代表性菌株Y1和Y7進(jìn)行發(fā)酵性能測(cè)試，結(jié)果表明，菌株Y1和Y7最適培養(yǎng)溫度分別為34℃和36℃，最適生長(zhǎng)pH分別為6.5和6.0，將其在最適溫度和pH各培養(yǎng)16 h左右，其發(fā)酵生產(chǎn)力均達(dá)到最大。本研究側(cè)重于適合木薯渣發(fā)酵酵母菌的篩選與鑒定，可為后續(xù)木薯渣飼料化提供優(yōu)良的酵母菌株。

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Isolation,identification and fermentation ability of yeasts from cassava residues

YANG Chengjian,XIE Fang,LI Mengwei,LIANG Xin,LIANG Xianwei*,LI Lili,GUO Yanxia,PEN Kaiping
(Guangxi Buffalo Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Nanning 530001,China)

In order to screen the optimal dedicated yeasts for cassava residue fermentation,using natural fermented cassava residue as raw material, eight stains were isolated by traditional culture method,namely Y1,Y4,Y7,Y8,Y11,Y12,Y18,and Y21.The strains were identified by morphology, physiological and biochemical characteristics and 26S rDNA sequence analysis.The results showed that strain Y7,Y8,Y11,Y18,Y21 wereCandida rugosa,strain Y1,Y4,Y12 wereCandida ethanolica.The results of fermentation ability of representative strains showed that the optimal temperature and optimal pH of strain Y1 and Y7 was 34℃,36℃,respectively,and 6.5,6.0,respectively.After 16 h incubation,the OD600nmof both strains reached the maximum,which were 2.872 and 2.984,respectively.

cassava residues;yeast;isolation;identification;26S rDNA

Q939.9

0254-5071（2017）07-0090-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.07.020

2017-03-31

廣西水產(chǎn)畜牧獸醫(yī)局科技項(xiàng)目（桂漁牧科201352039）；廣西自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2014GXNAFA118082）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31460613）

楊承劍（1981-），男，副研究員，博士，主要從事水牛營(yíng)養(yǎng)與飼料科學(xué)研究工作。

*通訊作者：梁賢威（1962-），男，研究員，碩士，主要從事水牛營(yíng)養(yǎng)與繁殖研究工作。