張倩 彭開(kāi)文 吳晗 龔俊 姬忠賀② 李雁②

·基礎(chǔ)研究·

胃癌細(xì)胞促進(jìn)網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞分化的機(jī)制研究*

張倩①彭開(kāi)文①吳晗①龔?、偌е屹R①②李雁①②

目的：本實(shí)驗(yàn)主要研究在胃癌條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）誘導(dǎo)下網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞（omental-adipose stromal cells，O-ASCs）是否能分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs），及ERK信號(hào)通路在其中的作用。方法：通過(guò)誘導(dǎo)分化成骨、成脂及流式細(xì)胞鑒定O-ASCs，將O-ASCs與MGC803和SGC7901 CM共培養(yǎng)，通過(guò)RT-PCR和Western-blot檢測(cè)O-ASCs細(xì)胞CAFs標(biāo)志物α-SMA、FSP-1、vimentin，旁分泌因子VEGFA、TGFβ-1、FAP、SDF-1的表達(dá)水平。將O-ASCs分為對(duì)照組，SGC7901-CM實(shí)驗(yàn)組，SGC7901-CM+U0126處理組，12 h后收集細(xì)胞。Western blot檢測(cè)O-ASCs細(xì)胞CAFs標(biāo)志物α-SMA、FSP-1及ERK1/2、p-ERK1/2的表達(dá)水平。結(jié)果：經(jīng)鑒定原代培養(yǎng)出的細(xì)胞為O-ASCs，在SGC7901 CM和MGC803 CM作用下，CAFs標(biāo)志物α-SMA、FSP-1、vimentin及旁分泌因子SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP表達(dá)均有明顯增加（P＜0.05）。與對(duì)照組比較SGC7901-CM組α-SMA、FSP-1、p-ERK1/2表達(dá)明顯增加（P＜0.05），ERK表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。SGC7901-CM+U0126組與SGC7901-CM組比較，α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），ERK表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：O-ASCs通過(guò)分化為CAFs及旁分泌作用參與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移，ERK信號(hào)通路在該過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

胃癌 癌相關(guān)成纖維細(xì)胞 網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞 ERK信號(hào)通路 腹膜轉(zhuǎn)移

胃癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，2015年中國(guó)因胃癌死亡人數(shù)達(dá)到498/10萬(wàn)，居癌癥死因第2位［1］。導(dǎo)致胃癌患者死亡的主要因素是全身或局部區(qū)域轉(zhuǎn)移和/或復(fù)發(fā)，有文獻(xiàn)報(bào)道15%～50%胃癌患者術(shù)中探查時(shí)即發(fā)現(xiàn)腹膜轉(zhuǎn)移［2］。手術(shù)治療對(duì)該疾病效果差，中位生存期約6個(gè)月［3］。

脂肪干細(xì)胞（adipose-derived stem cells，ASCs）是一類存在于脂肪組織中，具有顯著可塑性和多向分化潛能的成體干細(xì)胞［4］。脂肪干細(xì)胞對(duì)腫瘤生物學(xué)行為的影響具有復(fù)雜的特性［5-6］，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，是腫瘤微環(huán)境中重要的成體干細(xì)胞。但是目前脂肪干細(xì)胞對(duì)腫瘤影響的機(jī)制尚不明確。部分觀點(diǎn)認(rèn)為脂肪干細(xì)胞通過(guò)分化為癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（carcinoma-associated fibroblasts，CAFs）或肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast），而對(duì)腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起促進(jìn)作用［4］；另一部分觀點(diǎn)認(rèn)為脂肪干細(xì)胞對(duì)腫瘤的趨化作用及旁分泌作用是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵因素［7］。

由于大網(wǎng)膜是胃癌腹膜轉(zhuǎn)移主要部位之一，而大網(wǎng)膜含有豐富的脂肪組織和網(wǎng)膜脂肪干細(xì)胞（omental-adipose stromal cells，O-ASCs），因此研究O-ASCs在胃癌腹膜轉(zhuǎn)移中的機(jī)制和作用具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)體外培養(yǎng)O-ASCs，討論O-ASCs能否在胃癌條件培養(yǎng)基（conditioned medium，CM）誘導(dǎo)下分化為CAFs，并討論ERK信號(hào)通路在其中的作用，有望找到胃癌腹膜轉(zhuǎn)移的新靶點(diǎn)，為其治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用脂肪組織均取自武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科10例手術(shù)患者，BMI≤25，大網(wǎng)膜均無(wú)腫瘤轉(zhuǎn)移。MGC803與SGC7901胃癌細(xì)胞均為武漢大學(xué)中南醫(yī)院科研中心的儲(chǔ)備細(xì)胞。

1.1.2 主要試劑及儀器 胎牛血清（ScienCell，美國(guó)）；I型膠原酶（購(gòu)自美國(guó)Worthington公司）；OriC?ellTM成人脂肪間質(zhì)干細(xì)胞成骨及成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基試劑盒（購(gòu)自廣東Cyagen公司）；U0126（Selleck?men，美國(guó)）；兔抗人單克隆抗體GAPDH、FSP-1、α-SMA、VEGFA、TGFβ1、ERK、p-ERK1/2（購(gòu)自美國(guó)Ab?cam公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗（購(gòu)自武漢博士德公司）。熒光定量PCR儀、垂直電泳槽（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司）。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)武漢大學(xué)中南醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并與患者簽署相關(guān)知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 原代培養(yǎng)O-ASCs 手術(shù)室中無(wú)菌條件下取脂肪組織，加入4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）中（青霉素100 mU/L，鏈霉素100 ng/L），迅速帶回實(shí)驗(yàn)室超凈臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作。PBS反復(fù)沖洗，剪去肉眼可見(jiàn)的血管及結(jié)締組織，剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，加入等體積的0.1%Ⅰ型膠原酶，37℃消化1 h后，2000 r·min-1離心10 min，棄上清后加入3 mL紅細(xì)胞裂解液吹打3～5 min，1500 r·min-1離心5 min棄上清后在培養(yǎng)基（低糖DMEM、10%胎牛血清、1%青鏈霉素）中重懸細(xì)胞，按5×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種至100 mm培養(yǎng)皿中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 對(duì)O-ASCs成骨及成脂誘導(dǎo) 將第2代OASCs按2×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于6孔板中，加入成骨及成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)21 d后，中性甲醛固定細(xì)胞，分別用茜素紅及油紅O染液染色后觀察。

1.2.3 流式細(xì)胞檢測(cè) 將第3代O-ASCs胰酶消化，用PBS清洗2次后，分別孵育PE-CD29、PECy7-CD34（購(gòu)自美國(guó)BD公司）、PE-CD45、FITC-CD90、PE-CD106（購(gòu)自美國(guó)eBioscience公司）等熒光標(biāo)記的鼠抗人流式抗體30 min，PBS反復(fù)清洗后重懸，采用NovoCyteTM系列流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)。

1.2.4 繪制O-ASCs生長(zhǎng)曲線 按CCK-8 Kit試劑盒（購(gòu)自安徽Biosharp公司）說(shuō)明書(shū)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，取第2代對(duì)數(shù)期脂肪干細(xì)胞消化并計(jì)數(shù)，按5×103個(gè)細(xì)胞/孔接種于96孔板中，貼壁培養(yǎng)3 h后每孔加入10 μL CCK-8溶液反應(yīng)1 h，使用酶標(biāo)儀（購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司）450 nm波長(zhǎng)下測(cè)第一組OD值，標(biāo)記為0 d。以后每天相同條件下分別測(cè)得1 d～6 d的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制脂肪干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.5 胃癌條件培養(yǎng)基的制備 分別取凍存的MGC803和SGC7901胃癌細(xì)胞復(fù)蘇。當(dāng)細(xì)胞融合度處于60%～70%時(shí)，換上新鮮培養(yǎng)基，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜。第二天回收培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)基，2 000 r·min-1離心10 min，取上清液0.22 μm濾器過(guò)濾，視其為MGC803和SGC7901 CM，于4℃保存并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.6RT-PCR檢測(cè)O-ASCs中相關(guān)mRNA表達(dá)水平 將第3代O-ASCs按2×104個(gè)細(xì)胞/cm2接種于6孔板中，將O-ASCs分為MGC803-CM實(shí)驗(yàn)組、SGC7901-CM實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后，用RIPA細(xì)胞裂解液裂解以備后用。分別用Trizol（購(gòu)自安徽Biosharp公司）提取各實(shí)驗(yàn)組樣本總RNA，紫外分光光度計(jì)和電泳檢測(cè)RNA濃度、純度和完整性。通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA，通過(guò)SYBR?Premix Ex TaqTMII（購(gòu)自日本Takara公司）獲得不同樣本中目的基因的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次以上。通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對(duì)內(nèi)參GAPDH基因的表達(dá)差異。引物序列見(jiàn)表1。

1.2.7 Western blot檢測(cè)O-ASCs中相關(guān)蛋白表達(dá)水平 取上一步實(shí)驗(yàn)中RIPA裂解后細(xì)胞，分別檢測(cè)α-SMA、FSP-1、VEGFA、TGFβ-1蛋白表達(dá)。同時(shí)將OASCs分為對(duì)照組、SGC7901-CM實(shí)驗(yàn)組、SGC7901-CM+U0126處理組。U0126使用時(shí)須在培養(yǎng)體系中加入20 μmo/L預(yù)處理0.5 h，以阻斷ERK信號(hào)通路。將各組細(xì)胞37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12 h后RI?PA裂解液裂解細(xì)胞，分別檢測(cè)α-SMA、FSP-1及ERK、p-ERK1/2的蛋白表達(dá)。以GAPDH作為內(nèi)參校正并作相對(duì)量分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0及Graph Pad Prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示。組間的比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 O-ASCs培養(yǎng)及鑒定

原代培養(yǎng)的細(xì)胞12 h開(kāi)始貼壁，初期細(xì)胞體積小，成紡錘形或梭形。48 h貼壁細(xì)胞增加，以梭形為主。72 h梭形細(xì)胞開(kāi)始大量增殖，局部呈旋渦狀或平行緊密排列。以后每3 d換液，細(xì)胞達(dá)到75%～90%融合后傳代（圖1A）。

O-ASCs成骨誘導(dǎo)分化21 d后可見(jiàn)茜素紅染色陽(yáng)性的鈣沉積顆粒（圖1B），成脂誘導(dǎo)分化21 d后可見(jiàn)油紅O染色陽(yáng)性的脂肪樣細(xì)胞（圖1C）。流式細(xì)胞檢測(cè)表達(dá)CD29、CD90陽(yáng)性細(xì)胞＞98%，表達(dá)CD34、CD45、CD106陽(yáng)性細(xì)胞＜2%（圖1D）。經(jīng)鑒定所獲得的細(xì)胞為O-ASCs。

2.2 O-ASCs生長(zhǎng)曲線

用CCK-8 Kit檢測(cè)第3代O-ASCs生長(zhǎng)增殖能力，細(xì)胞生長(zhǎng)曲線呈S形（圖2），增殖潛伏期約為1 d，第2 d開(kāi)始進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期，增殖迅速，第5 d生長(zhǎng)速度減慢、進(jìn)入生長(zhǎng)平臺(tái)期，至第8 d細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，漩渦狀生長(zhǎng)融合至90%以上。

2.3 O-ASCs在MGC803和SGC7901CM作用下向CAFs分化

O-ASCs分別與MGC803和SGC7901 CM共培養(yǎng)12 h后檢測(cè)a-SMA、FSP-1及vimentin的mRNA及蛋白表達(dá)水平變化。與對(duì)照組相比，CM誘導(dǎo)后CAFs標(biāo)志物 α-SMA、FSP-1、vimentin均有明顯增加（P＜0.05），提示O-ASCs向CAFs分化（圖3）。

圖1 O-ASCs的培養(yǎng)及鑒定Figure 1 Culture and identification of O-ASCs

圖2 第三代O-ASCs生長(zhǎng)曲線Figure 2 Growth curve of passage 3 O-ASCs

2.4 O-ASCs在CM作用下相關(guān)旁分泌因子增加

與對(duì)照組相比，O-ASCs與MGC803和SGC7901 CM共培養(yǎng)12 h后SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP均明顯增加（P＜0.05，圖4）。

2.5 O-ASCs在U0126作用后向CAFs分化受抑制

與對(duì)照組相比，SGC7901-CM實(shí)驗(yàn)組CAFs特異性標(biāo)志物α-SMA、FSP-1及ERK信號(hào)通路蛋白p-ERK1/2均明顯增加（P＜0.05），ERK表達(dá)未見(jiàn)明顯變化（P＞0.05）。 SGC7901-CM+U0126處 理 組 與SGC7901-CM實(shí)驗(yàn)組比較，α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2的蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05），ERK表達(dá)變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖5）。

圖3 胃癌CM促進(jìn)O-ASCs分化為CAFsFigure 3 Gastric cancer CM-induced differentiation of O-ASCs towards CAFs

圖4 胃癌CM促進(jìn)O-ASCs相關(guān)旁分泌因子增加Figure 4 Gastric cancer CM promoted the expression of paracrine factors

圖5 O-ASCs在U0126作用后向CAFs分化受抑制Figure 5 O-ASC differentiation towards CAFs inhibited by U0126

3 討論

研究證明O-ASCs與婦科惡性腫瘤（如卵巢癌、子宮內(nèi)膜癌等）的腹腔種植轉(zhuǎn)移相關(guān)［8-10］，通過(guò)分化為 CAFs［4］和/或旁分泌［7］提高癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力。CAFs是一類同時(shí)具有肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞特點(diǎn)的成纖維細(xì)胞亞型，參與腫瘤的增殖、細(xì)胞外基質(zhì)重塑和炎癥反應(yīng)，其特征是高表達(dá)α-SMA、FSP-1、vi?mentin［11-12］。本研究證實(shí)O-ASCs分別暴露于兩種不同胃癌細(xì)胞系（SGC7901，MGC803）來(lái)源CM中，可具有分化成CAFs的能力，其CAFs標(biāo)志物α-SMA、FSP-1、vimentin表達(dá)均明顯升高（P＜0.05）。

在胃癌CM作用下，O-ASCs除了分化為CAFs，其旁分泌因子SDF-1、VEGFA、TGFβ-1、FAP表達(dá)均顯著增加（P＜0.05）。SDF-1/CXCR4軸在調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移能力時(shí)起重要作用［7］。VEGF調(diào)節(jié)組織低氧微環(huán)境，在促進(jìn)腫瘤血管形成中起重要作用［13］。TGFβ 1-Smad信號(hào)通路是上皮性惡性腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的經(jīng)典途徑［14］。Cohen等［15］證實(shí)FAP提高腫瘤患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率、術(shù)后復(fù)發(fā)率及死亡率。因此在胃癌CM作用下O-ASCs可通過(guò)多方面的機(jī)制促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)、血管生成、侵襲和轉(zhuǎn)移。Cho等［16］證實(shí)人ASCs在乳腺癌外泌體作用下可分化為CAFs，且其Smad2及ERK磷酸化作用增強(qiáng)。而Cho等［17］發(fā)現(xiàn)ERK磷酸化與ASCs的增殖及活性密切相關(guān)。本研究推測(cè)胃癌細(xì)胞通過(guò)ERK信號(hào)通路促進(jìn)O-ASCs向CAFs分化。為研究ERK信號(hào)通路作用機(jī)制，本研究采用了特異性ERK信號(hào)通路抑制劑U0126，選擇性抑制ERK1/2磷酸化過(guò)程，從而抑制其生物學(xué)作用。與對(duì)照組比較，SGC7901-CM組α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2均明顯增加（P＜0.05），提示ERK信號(hào)通路可能參與O-ASCs分化過(guò)程。與SGC7901-CM組比較，SGC7901-CM+CMU0126組α-SMA、FSP-1及p-ERK1/2含量明顯降低（P＜0.05），提示ERK1/2磷酸化過(guò)程被抑制后，O-ASCs向CAFs分化能力明顯減弱。研究結(jié)果提示ERK信號(hào)通路參與O-ASCs向CAFs分化過(guò)程。

本研究明確了胃癌細(xì)胞CM具有誘導(dǎo)O-ASCs向CAFs分化，促進(jìn)其旁分泌因子表達(dá)等作用。同時(shí)證明了O-ASCs通過(guò)該過(guò)程參與胃癌腹膜轉(zhuǎn)移，且ERK信號(hào)通路在該過(guò)程中發(fā)揮了重要作用。

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2017-01-09收稿）

（2017-06-13修回）

（編輯：武斌 校對(duì)：楊紅欣）

Mechanisms of differentiation of omental-adipose stromal cells promoted by gastric cancer cells

Qian ZHANG1,Kaiwen PENG1,Han WU1,Jun GONG1,Zhonghe JI1,2,Yan LI1,2

Yan LI;E-mail:liyansd 2@163.com

Objective:To investigate whether the omental-adipose stromal cells(O-ASCs)exposing to gastric cancer-conditioned medium(CM)could be inducted to differentiate into carcinoma-associated fibroblasts(CAFs)and the effect of ERK signaling pathway in the process.Methods:We identified O-ASCs by examining their ability to differentiate osteogenic and adipogenic lineages and through flow cytometry.O-ASCs were co-cultured with MGC803 and SGC7901CM.The expression of CAFs markers(α-SMA,FSP-1,and vimentin)and paracrine factors(VEGFA,TGF-β1,FAP,and SDF-1)were evaluated by RT-PCR and Western blot.In vitro cultures of OASCs were divided into three groups:the control,SGC7901-CM,and SGC7901-CM+U0126 groups.Cells were collected after 12 h.Western blot was performed to evaluate the expression of α-SMA,FSP-1,ERK,and p-ERK1/2.Results:The primary cells were O-ASCs.The expression levels of CAFs markers(α-SMA,FSP-1,and vimentin)and O-ASC paracrine factors(VEGFA,TGF-β1,FAP,and SDF-1)clearly increased(P＜0.05).In comparison with the control,the expression of ERK in SGC7901-CM group did not change(P＞0.05),while the expression of p-ERK1/2,α-SMA,and FSP-1 significantly improved(P＜0.05).Comparison of SGC 7901-CM+U0126 and SGC 7901-CM groups showed that the expression levels of ERK had no statistical difference(P＞0.05),while the expression levels of p-ERK1/2,α-SMA,and FSP-1 decreased(P＜0.05).Conclusion:O-ASCs participate in the peritoneal metastasis of gastric cancer through differentiation by CAF and paracrine factors.The ERK signaling pathway is important in the differentiation of O-ASCs towards CAFs.

gastric cancer,carcinoma-associated fibroblasts,omental-adipose stromal cells,ERK signaling pathway,peritoneal metastasis

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.13.025

①武漢大學(xué)中南醫(yī)院腫瘤科，腫瘤生物學(xué)行為湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北省腫瘤醫(yī)學(xué)臨床研究中心（武漢市430071）；②首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京世紀(jì)壇醫(yī)院腫瘤中心腹膜腫瘤外科

*本文課題受2013年湖北省醫(yī)學(xué)領(lǐng)軍人才培養(yǎng)工程項(xiàng)目（編號(hào)：鄂衛(wèi)生計(jì)生發(fā)［2013］4號(hào)），教育部博士點(diǎn)基金（編號(hào)：20120141110042）資助

李雁 liyansd2@163.com

1Department of Oncology,Zhongnan Hospital of Wuhan University,Hubei Key Laboratory of Tumor Biological Behaviors and Hubei Cancer Clinical Study Center,Wuhan 430071,China;2Department of Peritoneal Cancer Surgery,Beijing Shijitan Hospital,Capital Medical University,Beijing 100038,China

This work was supported by Hubei Province Outstanding Medical Academic Leader Program,and the Science Fund for Doctorate Mentors by China's Ministry of Education(No.20120141110042)

張倩 專業(yè)方向?yàn)槟[瘤生物學(xué)研究。

E-mail：1014557276@qq.com