李 強 陳益民 俞石芳 鄧 剛 李曉芳 錢煦岱

具有miRNA 海綿功能的circRNA的生物信息學分析與鑒定

李 強 陳益民*俞石芳 鄧 剛 李曉芳 錢煦岱

目的 對一種新的具有miRNA 海綿功能的circRNA-- hsa_circ_0000254結(jié)構(gòu)、功能進行生物信息學分析與鑒定。方法 采用生物信息學對hsa_circ_0000254 的二級結(jié)構(gòu)及靶向序列進行分析，通過雙熒光素酶實驗驗證hsa_circ_0000254與靶基因的結(jié)合情況。結(jié)果 生物信息學分析發(fā)現(xiàn)hsa_circ_0000254，剪接序列長度為524nt，包含11個miR-125b可結(jié)合位點；雙熒光素酶實驗證實hsa_circ_0000254與miR-125b具有較高的結(jié)合效率。結(jié)論 hsa_circ_0000254 能以miRNA海綿形式抑制miR-125b，有可能作為靶向治療工具應用于高表達miR-125b的白血病治療。

Hsa_circ_0000254 生物信息學 雙熒光素酶報告基因 hsa-miR-125b

miRNA可通過翻譯抑制或直接降解mRNA負性調(diào)控特定的靶基因，廣泛參與白血病細胞的分化、增殖和細胞凋亡過程。環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）是一類高度保守、高穩(wěn)定性的非編碼RNA，在各類血細胞（如：粒細胞白血病細胞系-K562，人B淋巴細胞系-GM12878，紅細胞）中均有豐富的circRNA表達。circRNA可以“miRNA海綿”的方式調(diào)控miRNA。作者前期發(fā)現(xiàn)了白血病患者中表達有一種新的具有miRNA “海綿”功能的circRNA-hsa_circ_0000254，但其功能尚不清楚，本研究對其結(jié)構(gòu)、功能進行了生物信息學分析與鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 人胚胎細胞 HEK293T（由廣州吉賽生物科技有限公司提供）；人工合成的hsa_ circ_0000254的全長序列和突變序列［生工生物工程（上海）股份有限公司合成］，miR-125b、inhibitor及Mir-NC（GenePharma 合成）；Trans1 T1感受態(tài)細胞（北京全式金）； DNA ligation kit（Thermo SCIENTIFIC）；轉(zhuǎn)染試劑：lipofectamine 2000（Invitrogen）；E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（Omega）；E.Z.N.A.? Endo-free Plasmid Maxi Kit（Omega）；PsiCHECK2 載體、 pGH 載體（廣州吉賽生物科技有限公司）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Promega）；雙螢光檢測儀（Promega）；細胞培養(yǎng)板（Corning）；3111型CO2培養(yǎng)箱（Thermo）；BX41 熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 方法 （1）生物信息學預測：從circBASE數(shù)據(jù)庫［1］中獲取circRNA序列信息，采用RNAstructure對二級結(jié)構(gòu)進行分析，采用靶向預測工具對circRNA上可結(jié)合microRNA種類及數(shù)目進行分析。（2）目的片段基因合成：從circBASE上查詢hsa-circ-000254的序列信息，以全基因合成法分別合成hsa_circ_0000254原始序列及突變序列，合成的基因片段導入pGH 載體，分別命名為pGH-hsa_circ_0000254（pGH-C254）和pGH-hsa_circ_0000254-mut（pGH-C254-mut）。（3） 雙 熒光素酶載體構(gòu)建：分別向目的片段載體pGH-C254、pGH-C254mut和空載體 psiCHECK2 中加入 FD XhoI 和FD NotI 進行雙酶切，37℃溫育1 h。然后灌制1.5%的瓊脂糖凝膠進行電泳，回收目的片段，測量濃度。使用 E.Z.N.A.? Gel Extraction Kit（Omega公司）回收酶切產(chǎn)物，T4 DNA Ligase連接目的片段與psiCHECK2載體，分別命名為psiCHECK2-hsa_circ_0000254（C254）和psiCHECK2-hsa_circ_0000254-mut（C254-mut）。 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Trans1T1感受態(tài)細胞，接種于含氨芐青霉素的LB平板，37℃生化培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。篩選陽性克隆并經(jīng)XhoI+NotI雙酶切電泳鑒定。克隆經(jīng)雙酶切電泳鑒定后送測序，與預期序列一致的克隆保留，接種LB+Amp液體培養(yǎng)基20ml培養(yǎng)12h后提取質(zhì)粒DNA，按照E.Z.N.A. ?Endo-free Plasmid Maxi Kit（Omega）試劑盒說明書進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒抽提，-20℃保存。（4）細胞轉(zhuǎn)染：人工合成 miR-125b、inhibitor及Mir-NC，以陽離子脂質(zhì)體法進行細胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1d，細胞按2×104個/孔接種于24孔板上，培養(yǎng)基為含10%FBS的DMEM-高糖培養(yǎng)基；轉(zhuǎn)染當天，細胞匯合度約為50%~60%，采用OPTI-MEM（Invitrogen公司）培養(yǎng)基稀釋 lipofectamine 2000（Invitrogen 公司），室溫下靜置5min；分別加入miRNA 或 miRNA inhibitor和C254、C254-mut質(zhì)粒（最終孵育液中為50nM miRNA或100nM miRNA inhibitor），在5% CO2、 37℃培養(yǎng)箱中孵育5h，用新鮮的完全培養(yǎng)基（含血清）替換含有轉(zhuǎn)染復合物的培養(yǎng)基。（5）Lucifersae 檢測：采用Promega公司的Dual-Luciferase Reporter Assay System（E1910）進行樣品Luciferase 活性檢測。使用雙螢光檢測儀（Promega，GloMax生物發(fā)光檢測儀）檢測螢火蟲螢光素酶 F 和海腎螢光素酶R活性，△活性倍數(shù)=（R/F）樣品/（R/F）對照。

2 結(jié)果

2.1 hsa_circ_0000254剪接序列信息及二級結(jié)構(gòu)預測 通過對circbase數(shù)據(jù)庫中全部已知circRNA分析發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0000254剪接序列長度為524nt，二級結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)四葉草結(jié)構(gòu)（見圖1-2），包含有11個miR-125b可結(jié)合位點數(shù)，說明平均40多個堿基即包含有一個可結(jié)合位點，而miR-125b的堿基序列長度為22nt，表明has-circ-0000254具有成為miR-125b 海綿的結(jié)構(gòu)基礎。2.2 熒光素酶報告載體電泳分析 構(gòu)建成功的C254、C254-mut熒光素酶報告載體，經(jīng) XhoI + NotI 雙酶切電泳鑒定。電泳結(jié)果顯示，目的片段大小與實驗預期一致（見圖3）。

圖1 hsa_circ_0000254剪接序列信息

圖2 hsa_circ_0000254 二級結(jié)構(gòu)預測

圖3 熒光素酶報告載體酶切電泳結(jié)果［注：泳道1為Marker DL2000，泳道2為psiCHECK2-hsa_circ_0000254（C254）酶切，泳道3為psiCHECK2-hsa_circ_0000254-mut（C254-mut）酶切］

2.3 載體測序及序列比對分析 含有hsa-circ-000254完整序列（見圖4-A）及hsa-circ-000254突變序列（見圖4-B）的熒光素酶報告載體C254 /C254-mut酶切后測序結(jié)果。經(jīng) BLAST 比對結(jié)果分析，hsa-circ-000254的目標序列和突變序列均成功地克隆入雙螢光報告載體psiCHECK2， 可以用于后續(xù)螢光素酶的檢測（見圖5）。

圖4 雙熒光素酶載體構(gòu)建示意圖

圖5 熒光素酶報告載體酶切后測序結(jié)果

2.4 雙熒光素酶檢測 結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)染克隆有hsa_ circ_0000254的 實 驗 中，miR-125b組（miR-125b+ C254）與blank組（C254）相比差異有統(tǒng)計學意義（P=0.022）；miR-125b組（miR-125b+ C254）與 NC 組（C254+Mir-NC）相比差異亦有統(tǒng)計學意義（P=0.025），說明miR-125b 能通過結(jié)合hsa-circ-000254影響熒光素酶報告載體psiCHECK2-hsa_circ_0000254（C254）熒光活性改變。miR-125b inhibitor 組（miR-125b inhibitor + C254）與blank組比較差異顯著（bP<0.01）（P=0.005），miR-125b inhibitor 組 與 NC inhibitor組（C254+Mir-NC inhibitor）相比差異顯著（aP<0.05）（P=0.018），說明miR-125b inhibitor 能封閉miR-125b與hsa-circ-000254結(jié)合影響其熒光活性改變。在轉(zhuǎn)染克隆hsa_circ_0000254-mut實驗中，miR-125b組（miR-125b+ C254-mut）與blank組（C254-mut）相比較差異有統(tǒng)計學意義（P=0.041）；說明剩余的5個結(jié)合區(qū)域依然可與miR-125b結(jié)合影響其熒光活性改變，但抑制作用顯著低于C254組（miR-125b+ C254），兩組之間差異亦有統(tǒng)計學意義（P=0.049）；而在空白載體轉(zhuǎn)染實驗（即psiCHECK2實驗）中，各組無顯著性差異（P>0.05）。上述結(jié)果表明， hsa_circ_0000254能夠有效結(jié)合miR-125b。

3 討論

MiR-125b在由染色體易位引發(fā)的白血病中起著重要作用，染色體易位（11；14）（q24；q32）導致的急性B淋巴細胞白血病常伴隨miR-125b的增高，并且骨髓增生異常綜合征與攜帶（2；11）（p21；q23）易位的急性髓系白血病也存在miR-125b的高表達。有報道稱miR-125b在巨核細胞性白血病和急性早幼粒白血病同樣會顯著增高［2］。Bousquet等［3］通過將人工過表達miR-125b的胚肝細胞移植進裸鼠體內(nèi)以研究miR-125b的致癌機制，發(fā)現(xiàn)miR-125b能夠顯著增加白細胞的數(shù)目，且>50%的實驗小鼠最終死于各種白血病。進一步的研究表明，miR-125b能夠縮短BCRABL導致的白血病的潛伏期，建議miR-125b在白血病中起著原癌基因的作用。

Bak1是重要的促凋亡蛋白，其表達異常與白血病的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)和耐藥密切相關。研究表明，miR-125b能夠與BAK1 mRNA結(jié)合，并進一步抑制Bak1 介導的細胞凋亡作用［4-8］，并可介導腫瘤耐藥的產(chǎn)生。Chen等［8］發(fā)現(xiàn)通過抑制miR-125b能夠提高腫瘤細胞對化療藥物的敏感性，促進腫瘤細胞凋亡。因此，通過抑制miR-125b的表達有可能為白血病的治療提供新的靶向治療方案。

目前，科學家針對miRNA的靶向治療通常采用人工合成的反義核酸技術，例如：siRNA、shRNA、鎖核酸LNA探針及人工miRNA海綿。circRNA作為體內(nèi)天然存在的microRNA 海綿，相較于短片段的siRNA及shRNA而言，具有安全性高、脫靶率低的優(yōu)勢。

Hansen TB等［9］發(fā)現(xiàn)剪接序列長度為1485nt的環(huán)狀RNA-CDR1as（也稱為ciRS-7），在其序列上有>60個保守的miR-7結(jié)合位點，因此起到有效的miR-7海綿作用，能夠影響miR-7靶標基因活性。在斑馬魚中過表達ciRS-7能夠損害中腦發(fā)育，其作用與敲除miR-7效果一致。此外，序列長度為1188nt，含有16個miR-138結(jié)合位點的ci-Sry 也被證實起到miR-138海綿作用。上述研究表明，circRNA可以miRNA海綿的方式結(jié)合miRNA影響其對靶基因的抑制作用，且circRNA對特定miRNA的海綿效應可能與其剪接序列長度及相應的miRNA可結(jié)合位點數(shù)目密切相關。

綜上所述，通過生物信息學分析發(fā)現(xiàn)剪接序列長度為524nt的has-circ-000254含有11個miR-125b結(jié)合位點，通過雙熒光素酶實驗證實，hsa_circ_0000254可高效結(jié)合miR-125b，因此hsa_circ_0000254有可能成為高表達miR-125b相關白血病靶向治療的新工具。

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Objective The bioinformatics analysis and identif i cation of structure and function of a new circRNA-- hsa_circ_0000254 with miRNA sponge function. Methods The secondary structure and the targeting sequence of hsa_circ_0000254 was identif i ed by bioinformatics analysis. Dual-luciferase reporter assay system was used to determine the influence of hsa_circ_0000254 on its target gene. Results The bioinformatics analysis revealed that the splicing sequence of hsa-circ-000254 was 524nt and contained 11 binding sites of miR-125. Dual-luciferase reporter assay system revealed that miR-125b could signif i cantly diminish luciferase activity by the reporter vector contained the 3’UTR of hsa-circ-000254. Conclusion The results strongly suggest that hsacirc-000254 can effectively combine with miR-125b and may be acted as a new molecular target therapy for leukemia which highly expressed miR-125b.

Hsa_circ_0000254 Bioinformatics analysis Dual luciferase reporter gene hsa-miR-125b

浙江省自然科學基金項目（LY17H200001；LY16H200005）

310000 浙江省中醫(yī)院（李強 陳益民 李曉芳錢煦岱）310000 浙江大學醫(yī)學院附屬第二醫(yī)院（俞石芳）315000 浙江省寧波市中心血站（鄧剛）

*通信作者