趙旭

他克莫司對(duì)難治性重癥肌無(wú)力患者療效以及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

趙旭

目的 觀察他克莫司對(duì)難治性全身型重癥肌無(wú)力的臨床療效、安全性以及治療前后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例變化。方法 選取2013-09—2015-05于遼寧省海城市中心醫(yī)院由他克莫司治療的難治性全身型重癥肌無(wú)力患者23例，采用3 mg/d的他克莫司口服治療，觀察記錄治療前以及治療后6個(gè)月每個(gè)月的MGFA以及MG-ADL評(píng)分，并檢測(cè)治療前和治療后6個(gè)月外周血中CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及Foxp3的表達(dá)水平。結(jié)果 患者M(jìn)GFA以及MG-ADL評(píng)分等臨床療效指標(biāo)接受他克莫司治療后顯著下降，并且隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)，改善的效果越好。不良反應(yīng)的發(fā)生率為43.5%(10/23)，主要表現(xiàn)為血糖的升高、腎結(jié)石、感染、頭痛頭暈、聽(tīng)力下降和腹瀉。他克莫司治療可以顯著提高外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及Foxp3的表達(dá)水平。結(jié)論 他克莫司對(duì)于難治性全身型重癥肌無(wú)力的臨床治療具有一定的療效，并且可能是通過(guò)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例的機(jī)制來(lái)發(fā)揮作用。

他克莫司；難治性重癥肌無(wú)力；MGFA；MG-ADL；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

重癥肌無(wú)力(myasthenia gravis，MG)是一種發(fā)生在神經(jīng)肌肉接頭處由AChR抗體介導(dǎo)的自身免疫性疾病[1]。目前主要的治療方法有糖皮質(zhì)激素、胸腺切除術(shù)、免疫抑制劑、血漿置換以及免疫球蛋白等[2-3]，但是仍存在部分患者對(duì)上述常規(guī)治療方法無(wú)應(yīng)答或者療效不佳，這部分患者被稱為難治性重癥肌無(wú)力(intractable myasthenia gravis)[4]。

他克莫司(tacrolimus)，又名FK506，作為免疫抑制劑的一種，目前在國(guó)外被報(bào)道應(yīng)用于難治性重癥肌無(wú)力[5-7]，但目前國(guó)內(nèi)報(bào)道的例數(shù)較少。本文通過(guò)對(duì)我科2013-09—2015-05應(yīng)用他克莫司治療的難治性全身型重癥肌無(wú)力的療效和安全性進(jìn)行評(píng)估，并通過(guò)檢測(cè)治療前后外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的變化以及轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)對(duì)其進(jìn)行初步機(jī)制的探討。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2013-09—2015-05于我院神經(jīng)內(nèi)科就診的23例確診為難治性全身型重癥肌無(wú)力患者，其中男6例，女17例；平均年齡(42.1±8.3)歲；所有患者均簽訂知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)主要參照Drachman等[8]難治性重癥肌無(wú)力的界定標(biāo)準(zhǔn)：①年齡18歲以上。②臨床上確診為重癥肌無(wú)力患者。③接受過(guò)以往常規(guī)治療(胸腺切除、免疫抑制劑以及糖皮質(zhì))并滿足以下條件之一：治療效果不佳且患者的工作生活受到明顯的影響；依賴于大劑量的糖皮質(zhì)激素治療并且伴有嚴(yán)重的不良反應(yīng)者；對(duì)糖皮質(zhì)激素治療不耐受者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①明顯肝腎功能不全者。②嚴(yán)重感染(如HIV感染)、惡性腫瘤者。③對(duì)他克莫司藥物過(guò)敏。④哺乳或妊娠期以及神經(jīng)疾病患者。⑤參與其他臨床對(duì)照治療實(shí)驗(yàn)。

1.2 治療方案 他克莫司均來(lái)源于中國(guó)安斯泰來(lái)制藥有限公司，劑量參考Tada等人之前的研究[9]，所有納入患者在保持原有治療方案的基礎(chǔ)上，口服3 mg/d他克莫司，早上1 mg，晚上2 mg，且均為飯后至少2 h后服用。所有的患者在治療前以及治療后前半年每個(gè)月進(jìn)行美國(guó)MG基金會(huì)分型評(píng)定(Myasthenia Gravis Foundation of America，MGFA)和MG日常生活量表評(píng)分(the myasthenia gravis activities of daily living scale，MG-ADL)[10-11]。

1.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群 空腹采集納入治療的患者靜脈血2 mL于EDTA抗凝管中，加入等體積的Hank's緩沖液稀釋后緩慢加到人外周血淋巴細(xì)胞分離液上層，1 000 g離心20 min之后，將中間的白膜樣淋巴細(xì)胞吸出來(lái)，將得到的人外周血單個(gè)核細(xì)胞分別用購(gòu)自BD公司的CD3+，CD25+，CD4+流式抗體標(biāo)記，室溫20 min后，根據(jù)e-Bioscience公司購(gòu)買的穿膜打孔試劑盒的操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行固定，穿膜打孔后，取Foxp3抗體室溫避光孵育1 h，加入Hank's緩沖液洗一遍后重懸細(xì)胞，上機(jī)檢測(cè)，并用Flowjo軟件對(duì)所得的各個(gè)細(xì)胞亞群的比例和表達(dá)進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0軟件對(duì)所有的變量數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析操作，結(jié)果用(±s)表示，如果所得數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，如果數(shù)據(jù)的分布不符合正態(tài)分布，則采用配對(duì)Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行比較不同時(shí)間點(diǎn)評(píng)分變化。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 研究結(jié)果

2.1 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力的療效觀察 所有23例接受治療的患者都完成了整個(gè)治療過(guò)程，中途無(wú)因不良反應(yīng)而停藥的患者。他克莫司治療難治性全身重癥肌無(wú)力的MGFA以及MG-ADL評(píng)分(表1)，與治療前相比，治療后1～6個(gè)月的時(shí)間點(diǎn)，MGFA和MG-ADL的評(píng)分隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸下降，并且各個(gè)時(shí)間點(diǎn)之間差異具有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。

表1 他克莫司治療各個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)的療效指標(biāo)的變化(±s)

表1 他克莫司治療各個(gè)隨訪時(shí)間點(diǎn)的療效指標(biāo)的變化(±s)

治療時(shí)間 n MGFA P值 MG-ADL P值1個(gè)月 23－2.33±3.51＜0.001－2.42±2.45＜0.001 2個(gè)月 23－3.68±3.71＜0.001－3.56±2.36＜0.001 3個(gè)月 23－3.90±4.03＜0.001－3.89±3.42＜0.001 4個(gè)月 23－4.32±3.95＜0.001－4.45±3.75＜0.001 5個(gè)月 23－4.67±3.83＜0.001－4.60±3.92＜0.001 6個(gè)月 23－5.54±4.65＜0.001－4.87±4.25＜0.001

2.2 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力的不良反應(yīng) 隨訪6個(gè)月的時(shí)間內(nèi)，有10例患者出現(xiàn)不同程度的藥物不良反應(yīng)，其中有4例在服藥的第4個(gè)月出現(xiàn)空腹血糖的升高，3例出現(xiàn)腎結(jié)石和輕微的感染，其他3例分別出現(xiàn)不同程度的頭痛頭暈、聽(tīng)力下降和腹瀉。不良反應(yīng)的發(fā)生率為43.5%(10/23)。

2.3 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例以及Foxp3表達(dá)的變化 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力前后外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞比例以及Foxp3在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平(表2)，治療6個(gè)月后，外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞較治療前顯著增加 (P＜0.05)，F(xiàn)oxp3在CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)水平顯著增加(P＜0.01)。

表2 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力前后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及Foxp3表達(dá)(±s)

表2 他克莫司治療難治性重癥肌無(wú)力前后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例及Foxp3表達(dá)(±s)

組別 治療前 治療后6個(gè)月 P值CD4+CD25+/CD4+ 6.52±1.85 8.83±1.42 ＜0.05 Foxp3+/CD4+CD25+ 0.91±0.24 1.23±0.16 ＜0.01

3 討論

他克莫司作為一種免疫抑制劑，目前廣泛用于一些自身免疫病如系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性肝病等的研究[12-13]。自20世紀(jì)90年代起，他克莫司被用于重癥肌無(wú)力的治療，Minami等[14]報(bào)道了利用2～3 mg/d的他克莫司治療全身型重癥肌無(wú)力的9例患者，并隨訪5年發(fā)現(xiàn)可以明顯增強(qiáng)MG-ADL，并可以將糖皮質(zhì)激素的治療從24 mg/d減至10.2 mg/d。Nagaishi等[15]用3 mg/d的他克莫司聯(lián)合糖皮質(zhì)激素治療10例重癥肌無(wú)力患者，發(fā)現(xiàn)7例癥狀得到明顯的改善，并且副作用較低。在本文的研究中，我們采用了3 mg/d的他克莫司治療23例難治性全身型重癥肌無(wú)力患者，同時(shí)采用了MGFA以及MG-ADL反映臨床的療效。其中MGFA主要反映的是重癥肌無(wú)力患者的疲勞耐受性，而MG-ADL主要反映重癥肌無(wú)力患者日常生活狀態(tài)，我們研究發(fā)現(xiàn)，在他克莫司治療1個(gè)月后，患者的日常生活就得到了明顯的改善，并且隨著治療的時(shí)間延長(zhǎng)，改善一直在逐步持續(xù)。在納入的23例患者中，其中存在16例聯(lián)合潑尼松治療的患者，發(fā)現(xiàn)加入他克莫司進(jìn)行聯(lián)合治療后，其中13例患者潑尼松的使用劑量顯著減少，3例患者由于減少了潑尼松的使用劑量導(dǎo)致治療效果不佳，最后重新恢復(fù)原有的劑量。我們的研究與之前國(guó)外報(bào)道的結(jié)果相一致，說(shuō)明他克莫司對(duì)于難治性重癥肌無(wú)力的臨床癥狀改善具有較好的療效。

重癥肌無(wú)力患者中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量下降以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞的大量增殖和激活是其發(fā)病的機(jī)制之一[16]。糖皮質(zhì)激素的治療可以顯著地提高調(diào)節(jié)性T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子Foxp3 mRNA的表達(dá)水平，暗示著糖皮質(zhì)激素可能是通過(guò)促進(jìn)外周調(diào)節(jié)性T細(xì)胞數(shù)量的增加減弱重癥肌無(wú)力患者體內(nèi)自身免疫性反應(yīng)[17]。有研究發(fā)現(xiàn)他克莫司可以通過(guò)上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例來(lái)治療尋常型銀屑病[18]。在本研究中發(fā)現(xiàn)，他克莫司治療6個(gè)月后，外周血無(wú)論是CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例還是轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)水平均顯著上調(diào)，暗示著他克莫司可能也是通過(guò)上調(diào)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞比例和活性降低自身反應(yīng)性T細(xì)胞的增殖和激活。

綜上所述，他克莫司對(duì)于臨床難治性全身型重癥肌無(wú)力患者在臨床上具有一定的療效，副作用較小，并且他克莫司可能是通過(guò)增加調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的比例和數(shù)量降低重癥肌無(wú)力的外周自身免疫性反應(yīng)，但是本研究中樣本數(shù)量有限，仍然需要擴(kuò)大樣本進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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Objective To explore the clinical effects and safety of Tacrolimus in the treatment of refractory systemic type myasthenia gravis and observe the changes of regulatory T cells proportion before and after treatment.Methods 23 patients who were diagnosed with refractory systemic type myasthenia gravis and treated with Tacrolimus at Haicheng Central Hospital，Liaoning Province from September 2013 to May 2015 were selected and given oral Tacrolimus for 3mg/d.Scores of MGFA and MG-ADL were measured before treatment and monthly during the first 6 months after treatment.Meanwhile the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood before treatment and during the 6 months after treatment were analyzed.Results The clinical effect indexes of MGFA and MG-ADL were significantly decreased after treatment of Tacrolimus，and with time going，the improvement effects got better.The incidence rate of adverse reaction was 43.5%(10/23)，mainly including blood glucose rise，kidney stone，infection，headache and dizziness，hearing loss and diarrhea.Tacrolimus can significantly increase the expression levels of CD4+CD25+regulatory T cells proportion and Foxp3 in peripheral blood.Conclusion Tacrolimus shows certain curative effects in the clinical treatment of refractory systemic type myasthenia gravis，which is likely to exert the function by means of increasing the regulatory T cells proportion.

Tacorlimus；Refractory myasthenia gravis；MGFA；MG-ADL；Regulatory T cells

2016-12-09)

1005-619X(2017)05-0472-03

10.13517/j.cnki.ccm.2017.05.009

114200 遼寧省海城市中心醫(yī)院