吳 淼， 劉信寶， 丁立人， 李志華*

(1. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院， 江蘇 南京 210095； 2. 南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院， 江蘇 南京 210095)

紫花苜蓿(Medicagosativa)作為牧草之王，其生產(chǎn)實(shí)踐運(yùn)用最廣，種植面積最大，營養(yǎng)豐富，種植歷史悠久。苜蓿大多種植在我國干旱和半干旱地區(qū)，干旱環(huán)境很大程度影響紫花苜蓿生長和生產(chǎn)，而且由于我國水資源分布不均且短缺，干旱和半干旱面積占我國面積一半以上，水分條件成為紫花苜蓿栽培重要限制因素。種子萌發(fā)和幼苗生長是植物生長的關(guān)鍵階段，水分對于種子萌發(fā)和苗期生長尤為重要，并且萌發(fā)期間種子耐旱性在一定程度反映植物抗旱性[1]。硅是植物生長必不可少的元素，雖然土壤中硅含量豐富，但其中能被植物有效吸收的硅含量很低。研究表明外源性硅能夠提高植物滲透調(diào)節(jié)能力和有助于啟動(dòng)抗氧化機(jī)制[2],并且能通過表皮組織里形成角質(zhì)—硅質(zhì)雙層結(jié)構(gòu),抑制蒸騰和沉積在細(xì)胞壁和角質(zhì)間，降低水分散失，達(dá)到提高植物抗旱性的目的[3-5]。目前國內(nèi)外對硅的研究多集中于水稻(Oryza.sativaL)、小麥(Triticumaestivum)、瓜果蔬菜等[6],而對豆科植物影響的研究僅限于作物大豆[7]和木本植物豇豆[8]。

聚乙二醇-6000(polyethylene glycol，PEG-6000)溶于水后有很大的滲透壓，常被用作滲透調(diào)節(jié)劑來模擬干旱，用其研究紫花苜?？购敌?，操作方便、重復(fù)性好。目前，有關(guān)硅對紫花苜?？购敌匝芯繄?bào)道甚少[9]，尚缺乏系統(tǒng)研究。本研究利用聚乙二醇6000進(jìn)行干旱模擬，探討不同濃度的硅肥對干旱脅迫條件下紫花苜蓿種子萌發(fā)及生理特性的影響，篩選出適宜的硅肥用量，初步探討硅肥調(diào)控紫花苜蓿抗旱性的機(jī)理，為硅肥調(diào)控紫花苜蓿抗旱性的深入研究奠定基礎(chǔ)，亦為硅肥應(yīng)用于干旱地區(qū)紫花苜蓿生產(chǎn)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.1.1試驗(yàn)材料 供試草種為紫花苜蓿的賽迪品種(MedicagosatiavaL.‘Sadie7’)，種子由百綠集團(tuán)提供。硅酸鉀與聚乙二醇購于南京壽德試驗(yàn)器材有限公司，硅酸鉀試劑為化學(xué)純。

1.1.2試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)于2016年4月11日開始于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)草業(yè)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。采用培養(yǎng)皿砂培的方法。設(shè)0%，5%，10%，15%共4個(gè)聚乙二醇(PEG)處理濃度模擬干旱條件，其分別對應(yīng)的溶液水勢依次為0.00 MPa，-0.10 MPa，-0.20 MPa，-0.40 MPa。硅肥采用化學(xué)純水合硅酸鉀(K2SiO3·nH2O)，分別設(shè)置0，1.0，2.0，2.5 mmol·L-1的4個(gè)濃度處理，依次用Si 0.0，Si 1.0，Si 2.0，Si 2.5表示，用含有相同濃度的KC1溶液來平衡K2SiO3溶液中的K+,消除其影響。每個(gè)處理4次重復(fù),共64個(gè)處理。選用φ90 mm的培養(yǎng)皿,用蒸餾水清洗石英砂作為基質(zhì)，以一定濃度的K2SiO3或KCl混合溶液濕潤至飽和。選取籽粒飽滿,大小均勻的紫花苜蓿種子于5%次氯酸鈉溶液中浸種消毒15 min[10],用蒸餾水沖洗干凈,用濾紙吸干多余水分，每皿播100粒種子。置于25℃恒溫,12 h光照,12 h暗培養(yǎng)，相對濕度為70%的人工氣候箱(RXZ智能型)內(nèi)培養(yǎng)。釆用稱重法每日補(bǔ)充蒸散的水分以維持溶液滲透勢的恒定，將培養(yǎng)皿每日按一定的空間順序上下交換位置。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1生長指標(biāo)的測定 從種子置床次日起開始觀察，當(dāng)胚芽長度為種子一半時(shí)，認(rèn)為已經(jīng)發(fā)芽。

發(fā)芽勢(%)=第4天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

發(fā)芽率(%)=第10天統(tǒng)計(jì)全部發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù)×100

胚根長：每個(gè)培養(yǎng)皿中隨機(jī)選取發(fā)芽幼苗各10株進(jìn)行胚根長測定。

1.2.2生理指標(biāo)的測定 酶液的提取:參照Xue等[11]的方法,研磨幼苗后提取酶液并置于4℃冰箱保存。用于過氧化物酶(peroxidase, POD)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)、過氧化氫酶(catalase, CAT)活性、丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量和可溶性蛋白含量的測定。

POD、SOD、CAT活性均參照李合生[12]的方法：POD活性采用愈創(chuàng)木酚法測定，SOD活性采用氮藍(lán)四唑(NBT)法測定，CAT活性采用過氧化氫分解測定，MDA含量采用硫代巴比妥酸顯色法測定。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)分析各項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性分析,用Excel統(tǒng)計(jì)并制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PEG干旱脅迫下硅對紫花苜蓿發(fā)芽及生長的影響

2.1.1發(fā)芽勢 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對發(fā)芽勢的影響不同(表1)。同一PEG濃度干旱脅迫下，發(fā)芽勢隨硅濃度增加呈先升高后降低的趨勢。在PEG濃度為0%的非干旱脅迫條件下，Si 1.0和Si 2.0處理的紫花苜蓿發(fā)芽勢明顯高于未施硅肥的對照Si 0.0，且Si 2.0處理明顯高于Si 0.0和其他2個(gè)硅處理(P<0.05)；PEG濃度分別在5%和10%處理下，Si 2.5的發(fā)芽勢均顯著低于對照Si 0.0。當(dāng)PEG為15%濃度時(shí)，Si 1.0及Si 2.0發(fā)芽勢顯著高于對照Si 0.0(P<0.05)。同一硅肥水平下，發(fā)芽勢隨PEG濃度變化而變化。在未施硅肥Si 0.0水平下，10%PEG顯著高于0%，5%和15%PEG處理，且3個(gè)處理之間差異不顯著；在Si 1.0處理，5%和10%PEG濃度下，紫花苜蓿發(fā)芽勢均顯著高于0%PEG和15%PEG處理(P<0.05)。在Si 2.5水平，3個(gè)PEG處理與對照差異不顯著；Si 2.5水平，在各PEG脅迫處理發(fā)芽勢顯著高于對照(P<0.05)?？梢?，在干旱脅迫下，適宜濃度的硅肥可提高紫花苜蓿的發(fā)芽勢。

表1 不同PEG脅迫下硅酸鉀對萌發(fā)的影響Table 1 Effects of sicicon on germination under different PEG stress

注：同行不同小寫字母表示同一硅酸鉀濃度下不同PEG濃度處理間差異顯著(P<0.05)；同列不同大寫字母表示同一PEG濃度下不同硅酸鉀濃度處理間差異顯著(P<0.05)

Note: Different lowercase letters in the same row indicate sigificant difference within the same potassium silicate concentration under different PEG concentration treatment , different capital letters in the same column indicate significantly different within the same PEG concentration of different potassium silicate concentration treatment at the 0.05 level

2.1.2發(fā)芽率 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對發(fā)芽率的影響存在差異(表1)。同一PEG濃度干旱脅迫下，分別在0%，5%和10% PEG下，Si 2.5發(fā)芽率均顯著低于對照Si 0.0和其他2個(gè)硅處理(P<0.05)，且Si 1.0，Si 2.0和對照Si 0.0之間差異不顯著。PEG為15%濃度時(shí)，各硅處理間以及與對照Si 0.0間差異均不顯著。同一硅濃度水平下，在未施硅肥Si 0.0水平下，10%PEG處理顯著高于0%和15%PEG處理(P<0.05)，而與5%PEG處理間差異不顯著；在Si 1.0水平下，10%PEG處理明顯高于0%，5%和15%PEG處理(P<0.05)，且3個(gè)PEG處理之間差異不顯著。在Si 2.0水平下，3個(gè)PEG處理均與對照0%PEG差異不顯著，10%PEG明顯高于5%PEG處理(P<0.05)；在Si 2.5水平下，3個(gè)PEG處理間存在顯著差異，均使紫花苜蓿的發(fā)芽率明顯高于對照(P<0.05)。說明在干旱脅迫下，適宜濃度的硅肥處理促進(jìn)了紫花苜蓿的發(fā)芽。

2.1.3胚根長 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對紫花苜蓿胚根生長產(chǎn)生明顯的影響(表1)。同一PEG濃度下，分別在0%PEG和10%PEG下，3種硅肥處理與對照Si 0.0差異不顯著，對紫花苜蓿胚根生長影響不大；在5%PEG水平下，Si 1.0處理明顯低于對照Si 0.0和Si 2.5處理(P<0.05)，與Si 2.0差異不顯著；在15%PEG水平下，Si 1.0與對照Si 0.0差異不顯著，明顯高于Si 2.0和Si 2.5處理(P<0.05)，后兩者之間差異不顯著。同一硅肥水平下，隨PEG濃度提高，胚根呈增長的趨勢。Si 0.0水平下，3個(gè)PEG處理存在顯著差異，且明顯高于0%PEG處理(P<0.05)；分別在Si 1.0和Si 2.0水平，10%和15%PEG處理與5%PEG處理差異顯著，均明顯高于0%和5%PEG處理(P<0.05)。在Si 2.5水平下，3個(gè)PEG處理明顯高于0%PEG處理(P<0.05)，對紫花苜蓿胚根伸長生長具有促進(jìn)作用。

2.2 PEG干旱脅迫下硅對紫花苜蓿生理特性的影響

2.2.1POD活性 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對POD活性的影響不同(圖1)。同一PEG濃度下，不同硅肥處理紫花苜蓿POD活性不同。5%PEG濃度下，POD活性在各硅酸鉀處理均顯著高于對照Si 0.0(P<0.05)；10%PEG濃度下，Si 1.0及Si 2.0處理均顯著高于對照Si 0.0(P<0.05)；15%PEG濃度下，Si 2.0和Si 2.5處理差異不顯著，使紫花苜蓿POD活性明顯高于對照Si 0.0和Si 1.0。由此可見，同一適宜的硅肥濃度和水分條件處理，通過提高紫花苜蓿POD活性，在一定的濃度范圍內(nèi)，硅酸鉀促進(jìn)了幼苗POD含量。同一硅肥水平，POD含量隨PEG濃度升高而顯著提高。Si 0.0水平下，3個(gè)PEG處理存在顯著差異，且明顯高于0%PEG處理(P<0.05)；在Si 1.0水平，10%和15%PEG處理差異不顯著，均明顯高于5%PEG處理和0%PEG處理(P<0.05)；分別在Si 2.0和Si2.5水平，3個(gè)PEG處理間及與對照0%PEG紫花苜蓿POD活性均存在顯著差異(P<0.05)。

圖1 不同PEG干旱脅迫下硅肥對POD活性的影響Fig.1 Effect of potassium silicate on POD under different PEG stress注：不同小寫字母表示同一硅酸鉀濃度下不同PEG濃度處理間差異顯著(P<0.05)； 不同大寫字母表示同一PEG濃度下不同硅酸鉀濃度處理間差異顯著(P<0.05)，下同Note: Different lowercase letters indicate significant difference within the same potassium silicate concentration under different PEG concentration treatment at the 0.05 level, different capital letters indicate significant different within the same PEG concentration of different potassium silicate concentration treatment at the 0.05 level, the same as below

2.2.2SOD活性 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對SOD活性的影響不同(圖2)同一PEG濃度下，紫花苜蓿SOD活性隨硅肥濃度升高而呈先升高后下降的趨勢。各PEG脅迫下，Si 1.0，Si 2.0和Si 2.5的SOD活性都顯著高于對照Si 0.0(P<0.05)。分別在10%和15%PEG脅迫下，Si 2.0處理顯著高于Si 0.0和Si 1.0，但與Si 2.5差異不顯著。說明硅肥對紫花苜蓿SOD活性有積極影響。比較同一硅肥水平，不同PEG脅迫下SOD活性的變化。在Si 0.0水平下，10%PEG處理顯著高于對照，而15%PEG處理顯著低于對照(P<0.05)。在Si 1.0水平下，10%PEG處理顯著高于對照及其他PEG脅迫。在Si 2.0水平下，5%和10%PEG處理顯著高于對照(P<0.05)，且兩個(gè)處理間差異不顯著。在Si 2.5水平下，10%PEG處理顯著高于對照，且與其他脅迫處理差異不顯著。

圖2 不同PEG干旱脅迫下硅肥對SOD活性的影響Fig.2 Effect of potassium silicate on SOD aceivity under different PEG stress

2.2.3CAT活性 不同干旱脅迫下不同濃度硅肥對CAT活性的影響不同(圖3),同一PEG濃度下，整體紫花苜蓿CAT活性隨硅肥增加而有所增加。在0%PEG濃度下，Si 1.0，Si 2.0和Si 2.5處理都顯著高于對照Si 0.0，且各處理間差異顯著(P<0.05)。分別在5%，10%和15%脅迫下，Si 2.0及Si 2.5處理CAT活性均顯著高于對照(P<0.05)，而與Si 1.0差異不顯著。硅肥可以提高紫花苜蓿植物體內(nèi)CAT活性。比較同一硅肥下，不同干旱脅迫對紫花苜蓿CAT活性影響。在Si 0.0水平下，各處理脅迫都顯著高于對照(P<0.05)。在Si 1.0和Si 2.0水平下，5%PEG脅迫下CAT活性顯著高于對照(P<0.05)，而與其他脅迫差異不顯著。在Si 2.5水平下，15%PEG處理顯著高于對照而與其他脅迫處理差異不顯著。說明硅肥對紫花苜蓿干旱條件下CAT活性有正面促進(jìn)作用。

圖3 不同PEG干旱脅迫下硅肥對CAT活性的影響Fig.3 Effect of potassium silicate on CAT activity under different PEG stress

2.2.4MDA含量 不同干旱脅迫下不同濃度的硅肥對紫花苜蓿MDA含量的影響不同(圖4)。同一PEG濃度條件下，MDA含量隨硅肥濃度變化而變化。0%PEG濃度下，3種硅肥處理下紫花苜蓿MDA含量均明顯低于對照Si 0.0，3個(gè)硅肥處理間差異顯著(P<0.05)；5%PEG濃度下，Si 1.0處理顯著低于對照Si 0.0，Si 2.0處理MDA含量顯著高于對照Si 0.0(P<0.05)，Si 2.5處理與對照Si 0.0差異不顯著；10%PEG濃度下，Si 1.0和Si 2.5處理MDA含量顯著低于對照Si 0.0，Si 2.0處理與對照Si 0.0差異不顯著；15%PEG濃度下，Si 2.0和Si 2.5顯著低于對照Si 0.0和Si 1.0處理(P<0.05)，Si 1.0處理與對照Si 0.0差異不顯著。在同一硅肥水平下，MDA含量隨干旱脅迫的增加有升高趨勢。Si 0.0水平，15%PEG處理紫花苜蓿MDA含量最高，明顯高于對照0%PEG，5%PEG和10%PEG處理(P<0.05)；在Si 1.0水平，10%PEG和15%PEG處理MDA顯著高于對照0%PEG和5%PEG處理(P<0.05)，5%PEG處理與對照0%PEG差異不顯著；分別在Si 2.0和Si 2.5水平，3個(gè)PEG處理使紫花苜蓿的MDA含量顯著高于對照0%PEG(P<0.05)?？梢?，干旱脅迫對紫花苜蓿幼苗的MDA含量產(chǎn)生了影響。

圖4 不同PEG干旱脅迫下硅肥對MDA含量的影響Fig.4 Effect of potassium silicate on MDA content under different PEG stress

3 討論

3.1 不同干旱脅迫下硅肥對紫花苜蓿萌發(fā)的影響

種子萌發(fā)是植物對干旱脅迫的最初反應(yīng),也是對水分要求最敏感的時(shí)期，水分脅迫一定程度擾亂種子萌發(fā)代謝。但也有研究表明[13]，一定干旱程度會(huì)刺激植物產(chǎn)生反饋效應(yīng)，從而提高植物發(fā)芽率。本研究發(fā)現(xiàn)10%PEG脅迫反而促使種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率提高。但當(dāng)脅迫強(qiáng)度增加時(shí)，種子胚根長減少，植物發(fā)芽率降低，產(chǎn)量降低。劉慧霞等[9]采用水培法，研究了硅對紫花苜蓿種子萌發(fā)和幼苗生長發(fā)育的影響，表明硅直接參與種子萌發(fā)和幼苗生長，表明硅對紫花苜蓿生長生理的影響是客觀存在的。本試驗(yàn)結(jié)果表明，10%PEG脅迫下，施用1.00 mmol·L-1硅酸鉀，種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高。余群[14]研究硅肥對早熟禾(PoapratensisL.)萌發(fā)的影響發(fā)現(xiàn)，硅肥能顯著提高早熟禾發(fā)芽率、發(fā)芽勢，尤其以1.5 mmol·L-1效果最好。已有研究表明15%PEG溶液處理能使紫花苜蓿萌發(fā)降至最低[15]，但本試驗(yàn)中紫花苜蓿種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率并沒有因?yàn)楦珊得{迫的加強(qiáng)而降低，說明添加適量硅酸鉀在種子萌發(fā)過程中起到了一定的作用，從而維護(hù)和保持了紫花苜蓿種子的萌發(fā)。但在2.50 mmol·L-1硅酸鉀處理時(shí)，顯著降低了種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率，說明過高濃度硅酸鉀會(huì)抑制其發(fā)芽。合理控制硅酸鉀濃度，可以提高紫花苜蓿種子逆境下萌發(fā)能力，一定程度解決干旱地區(qū)紫花苜蓿栽培障礙，并起到節(jié)水作用。

3.2 不同程度PEG干旱脅迫下硅對紫花苜蓿生理的影響

在正常生長環(huán)境下，植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和清除保持動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)植物遭受滲透脅迫時(shí),細(xì)胞中活性氧的積累可以造成細(xì)胞傷害甚至死亡,而POD、SOD和CAT等保護(hù)酶能清除活性氧，使細(xì)胞免于傷害或抗性增強(qiáng)[16]。周秀杰[17]研究表明，硅提高了黃瓜(CucumissativusL.)幼苗POD、SOD和CAT的活性，增強(qiáng)了活性氧清除能力和抗膜質(zhì)過氧化能力，這是硅提高黃瓜幼苗抗旱性的重要生理學(xué)基礎(chǔ)之一。本研究中，施用硅肥后，SOD活性均顯著高于對照。SOD能使O2ˉ發(fā)生歧化轉(zhuǎn)化成H2O2，再由CAT和POD分解進(jìn)行后續(xù)工作[18]，從而防止膜質(zhì)過氧化作用而破壞。丁燕芳[19]在硅提高小麥抗旱性的機(jī)理研究中也得到同樣結(jié)論。因此，外源硅可以提高紫花苜蓿在PEG脅迫下的SOD活性。

曹逼力等[20]證實(shí)硅能在干旱脅迫下提高番茄植株根系POD活性,提高活性氧清除酶活性，減輕膜脂過氧化程度，對幼苗抗旱性有積極的促進(jìn)作用。這與本試驗(yàn)結(jié)果一致，本試驗(yàn)中，當(dāng)施用2.00 mmol·L-1硅酸鉀后，幼苗POD活性在滲透脅迫下增加幅度提高，減輕了幼苗在滲透脅迫下因活性氧積累過多而造成的損傷。

本研究中，紫花苜蓿幼苗CAT活性隨硅肥濃度增加而呈現(xiàn)增加趨勢。分別在5%、10%和15%PEG脅迫下，2.50 mmol·L-1硅肥處理使CAT活性顯著高于對照未施硅肥。這與明東風(fēng)[21]在水分脅迫下硅對水稻生理影響的研究結(jié)果一致，同時(shí)指出外源硅可以改善膜結(jié)構(gòu)，使其在干旱脅迫下，降低活性氧產(chǎn)生。說明適宜的硅肥可以提高紫花苜蓿的CAT活性，從而維持一定的抗旱性。

MDA是植物在逆境下產(chǎn)生的一種膜脂過氧化產(chǎn)物，積累過高會(huì)不同程度破壞植物細(xì)胞膜和酶，丙二酸含量越低,抗旱能力越強(qiáng)[16]。本研究得到，在15%PEG濃度下，2.00 mmol·L-1和2.50 mmol·L-1硅處理顯著降低了幼苗MDA含量。這與劉慧霞[22]研究結(jié)果一致，即在一定干旱脅迫下，外源性硅能降低紫花苜蓿MDA含量。5%和10%PEG模擬干旱脅迫下，硅處理后其MDA含量相比對照減少不顯著。說明需達(dá)到一定程度干旱脅迫，硅對紫花苜?？购敌宰饔貌艜?huì)加強(qiáng)，這與余群[14]研究結(jié)果一致，即干旱脅迫下硅肥對草地早熟禾苗期生長發(fā)育的影響中，MDA含量隨著干旱脅迫的加劇與對照間差異越發(fā)顯著一致。同時(shí)也符合硅對生長在干旱逆境中的紫花苜蓿的影響作用要比生長在濕潤條件下的作用大[22]。不同程度干旱脅迫下,過高或過低硅酸鉀含量都會(huì)影響其MDA含量。

4 結(jié)論

在干旱脅迫下，施硅肥可以一定程度提高紫花苜?？购敌裕刂乒杷徕洕舛仍?.00～2.00 mmol·L-1可以有效提高紫花苜?？购敌?。施用2.00 mmol·L-1硅酸鉀可以提高紫花苜蓿幼苗POD、SOD活性，施用2.50 mmol·L-1硅酸鉀可以提高CAT活性。在15%PEG濃度下，2.00 mmol·L-1和2.50 mmol·L-1硅處理顯著降低了幼苗MDA含量，減少細(xì)胞膜膜脂氧化程度，維持細(xì)胞膜穩(wěn)定性。硅肥使紫花苜蓿種子在干旱脅迫下維持一定發(fā)芽率、發(fā)芽勢和胚根長，并且維護(hù)細(xì)胞膜穩(wěn)定性和抗氧化酶活性，使其在逆環(huán)境下還能保持萌發(fā)，這對農(nóng)業(yè)生產(chǎn)有積極的意義。