徐禮生， 高貴珍， 曹穩(wěn)根， 趙 亮，張興桃， 焦慶才，陳 軍， 宋 曼

（1.宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210093）

水/有機(jī)溶劑雙相體系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸

徐禮生1，2， 高貴珍1， 曹穩(wěn)根1， 趙 亮1，張興桃1， 焦慶才2，陳 軍1， 宋 曼1

（1.宿州學(xué)院 生物與食品工程學(xué)院，安徽 宿州 234000；2.南京大學(xué) 醫(yī)藥生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210093）

本文作者研究了水/有機(jī)溶劑雙相體系中利用色氨酸合成酶催化L-絲氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸，考察了有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)、pH、反應(yīng)溫度、表面活性劑、金屬離子和底物濃度對(duì)色氨酸合成酶催化合成2-甲基-L-色氨酸的影響。有機(jī)溶劑包括二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯和辛醇，表面活性劑包括吐溫80、聚乙二醇辛基苯基醚（OP）、CTAB和Trion X-100，金屬離子包括Mg2+、Ca2+、Cu2+、Co2+和Zn2+。結(jié)果表明，酶法最佳轉(zhuǎn)化條件為：有機(jī)相溶劑為甲苯，甲苯體積分?jǐn)?shù)為2%，反應(yīng)溫度為40℃，水相pH為8，底物L(fēng)-絲氨酸濃度為150 mmol/L，表面活性劑Trion X-100質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%，金屬離子Ca2+濃度為0.1 mmol/L，色氨酸合成酶酶促反應(yīng)5 h，2-甲基-L-色氨酸的質(zhì)量濃度為21.17 g/L。重組大腸桿菌DM206可作為2-甲基-L-色氨酸生產(chǎn)菌，具有較好的2-甲基-L-色氨酸生產(chǎn)潛力。

色氨酸合成酶；2-甲基-L-色氨酸；L-絲氨酸；2-甲基吲哚

色氨酸在生物體非核糖體多肽和生物堿合成中具有重要作用[1]，一些色氨酸衍生物同樣具有重要作用，例如5-羥基色氨酸[2-3]，7-氯-色氨酸[4]和2-甲基-L-色氨酸[5]。2-甲基-L-色氨酸是抗菌素硫鏈絲菌肽合成中重要的中間體[6]，含有2-甲基色氨酸的寡肽化合物可以使親軀體細(xì)胞（somatotrope）釋放生長(zhǎng)素，哺乳動(dòng)物服用能誘導(dǎo)生長(zhǎng)激素釋放的化合物之后，動(dòng)物體內(nèi)的生長(zhǎng)素提高，使動(dòng)物生長(zhǎng)速度加快[5]。采用來源于Salmonella enterica的色氨酸合成酶酶法進(jìn)行合成2-甲基-L-色氨酸，但是反應(yīng)收率低且反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)[7]。由于底物2-甲基吲哚在水中溶解度低，故在水相中酶反應(yīng)速度相對(duì)較低。自20世紀(jì)80年代以來，Kirchner等[8]在水/有機(jī)溶劑體系中用脂肪酶催化合成脂、肽和手性醇等化合物，非水相酶催化已成為生物工程等領(lǐng)域中的研究熱點(diǎn)之一，包括水/有機(jī)溶劑雙相體系、反相膠團(tuán)體系和超臨界流體體系等[9-14]。在酶催化過程中，雙相體系對(duì)酶催化具有促進(jìn)作用，如劉森林等人研究了水/有機(jī)溶劑雙相中來源于杏仁的 （R）-醇腈酶催化苯甲醛與HCN不對(duì)稱合成（R）-苯乙氰醇，系統(tǒng)探討了有機(jī)溶劑、水相與有機(jī)溶劑相體積比、水相pH值和反應(yīng)溫度對(duì)反應(yīng)速度、產(chǎn)率和產(chǎn)物光學(xué)純度的影響，在優(yōu)化反應(yīng)條件下反應(yīng)產(chǎn)率和產(chǎn)物的光學(xué)純度均高達(dá)99%以上[14]。周華等人研究了雙水相體系酶法合成L-苯丙氨酸，以天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶為催化劑，雙水相體系質(zhì)量組成為聚乙二醇4 000（質(zhì)量分?jǐn)?shù)20%）/Na2HPO4（質(zhì)量分?jǐn)?shù)16%）。苯丙酮酸鈉鹽、細(xì)胞和L-苯丙氨酸在雙水相體系中的分配系數(shù)分別為8.03，31.7和0.74，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度為43.4 g/L時(shí)，該體系酶法合成L-苯丙氨酸得率為78.1%，比在水溶液體系中提高了27.4%[15]。

本文作者在水/有機(jī)溶劑雙相體系中，利用重組大腸桿菌 DM206[pETDuet-trpBA+trpA/BL21（DE3）]色氨酸合成酶催化L-絲氨酸和2-甲基吲哚合成2-甲基-L-色氨酸（見圖1），優(yōu)化了轉(zhuǎn)化條件，為酶法合成2-甲基-L-色氨酸提供了新思路。

圖1 酶催化合成2-甲基-L-色氨酸示意Fig.1 Synthesis of L-2-methyltryptophan from L-serine and indole catalyzed by tryptophan synthase

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L-絲氨酸、2-甲基吲哚、2-甲基-L-色氨酸、甲醇、吐溫80、聚乙二醇辛基苯基醚（OP）、CTAB和Trion X-100：購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司；二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯和辛醇：購(gòu)于合肥中皖化學(xué)試劑公司，甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）：天根生化科技有限公司產(chǎn)品；L-絲氨酸 （質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%）：安徽華恒生物工程有限公司產(chǎn)品；2-甲基吲哚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%）：南京臺(tái)硝生物質(zhì)工程有限公司產(chǎn)品；重組大腸桿菌DM206[pETDuet-trpBA+ trpA/BL21（DE3）]，作者所在實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；將活化好的重組大腸桿菌種子液以體積分?jǐn)?shù)2%接種量接入裝有100mL無菌LB培養(yǎng)基的250 mL的搖瓶中，在37℃和170 r/min條件下發(fā)酵4 h后，加入終濃度0.4 mmol/L的IPTG，降至28℃繼續(xù)發(fā)酵12 h，發(fā)酵完后離心收集菌體，用無菌水洗滌后，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LC-20AT型島津高效液相色譜儀，日本島津公司產(chǎn)品；THZ-CK型空氣恒溫振蕩器，太倉(cāng)博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠制造；THZ-CK型空氣恒溫振蕩器，太倉(cāng)博萊特實(shí)驗(yàn)儀器廠制造。

1.2 酶法合成L-2-甲基色氨酸及酶活測(cè)定

將0.1 g菌體加入50 mL雙相反應(yīng)體系中，水相含有100mmol/L L-絲氨酸（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.9%），有機(jī)溶液相含有一定量2-甲基吲哚（質(zhì)量分?jǐn)?shù)99%），于設(shè)定pH、溫度和170 r/min振蕩條件下反應(yīng)；另以不加有機(jī)溶劑的純水相作為對(duì)照，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。定時(shí)取樣，以高效液相色譜法測(cè)定2-甲基-L-色氨酸生成量，液相條件為：分離柱為 （5μm×250 mm×4.6mm）島津 C18，流動(dòng)相分配比為V（質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.025%磷酸溶液）∶V（甲醇）=20∶80，保留時(shí)間為3.610 min，在檢測(cè)波長(zhǎng)為263 nm處檢測(cè)2-甲基-L-色氨酸。將酶活定義為在上述條件下，每1min生成1mmol的2-甲基-L-色氨酸所用的酶量，單位U/g。高效液相色譜儀測(cè)定2-甲基-L-色氨酸生成量：

式 （1）中，R為2-甲基-L-色氨酸產(chǎn)率；R0為2-甲基-L-色氨酸實(shí)際生成量；R1為2-甲基-L-色氨酸理論生成量。

2 結(jié)果與討論

2.1 有機(jī)溶劑影響

有機(jī)溶劑是影響雙相體系中酶催化合成2-甲基-L-色氨酸反應(yīng)，由于底物2-甲基吲哚在水中溶解度較小，酶分子周圍底物因濃度較低，而處于邊反應(yīng)邊溶解的狀態(tài)，傳質(zhì)過程受到限制，故反應(yīng)速度相對(duì)較低，為了提高酶反應(yīng)速度，通過增加底物2-甲基吲哚在酶反應(yīng)體系中溶解度，以提高酶反應(yīng)速度；但另一方面有機(jī)溶劑往往會(huì)剝奪酶分子表面水化層，導(dǎo)致酶分子與有機(jī)溶劑接觸而使酶活性降低，所以需要選擇合適的有機(jī)溶劑和有機(jī)溶劑添加量，促進(jìn)酶促反應(yīng)。本文中選用二甲苯、甲苯、乙酸乙酯、乙酸丁酯和辛醇作為有機(jī)相，以不加有機(jī)溶劑純水相的酶活設(shè)定為100%，反應(yīng)條件為5 mmol L-絲氨酸和5mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%磷酸吡哆醛（PLP）150μL，總反應(yīng)體積50mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，不同有機(jī)溶劑1mL，pH 8.0，30℃，反應(yīng)結(jié)果見圖2，可以看出以甲苯作為有機(jī)相時(shí)，色氨酸合成酶相對(duì)酶活最高，所以選擇最合適的有機(jī)溶劑為甲苯。

2.2 有機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)影響

雙相體系中甲苯體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶反應(yīng)的影響見圖3，以不加有機(jī)溶劑純水相的酶活設(shè)定為100%（反應(yīng)條件為5mmol L-絲氨酸和5mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PLP 150μL，不同體積分?jǐn)?shù)甲苯，總反應(yīng)體積50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，pH 8.0，30℃）。由圖3可見，隨著甲苯體積分?jǐn)?shù)的增加，酶活逐漸增加，但體積分?jǐn)?shù)超過2%時(shí)，酶活開始降低。有機(jī)溶劑可提高底物2-甲基吲哚的溶解度，增加酶分子與底物接觸的機(jī)會(huì)，因而酶活增加，但過量有機(jī)溶劑往往會(huì)剝奪酶分子表面水化層而進(jìn)入酶分子內(nèi)部的活性中心，破壞了酶的穩(wěn)定構(gòu)象，因而酶活性降低。綜上可見，甲苯體積分?jǐn)?shù)以2%為宜，雙相體系中酶活比水相中提高了1.29倍。

圖2 有機(jī)溶劑對(duì)酶活的影響Fig.2 Effect of organic solvents on the TSase activity

圖3 甲苯體積分?jǐn)?shù)對(duì)酶活的影響Fig.3 Effect of volume fractions of toluene on the TSase activity

2.3 反應(yīng)溫度和pH影響

在反應(yīng)條件為5 mmol L-絲氨酸和5 mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PLP 150μL，體積分?jǐn)?shù)2%甲苯，總反應(yīng)體積50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，pH 8.0，改變反應(yīng)溫度得到相對(duì)酶活曲線，結(jié)果見圖4，將測(cè)得的最高酶活設(shè)定為100%。由圖可見，純水體系在35℃反應(yīng)時(shí)，色氨酸合成酶酶活均較高，溫度過高或過低都使酶活下降。雙相體系在40℃反應(yīng)時(shí)，色氨酸合成酶酶活均較高，溫度過高或過低都使酶活下降，尤其在55℃ 時(shí)，酶活大幅度降低失活較嚴(yán)重。

有機(jī)介質(zhì)中的酶具有剛性結(jié)構(gòu)，能記住其存在過的水溶液的最適pH值，稱為“pH記憶”效應(yīng)，在雙相體系中，酶處于水相中，酶微環(huán)境pH值與水相pH值一致。水相pH值可以改變酶活性部位上有關(guān)基團(tuán)的解離狀態(tài)，從而影響酶與底物的結(jié)合，因此，酶促反應(yīng)需要在適宜的pH環(huán)境中進(jìn)行。本文中在反應(yīng)條件為5 mmol L-絲氨酸和5 mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PLP 150μL，體積分?jǐn)?shù)2%甲苯，總反應(yīng)體積50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，35℃下考察了水相pH對(duì)酶活的影響，結(jié)果見圖5，將測(cè)得的最高酶活設(shè)定為100%。由圖可見，過低的pH值可能會(huì)影響酶的分子構(gòu)象，使酶活偏低，當(dāng)pH=8時(shí)，雙相體系和純水體系，酶活均較高，故反應(yīng)水相pH=8為宜，雙相體系中酶活高于純水體系中酶活。

圖4 溫度對(duì)色氨酸合成酶酶活的影響Fig.4 Effect of tem perature on the enzymatic activity.

圖5 水相不同pH對(duì)色氨酸合成酶酶活的影響Fig.5 Effect of pH on the enzymatic activity

2.4 底物濃度對(duì)酶活影響

底物濃度會(huì)影響酶促反應(yīng)進(jìn)程，當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí)，酶活會(huì)隨著底物濃度升高而增加，當(dāng)?shù)孜餄舛冗^高時(shí)，又會(huì)產(chǎn)生底物抑制，不利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行。反應(yīng)條件為不同濃度L-絲氨酸和2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PLP 150μL，體積分?jǐn)?shù)2%甲苯，總反應(yīng)體積50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，35℃，pH 8.0下改變反應(yīng)體系底物濃度，測(cè)得酶活曲線見圖6，由圖可見，雙相體系和純水體系，底物濃度為150mmol/L時(shí)酶活最高，雙相體系中酶活高于純水體系中酶活。

圖6 底物濃度對(duì)色氨酸合成酶酶活的影響Fig.6 Effect of substrate concentrations on the enzyme activity

2.5 表面活性劑對(duì)酶活影響

反應(yīng)條件為7.5mmol L-絲氨酸和7.5mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%PLP 150μL，不同體積分?jǐn)?shù)表面活性劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1 mL甲苯，總反應(yīng)體積50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，pH 8.0，35℃，分別用不同濃度吐溫80、聚乙二醇辛基苯基醚（OP）、CTAB和Trion X-100處理菌體細(xì)胞，以不加表面活性劑的酶活設(shè)定為100%，測(cè)得酶活曲線，結(jié)果見圖7。由圖可見，經(jīng)Trion X-100處理后，酶活明顯高于其它兩者，因此用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的Trion X-100處理菌體細(xì)胞為宜。

圖7 表面活性劑對(duì)色氨酸合成酶酶活的影響Fig.7 Effect of surfactants on the enzyme activity

2.6 金屬離子對(duì)酶活影響

金屬離子可以和酶分子結(jié)合，改變酶的分子構(gòu)象，從而激活或抑制酶活力。在酶反應(yīng)（反應(yīng)條件為7.5 mmol L-絲氨酸和7.5 mmol 2-甲基吲哚，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 1%PLP 150μL，質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%Trion X-100，1 mL甲苯，不同金屬離子（10-4mol/L），總反應(yīng)體積 50 mL，0.1 g色氨酸合成酶菌體，pH 8.0，35℃）過程中添加不同的金屬離子，添加的離子包括Mg2+、Ca2+、Cu2+、Co2+和Zn2+，金屬離子終濃度為10-4mol/L，考察金屬離子對(duì)酶活的影響。由圖8可知，與空白對(duì)照相比，Ca2+對(duì)酶促反應(yīng)具有激活作用，所以在酶促反應(yīng)中添加10-4mol/L的鈣離子。

圖8 金屬離子對(duì)色氨酸合成酶酶活的影響Fig.8 Effect ofmetal ions on the enzyme activity

2.7 酶促反應(yīng)進(jìn)程

將0.1 g經(jīng)Trion X-100處理過的濕菌體加到50mL雙相反應(yīng)體系中，水相加入5mmol絲氨酸，有機(jī)相加入2-甲基吲哚6mmol，甲苯體積分?jǐn)?shù)為2%，10-4mol/L Ca2+，170 r/min震蕩條件下反應(yīng)；另以不加有機(jī)溶劑作為對(duì)照，定時(shí)取樣計(jì)算2-甲基-L-色氨酸的生產(chǎn)量。雙相反應(yīng)體系反應(yīng)5 h內(nèi)2-甲基-L-色氨酸的生成量不斷增加，5 h內(nèi)反應(yīng)基本完成，故酶促反應(yīng)5 h即可終止，2-甲基-L-色氨酸的質(zhì)量濃度為21.17 g/L。純水相體系反應(yīng)10 h內(nèi)2-甲基-L-色氨酸的生成量不斷增加，至10 h時(shí)酶促反應(yīng)基本完成，2-甲基-L-色氨酸的質(zhì)量濃度為20.29 g/L。

3 結(jié)語

在水/有機(jī)溶劑雙相中，以L-絲氨酸和2-甲基吲哚為底物，利用重組大腸桿菌DM206[pETDuettrpBA+trpA/BL21（DE3）]色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸，并優(yōu)化了其轉(zhuǎn)化條件。在最佳工藝條件下酶促反應(yīng)5 h，2-甲基-L-色氨酸的質(zhì)量濃度為21.17 g/L。通過增加水/有機(jī)溶劑雙相體系中2-甲基吲哚在酶反應(yīng)體系中溶解度，可提高酶反應(yīng)速度，縮短了反應(yīng)時(shí)間，提高了2-甲基-L-色氨酸產(chǎn)率，為酶法合成2-甲基-L-色氨酸提供了新思路。

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Enzymatic Synthesis of L-2-M ethyltryptophan Catalyzed by Tryptophan Synthase in a Water/Organic Solvent Biphase System

XU Lisheng1，2， GAO Guizhen1， CAOWengen1， ZHAO Liang1，ZHANG Xingtao1， JIAO Qincai2， CHEN Jun1， SONGMan1
（1.School of Biological and Food Engineering，Suzhou University，Suzhou 234000，China；2.State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology，School of Life Science，Nanjing University，Nanjing 210093，China）

L-2-methyltryptophan plays an important role in many physiological processes.This paper investigated the synthesisof L-2-methyltryptophan in an aqueous/organic biphasic system，and optimized the syntheticmethod.The optimal transformation conditionswere 150mmol/L L-serine，2%toluene，0.1mmol/L Ca2+，2%Trion X-100，40℃and pH 8，which resulted in a contentof over21.17 g/L for L-2-methyltryptophan.Thus，the strain can be used to produce L-2-methyltryptophan and hasan excellentconverting capability of L-2-methyltryptophan.

tryptophan synthase，L-2-methyltryptophan，L-serine，2-methylindole

Q 814

A

1673—1689（2017）05—0547—06

2015-06-02

安徽省高校自然科學(xué)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(KJ2017A440)；安徽省質(zhì)量工程項(xiàng)目(2015zjjh034、2015ckjh108、2016jyxm1038)；宿州區(qū)域發(fā)展協(xié)同創(chuàng)新中心(特色種植業(yè)方向)開放課題項(xiàng)目(2015SZXTZXKFYB01)。

徐禮生(1980—)，男，安徽安慶人，理學(xué)博士，副教授，主要從事微生物與生化藥學(xué)研究。E-mail:xulisheng111@163.com

徐禮生，高貴珍，曹穩(wěn)根，等.水/有機(jī)溶劑雙相體系中色氨酸合成酶酶法合成2-甲基-L-色氨酸[J].食品與生物技術(shù)學(xué)報(bào)，2017，36（05）：547-552.