陳金花，王 存，黃素榮，楊光穗

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點開放實驗室，海南 儋州 571737）

3株菌根真菌對海南鉆喙蘭幼苗生長的影響

陳金花，王 存，黃素榮，楊光穗

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶作物品種資源研究所/海南省熱帶觀賞植物種質(zhì)創(chuàng)新利用工程技術研究中心/農(nóng)業(yè)部華南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點開放實驗室，海南 儋州 571737）

為了解菌根真菌對海南鉆喙蘭（Rhynchostylis gigantea）無菌組培苗生長的影響，研究共生培養(yǎng)90 d后3株菌根真菌對組培苗的鮮重、根數(shù)、葉數(shù)、葉綠素、蛋白質(zhì)、核酸、光合特性等指標的影響。結(jié)果表明，菌根真菌W01和W02對植株的生長均有促進作用，其中W02顯著提高植株的鮮重增長量，W01顯著提高了植株可溶性糖、可溶性蛋白與核酸含量，S01對植株有致病性；海南鉆喙蘭的光合途徑含有CAM途徑，為兼性CAM植物，接種W01處理的植株其葉綠素a+b含量顯著高于對照，并提升了植株的光合能力。

菌根真菌；光合特性；海南鉆喙蘭

根據(jù)對碳源利用方式的不同，蘭科植物常被劃分為3種類型：光合營養(yǎng)型（Autotrophy，AT）、混合營養(yǎng)型（Mixotrophy，MX）和完全菌根異養(yǎng)型（Myco-hetero-trophy，MH）［1］。營養(yǎng)類型從自養(yǎng)到部分異養(yǎng)再到完全菌根異養(yǎng)的變化過程中，共生真菌的類群也從絲核菌逐漸變化成ECM菌（蠟殼耳目、紅菇科、革菌科和灰珊瑚科等）［2-3］。目前蘭科植物的營養(yǎng)策略研究越來越清晰，通過同位素追蹤技術證實，菌根真菌可為植株提供大量的碳水化合物。此外，菌根真菌為植物提供營養(yǎng)還有另外一種途徑即侵入植物細胞后被同化為植物生長發(fā)育的營養(yǎng)。研究顯示，菌根真菌能利用更多種碳源，并在人工培養(yǎng)下利用可溶性碳水化合物，如單糖、蔗糖、麥芽糖；有些真菌還能產(chǎn)生水解酶分解比較復雜的碳水化合物，如淀粉、腐殖酸、木糖、纖維素、木質(zhì)素、蛋白質(zhì)及分解產(chǎn)物。針對蘭科植物共生理論和應用學者們開展了許多研究，通過人為提供共生條件以提高蘭科植物組培苗的成活率［1］和生長速度，增強幼苗的抗性，增加生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)、維生素和激素類物質(zhì)等［4-9］，提高對無機離子的利用、增強蘭科植物的抗性和蘭科群落的生態(tài)功能［10］。可見，在蘭科植物的種苗繁育技術中加入菌根技術不但具有潛在的經(jīng)濟價值，還有巨大的生態(tài)價值［11］。

高等植物的碳同化途徑分為C3、C4和CAM 三大途徑，CAM途徑最早在景天科植物中發(fā)現(xiàn)，是CAM植物對干旱環(huán)境的一種生理生態(tài)適應，因植物夜間氣孔打開固定CO2的特殊性，一直被認為是碳同化途徑中的少數(shù)形式［12］。CAM植物包括專性CAM和兼性CAM類型，因基因類型、個體發(fā)育、環(huán)境條件等不同而表現(xiàn)出不同的代謝特點［13-14］。對兼性CAM植物來說，其光合碳同化途徑可在CAM和C3途徑中轉(zhuǎn)化，有的僅幾個小時即可完成［15］，如鐵皮石斛、萼脊蘭［16-17］。這種機制是植物利用其特色的光合途徑轉(zhuǎn)化以適應環(huán)境，有利于儲藏水分，減少蒸騰作用，提高水分利用率。研究顯示，蘭科植物形態(tài)與光合特性有一定的相關性，但是品種和環(huán)境因子也會對其光合特性造成影響。葉片肉質(zhì)厚的蘭花多表現(xiàn)為CAM途徑，如蝴蝶蘭、五唇蘭、美花石斛等［13，18-19］，而葉片薄的蘭花多表現(xiàn)為C3途徑，如春蘭、劍蘭、春劍、墨蘭、蕙蘭、玫瑰石斛、流蘇石斛［13，20］等。但是，在相同研究條件下報春石斛表現(xiàn)為CAM光合途徑，鼓槌石斛表現(xiàn)為C3光合途徑，金釵石斛表現(xiàn)為兼性CAM途徑［21］，而在其他研究中鼓槌石斛卻表現(xiàn)出兼性CAM植物的特性［13］。

海南鉆喙蘭（Rhynchostylis gigantea）又稱安諾蘭、狐尾蘭，是海南特有種，生長在約海拔1 000 m高的森林樹干上，為熱帶氣生蘭。海南鉆喙蘭葉片翠綠，花色秀麗有香氣，且其適應性強，易種植，又在春節(jié)開花，可作為新春賀歲花卉，深受人們喜愛。有關海南鉆喙蘭的研究報道不多，主要集中在資源調(diào)查、栽培技術、遺傳特性、圓球莖形態(tài)建成和基因克隆等方面［22-26］，在菌根學方面的研究還未見報道。本試驗以海南鉆喙蘭無菌組培苗為材料，接種從熱帶蘭植株上分離得到的3株菌根真菌，共生90 d后，以平均鮮重增長率、根數(shù)、葉數(shù)、核酸及蛋白質(zhì)含量、葉綠素含量為考察指標，以期篩選出能促進其生長發(fā)育的最佳菌株，為海南鉆喙蘭及其他蘭科植物的人工化栽培提供依據(jù)，為海南熱帶蘭光合特性的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選取具1～3條根、2～4片葉的海南鉆喙蘭無菌組培苗；菌根真菌分別為W01、W02、S01。

1.2 試驗方法

DE培養(yǎng)基的配制按照經(jīng)典配方進行配制［27］。接種真菌的準備：將3株菌根真菌在PDA培養(yǎng)基26℃暗培養(yǎng)7 d后，用直徑0.5 cm打孔器打孔備用。

組培苗菌根化：去除無菌組培苗根部的培養(yǎng)基和黃葉后，在電子天平上秤取鮮重，精確到0.0001 g，接種到培養(yǎng)基上，每瓶4株。培養(yǎng)7 d觀察無污染后接種菌根真菌。用接種針輕輕挑取菌餅接種到植株中間，每瓶接種1個菌餅，以不接菌株為對照。25（±2）℃、3 000 lx條件下培養(yǎng)90 d后，對組培苗進行鮮重增長率、根數(shù)與葉數(shù)、可溶性糖、淀粉、可溶性蛋白含量、核酸和葉綠素的測定，光照時間12 h/d，每個處理30株植株。

海南鉆喙蘭鮮重增長量：海南鉆喙蘭鮮重增長量=處理后鮮重-處理前鮮重。

用蒽酮比色法［28］測定海南鉆喙蘭組培苗葉片中可溶性糖含量；用考馬斯亮藍染色法［29］測定海南鉆喙蘭組培苗葉片中可溶性蛋白含量；用80%乙醇加高氯酸測定海南鉆喙蘭組培苗葉片中核酸含量，用丙酮法測定海南鉆喙蘭組培苗葉片中的葉綠素含量［30］。光合作用日變化測定：采用Li-6400便攜式光合測定儀，選擇頂葉下的第2片葉（功能葉）對其光合速率、氣孔導度、胞間CO2、蒸騰速率進行測定，每組處理選取具有代表性的植株2株，3次重復，在晴天上午8：00開始，每2 h測定1次。

1.3 統(tǒng)計分析

所測數(shù)據(jù)用Excel軟件進行初步處理，采用SAS 9.0軟件分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗鮮重和形態(tài)指標的影響

共生培養(yǎng)90 d后，發(fā)現(xiàn)3種真菌對海南鉆喙蘭組培苗的生長都有不同影響（圖1，封二）。其中菌根真菌W01、W02對植株無致病性，并對幼苗的生長有積極促進作用，植株生長旺盛，而菌根真菌S01對海南鉆喙蘭卻有明顯的致病性，植株變黃并逐漸腐爛死亡。方差分析結(jié)果顯示，菌根真菌W02對海南鉆喙蘭組培苗鮮重量達到顯著水平，為0.70 g。接種W01的處理，增長量為0.45 g，雖然比對照增長量高，但并未達到顯著水平（表1）。菌根真菌對植株根和葉片的影響不是很大，根的增加數(shù)和葉片增加數(shù)與對照之間均未達到顯著水平。

2.2 菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗可溶性糖、可溶性蛋白和核酸含量的影響

從表1可以看出，接種菌根真菌W01、W02的植株除可溶性蛋白含量外，可溶性糖含量與核酸含量均顯著高于對照，兩者之間達到顯著水平。接種W01的處理其可溶性糖含量、可溶性蛋白含量和核酸含量都最高，分別為1.3872、0.5135 mg/g和2.2244 μg/g，顯著高于對照。接種W02的處理，其可溶性糖含量和核酸含量也顯著高于對照，但可溶性蛋白含量卻顯著低于對照。

表1 菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗可溶性糖、可溶性蛋白和核酸含量的影響

2.3 菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗光合生理的影響

光合色素含量高低是植株光合能力大小的直接反映。在5%顯著水平下，菌株W01可顯著提高植株葉綠素a+b含量、達2.7052 mg/g，接種W02處理的葉綠素a+b含量為2.1624 mg/g，與對照間差異不顯著。

海南鉆喙蘭是兼性CAM植物。從圖2可以看出，海南鉆喙蘭組培苗的凈光合速率均較低，其光合能力也較弱。接種菌根真菌后，植株的光合能力明顯提高，以接種W01菌株的植株光合能力最強，其次是接種W02的植株。接菌處理除了提高植株光合能力外，對凈光合速率的日變化趨勢有一定影響。由圖2、圖3可知，凈

圖2 接菌對海南鉆喙蘭組培苗凈光合速率日變化的影響

圖3 接菌對海南鉆喙蘭組培苗氣孔導度的影響

光合速率和氣孔導度第1個高峰出現(xiàn)在6：00，此時接種W01處理的植株凈光合速率達2.5732 μmol/m2·s，接種W02植株和對照的凈光合速率分別為-0.6785、-0.1770 μmol/m2·s。6：00后，凈光合速率下降后又回升，第2個高峰出現(xiàn)的時間不同，但都在16：00后。8：00組培室開燈后，由于光強抑制，植株的氣孔關閉，凈光合速率為負值。說明海南鉆喙蘭的光合途徑應具有C3和屬景天酸代謝兩種途徑。氣孔導度在上午10：00達到最低，氣孔的關閉阻礙了蒸騰，蒸騰速率也達到最低。胞間CO2濃度經(jīng)過一段時間的積累，14：00達到最大，為5 454.8129 μg/g，胞間有大量的CO2積累（圖4）。16：00以后，氣孔導度逐漸增大，到18：00時達到最高，氣孔打開，胞間CO2濃度急劇降低，蒸騰速度也增高（圖5）。

圖4 接菌對海南鉆喙蘭組培苗胞間CO2濃度的影響

4 結(jié)論與討論

4.1 菌根真菌的專一性

圖5 接菌對海南鉆喙蘭組培苗蒸騰速率的影響

關于蘭科菌根真菌專一性問題學術界經(jīng)過了長期激烈的爭論。目前公認專一性分為生態(tài)專一性和潛在專一性，真菌與蘭科植物在自然條件和實驗室條件下表現(xiàn)出不同的專一性：在自然條件下表現(xiàn)的專一性較高，而在實驗室條件下專一性卻不是特別嚴格［31］。已有研究證實，鐵皮石斛幼苗在接種其他蘭科植物的菌株后，生長旺盛，平均鮮重增長率均顯著高于對照，對其生長有明顯的促進作用［32-33］。

本試驗中，W01、W02兩種菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗的生長有積極的促進作用，而菌根真菌S01對海南鉆喙蘭組培苗有明顯的致病性。其中菌根真菌W01分離自野生五唇蘭，菌根真菌W02分離自黃花美冠蘭，而S01分離自密花石斛，可見W01、W02與海南鉆喙蘭組培苗并未表現(xiàn)出高度的專一性。在墨蘭菌根真菌的研究中也顯示，并非所有的根菌真菌都能促進無菌的組培苗生長［34］。楊友聯(lián)等［35］也得出相同結(jié)論：將獨蒜蘭的6株菌根真菌接種到環(huán)草石斛組培苗上發(fā)現(xiàn)，6株菌根真菌都能與環(huán)草石斛形成菌根結(jié)構，無嚴格的專一性；但僅有4株菌株能促進環(huán)草石斛的生長。

4.2 菌根真菌對海南鉆喙蘭生長的影響

據(jù)報道，部分蘭科菌根真菌能不同程度地產(chǎn)生一種或幾種植物激素或維生素促進植物生長，而不同激素在植物生長發(fā)育中的作用機制不同，這可能是不同菌株處理苗在增重率和根數(shù)、葉數(shù)增長等指標上存在差異的原因［36-37］，當然菌根真菌對宿主細胞的侵染與菌根真菌的生理活性也有關［38］。本試驗中，接種菌根真菌W01、W02可提高海南鉆喙蘭的的鮮重，但對根數(shù)、葉數(shù)與對照組相比沒有明顯差別，這可能是菌株本身的原因，也可能是培養(yǎng)時間太短的原因。除可溶性蛋白含量外，菌根真菌均顯著提高了植株的可溶性糖和核酸含量，其中菌根真菌W01比菌根真菌W02作用效果更好，這與光合色素和光合速率的提高結(jié)果是一致的。對金釵石斛無菌苗的研究表明，4種內(nèi)生真菌對金釵石斛的影響各不相同，有的抑制金釵石斛生長，有的促進生長，但促進的程度和能力也有差別［39］。

4.3 菌根真菌對海南鉆喙蘭組培苗光合生理的作用

葉綠素是植物光合作用的基礎色素，植物通過葉綠素對光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化來進行光合作用，葉綠素含量的高低也反映了植物光合能力強弱。研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)生真菌可提高蘭科植物的葉綠素含量，從而增強植物的光合作用，促進植物生長［40-43］。本研究中，接種W01、W02都可提高植株葉綠素含量，其中接種W01植株的葉綠素a+b含量達顯著水平，光合速率的提高也很明顯，該結(jié)論在五唇蘭、鐵皮石斛的研究上也得到了證實。李洪立等［44］將分離自野生五唇蘭根部的菌根真菌接種到五唇蘭無菌組培苗，發(fā)現(xiàn)光合能力也得到顯著提高。在鐵皮石斛的研究中，不僅證實了菌根真菌S01和S02能顯著增強組培苗的光合能力，還通過同位素追蹤技術觀察到均根真菌侵染植株的過程［41］。有研究者還分析了添加硝酸鑭后接種OM真菌對鐵皮石斛幼苗葉綠素含量的影響，結(jié)果顯示添加一定濃度的硝酸鑭可顯著增強OM真菌對葉綠素含量的促進作用［43］。在蘭科植物與菌根真菌的共生研究中，通過添加稀土元素來提高微生物的生物活性，從而提高菌根真菌對植物生理生長特性的促進作用，將是未來研究的方向之一。

海南鉆喙蘭同時具有C3光合途徑和CAM途徑，是兼性CAM植物。在蘭科植物中，這樣的植物也有許多，如華石斛、五唇蘭、香莢蘭、萼脊蘭等［25，27-29，45］，除蘭科植物外，景天科、番杏科、鳳梨科植物中也有此類特性［46-48］。這與海南鉆喙蘭自身的特性相關，是其響應環(huán)境的機制之一。

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（責任編輯 白雪娜）

Effects of three kinds of mycorrhizal fungi on growth of Rhynchostylis gigantea seedling

CHEN Jin-hua，WANG Cun，HUANG Su-rong，YANG Guang-sui
（Tropicl Crops Genetic Resoures Institute，Chinese Academy of Tropical Agricultural Sciences/ The Engineering Technology Research Center of Tropical Ornamental Plant Germplasm Innovation and Utilization，Hainanprovince/Key laboratory of Corp Gene Resources and Germplasm Enhancement in Southern China，Danzhou 571737，China）

In order to study the effects of three kinds of mycorrhizal fungi on growth ofRhynchostylis giganteaseedling，we analyzed the morphological index，nutrient content and photosynthetic capacity after inculating for 90 d. Results showed that，compared with the control group，mycorrhizal fungi increased the fresh weitht；W01 and W02 had promoting effect on the growth of plants，W02 significantly increased plant fresh weight；W01 significantly increased the soluble sugar，soluble protein and nucleic acid content. S01 had pathogenicity toR. giganteaseedling. Photosynthetic pathway ofR. giganteanwas Crassulacean acid metabolism. The chlorophyll a+b content of plant inoculated W01 was significantly higher than that of control. W01 enhanced the photosynthetic rate of seedling.

mycorrhizal fungi；photosynthetic characteristics；Rhynchostylis gigantean

S682.31

A

1004-874X（2017）04-0046-07

陳金花，王存，黃素榮，等. 3株菌根真菌對海南鉆喙蘭幼苗生長的影響［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學，2017，44（4）：46-52.

2017-02-13

海南省自然科學基金（20153114）；中央級公益性科技研院所基本科研業(yè)務費專項（1630032 014027）；農(nóng)業(yè)公益性行業(yè)科研專項（201203071）

陳金花（1982-），女，碩士，助理研究員，E-mail：13976076546@163.com

楊光穗（1972-），女，碩士，副研究員，E-mail：602590140@qq.com