郭慧慧，宋慧，李婷，王淑媛，衛(wèi)佳麗

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.吉大白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，吉林長(zhǎng)春130118）

雙歧桿菌對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響

郭慧慧1，宋慧2，李婷2，王淑媛1，衛(wèi)佳麗1

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院；2.吉大白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠，吉林長(zhǎng)春130118）

本文探討雙歧桿菌M IMBb75對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎小鼠腸損傷及腸道菌群的影響。試驗(yàn)采用葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎，隨機(jī)分成7組：正常對(duì)照組、模型組、MRS-L培養(yǎng)基陰性對(duì)照組、美沙拉嗪陽(yáng)性對(duì)照組、M IMBb75高劑量組、M IMBb75中劑量組及M IMBb75低劑量組，給藥7天后處死小鼠，進(jìn)行結(jié)腸長(zhǎng)度、血中血紅蛋白濃度及腸道菌群檢測(cè)。結(jié)果顯示：雙歧桿菌能夠有效抑制潰瘍性結(jié)腸炎引起的小鼠血中血紅蛋白濃度的下降，可以抑制潰瘍性結(jié)腸炎引起的結(jié)腸長(zhǎng)度的縮短；可以增加腸道菌群多樣性，提高擬桿菌屬及柔嫩梭菌的數(shù)量。說明雙歧桿菌通過調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)失調(diào)，對(duì)潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)揮治療作用。

雙歧桿菌M IMBb75；結(jié)腸炎；結(jié)腸損傷；DGGE；腸道菌群

潰瘍性結(jié)腸炎（ul c e r a t i v e c o l i t is，U C）是一種無地域差異、無種族差異的人群多發(fā)性腸道炎癥疾病，主要表現(xiàn)在結(jié)腸、直腸的粘膜和粘膜下層受損引發(fā)炎癥[1]。U C的臨床表現(xiàn)主要以腹痛、腹瀉、粘液膿血便以及不同程度的全身癥狀[2]，其病因尚不明確，目前認(rèn)為，U C的發(fā)病可能與腸腔內(nèi)部抗原誘導(dǎo)免疫反應(yīng)過度激活相關(guān)[3]。隨著微生態(tài)學(xué)的發(fā)展，腸道微環(huán)境作為一個(gè)復(fù)雜的微生態(tài)系統(tǒng)與U C的發(fā)病有著緊密的聯(lián)系。研究發(fā)現(xiàn)，U C患者腸道菌群失調(diào)，致病菌和條件致病菌增多，導(dǎo)致腸道粘膜通透性增加，而細(xì)菌代謝產(chǎn)物向粘膜固有層移位，引起免疫細(xì)胞的激活，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[4]。一系列研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍性結(jié)腸炎患者體內(nèi)雙歧桿菌及乳酸菌等有益菌數(shù)量下降，大腸桿菌腸球菌等有害菌數(shù)量增多，提示腸道菌群可能參與潰瘍性結(jié)腸炎的發(fā)生與發(fā)展。雙歧桿菌是近年來被認(rèn)可的益生菌，具有增強(qiáng)免疫力、抗衰老、抗腫瘤等生理功能，尤其是對(duì)腸道菌的平衡有很好的作用。本試驗(yàn)旨在研究雙歧桿菌對(duì)U C小鼠結(jié)腸損傷及腸道菌群的影響。

1 材料

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

清潔級(jí)昆明小鼠64只，體重18～22克，雌雄對(duì)半。來源：吉林大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室。昆明鼠在理科樓分子病學(xué)研究室進(jìn)行為期7天的適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2 藥品

美沙拉嗪腸溶片購(gòu)于葵花藥業(yè)有限公司；雙歧桿菌（M I M Bb75）由吉大藥廠饋贈(zèng)，調(diào)節(jié)為108C FU/m L，107C FU/m L，106C FU/m L三個(gè)不同的濃度。

1.3 主要試劑

文-齊氏液（H i C N化高鐵血紅蛋白轉(zhuǎn)化液）購(gòu)于上海榕柏生物技術(shù)有限公司；葡聚糖硫酸鈉（D SS，分子量36000～50000），購(gòu)自美國(guó)M P B io m e d i c a l s公司。

1.4 主要儀器

低速離心機(jī)，購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；立式壓力蒸汽滅菌器，購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械有限公司；水浴鍋，購(gòu)自上海貝凱生物化工設(shè)備有限公司；P C R儀，購(gòu)自T he r m o S C I E N T IF I C；電泳儀，購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；D GG E電泳儀，購(gòu)自北京君意東方電泳設(shè)備有限公司；凝膠成像儀，購(gòu)自上海器仁儀器儀表有限公司。

2 方法

2.1 試驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥

63只清潔級(jí)昆明小鼠隨機(jī)分為7組，每組9只。分別為空白組、D SS模型組、M R S-L培養(yǎng)基陰性對(duì)照組、美沙拉嗪陽(yáng)性對(duì)照組、雙歧桿菌高劑量組、雙歧桿菌中劑量組及雙歧桿菌低劑量組。各組小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7天，空腹處理4小時(shí)，除空白組外，其余各組自由飲用3%葡聚糖硫酸鈉（D SS）且分別灌胃0.4m L M R S-L培養(yǎng)基，美沙拉嗪以及不同濃度的M I M Bb75培養(yǎng)液。

2.2 結(jié)腸損傷相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)

結(jié)腸長(zhǎng)度測(cè)定∶取整段結(jié)腸，量取長(zhǎng)度并記錄；血紅蛋白測(cè)定：文-齊氏液檢測(cè)各小鼠血中血紅蛋白濃度，具體操作依照說明書進(jìn)行。

2.3 腸道菌群檢測(cè)

樣品預(yù)處理：從-80℃冰箱中取出腸道菌群檢測(cè)樣品，將樣品置于-20℃冰箱中1小時(shí)，再在冰盒上解凍20分鐘。滅菌的2亳升離心管除皮稱重，挑取0.2克左右混合物于離心管中，采用酚／氯仿／異戊醇法提取進(jìn)行腸道內(nèi)容物腸道菌DN A提取。P C R-D GG E檢測(cè)腸道菌群多樣性，取D GG E圖譜的共性條帶及特異性條帶進(jìn)行克隆測(cè)序，具體方法參照曾巧莉等人研究結(jié)果[5]。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用s p ss23.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，采用F檢驗(yàn)對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行差異性分析，用P＜0.05表示差異顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 各組小鼠結(jié)腸損傷相關(guān)指標(biāo)測(cè)定

飲用D SS以后，與對(duì)照組相比，模型組與M R S-L陰性對(duì)照組小鼠血中血紅蛋白濃度及結(jié)腸長(zhǎng)度發(fā)生明顯改變，血紅蛋白濃度下降，結(jié)腸長(zhǎng)度縮短，與空白組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明模型組小鼠結(jié)腸炎相關(guān)指標(biāo)發(fā)生改變，并且M R S-L對(duì)D SS引起的結(jié)腸損傷無明顯的改善作用，見表1。與模型組相比，美沙拉嗪陽(yáng)性對(duì)照組及雙歧桿菌（M I M Bb75）各處理組血紅蛋白濃度及結(jié)腸長(zhǎng)度發(fā)生改變，血紅蛋白濃度升高，結(jié)腸長(zhǎng)度增加，與模型組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），說明雙歧桿菌（M I M Bb75）對(duì)D SS引起的結(jié)腸損傷具有一定的抑制作用，見表1。

3.2 MIMBb75對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的影響

3.2.1 M IMBb75對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群多樣性的影響將P C R-D GG E圖譜（圖1）各組的條帶數(shù)進(jìn)行分析（表2），與空白組相比，M I M Bb75高劑量組及中劑量組DN A條帶數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；與D SS模型組相比M I M Bb75高劑量組、中劑量組、低劑量組及美沙拉嗪組DN A條帶數(shù)均顯著升高（P＜0.05）；而與D SS對(duì)照組相比，M R S處理組DN A條帶數(shù)無顯著差異。

表1 各組小鼠血紅蛋白濃度和結(jié)腸長(zhǎng)度檢測(cè)結(jié)果

表2 M IMBb75對(duì)小鼠腸道菌群條帶數(shù)的影響

圖1 不同處理組腸道內(nèi)容物DGGE圖譜1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養(yǎng)基對(duì)照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18DSS；19～21Mesalazine

圖內(nèi)數(shù)字為條帶編號(hào)，N u m b e r s in t he p r o f l ies is ge l b an d n u m b e r.

3.2.2 M IMBb75對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群相似性的影響

由圖2可看出，M I M Bb75中劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為49.8%，M I M Bb75低劑量組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為45%，美沙拉嗪對(duì)照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為33.9%，M R S對(duì)照組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為41%，D SS模型組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為39%，空白組與M I M Bb75高劑量組相似性系數(shù)為39.4%，由結(jié)果可以看出，M I M Bb75不同劑量組間的相似性均高于與空白組、美沙拉嗪組及D SS模型組的相似性。

圖2 不同處理組小鼠PCR-DGGE圖譜條帶的聚類分析圖1～3空白組1-3 Control group；4～6 MRS培養(yǎng)基對(duì)照組；4-6 MRS group；7～9M IMBb75∶1×108cfu/m l；10～12 M IMBb75∶1× 107cfu/m l；13～15 M IMBb75∶1×106cfu/m l；16～18 DSS；19～21Mesalazine

3.2.3 M IMBb75對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠腸道微生物種類的影響

表3可見，由于擴(kuò)增出細(xì)菌的16S rDN A的V3區(qū)片段大小為200b p，而克隆僅能測(cè)出170b p左右。本實(shí)驗(yàn)并未檢測(cè)出乳酸桿菌、雙歧桿菌和大腸桿菌等優(yōu)勢(shì)菌群，主要以擬桿菌屬、柔嫩梭菌屬、多形桿菌為主，對(duì)比結(jié)果顯示，1、6、12、14和16作為共性條帶，分別為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、多形桿菌B a ct e r oi d es、檸檬酸桿菌[C i tr o b a ct e r]，M I M Bb75處理組特異性條帶為4、5、7、8、9、10、11、13、15、16、17、19和20，主要為擬桿菌屬B a r nesie ll a in t es t iniho m inis、柔嫩梭菌[C l os tr i d u m]l e p t u m s tr ain及乳酸發(fā)酵梭菌[C l o tr i d i u m] p o l y sa cc ha r o l y t i c u m s tr ain，可以看出柔嫩梭菌及乳酸發(fā)酵梭菌在各組都存在，且在M I M Bb75處理組更具優(yōu)勢(shì)。

表3 DGGE圖譜中條帶的基因片段序列對(duì)比

4 結(jié)論與討論

潰瘍性結(jié)腸炎（U C）的發(fā)病機(jī)制目前尚不清楚。近年來，隨著遺傳學(xué)、免疫學(xué)以及分子生物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展，人們對(duì)U C的認(rèn)識(shí)不斷深入[6]。已有研究證明，U C的發(fā)病與環(huán)境因素、遺傳因素、免疫因素以及腸道微生物密切相關(guān)。目前認(rèn)為，腸道微生物屏障與機(jī)體的相互作用可能是U C發(fā)生的重要原因之一[7]。據(jù)報(bào)道顯示，益生菌通過抑制N F-k B信號(hào)通路發(fā)揮抗?jié)冃越Y(jié)腸炎的作用[8]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，M I M Bb75高劑量組、中劑量組與低劑量組DN A條帶數(shù)顯著升高且M I M Bb75高劑量組與M I M Bb75中劑量組、低劑量組的相似性均較與空白組、M R S培養(yǎng)基陰性對(duì)照組、美沙拉嗪組及D SS組相似性高，說明M I M Bb75各劑量組對(duì)小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)有著相似的調(diào)節(jié)作用。分析可能的原因：雙歧桿菌是益生菌，能夠參與短鏈脂肪酸的合成，從而增強(qiáng)上皮細(xì)胞的屏障功能，阻止致病性的大腸桿菌入侵。張玲等研究發(fā)現(xiàn)，雙歧桿菌三聯(lián)活菌能有效抑制腸道內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)[9]。徐俊燕等研究發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪聯(lián)合雙歧桿菌四聯(lián)活菌能明顯改善U C的臨床癥狀，促進(jìn)腸粘膜的愈合[10]。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推測(cè)，M I M Bb75可以與腸道內(nèi)原有的宿主微生物競(jìng)爭(zhēng)，抑制有害菌生長(zhǎng)，促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，增加小鼠腸道微生物多樣性。

研究發(fā)現(xiàn)，益生菌能給上皮細(xì)胞（I E C s）提供重要的能源物質(zhì)，同時(shí)共生菌的代謝產(chǎn)物也促進(jìn)I E C s平衡。微生物能夠介導(dǎo)膳食纖維及糖類物質(zhì)的加工產(chǎn)生短鏈脂肪酸，如乙酸、丙酸和丁酸，而丁酸信號(hào)通過G蛋白偶聯(lián)手提(G P R)109A誘導(dǎo)I E C I L-18的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸炎相關(guān)性結(jié)腸癌（C A C）[11]。其他相關(guān)研究證明雙歧桿菌能有衍生乙酸增強(qiáng)腸道上皮細(xì)胞抗凋亡反應(yīng)，對(duì)腸道損傷發(fā)揮保護(hù)作用[12]。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，M I M Bb75處理組出現(xiàn)了特異性的柔嫩梭菌、乳酸發(fā)酵梭菌及檸檬酸桿菌等，降低腸道p H值，抑制病原微生物的入侵。由此可見，本試驗(yàn)小鼠結(jié)腸阻止損傷結(jié)果顯示：M I M Bb75各劑量組小鼠血中血紅蛋白濃度升高，結(jié)腸長(zhǎng)度增加，結(jié)腸損傷有所改善，這可能與M I M Bb75添加衍生乙酸，降低腸道p H值，營(yíng)造腸道酸性環(huán)境，抑制有害菌的生長(zhǎng)有關(guān)。徐敏等研究發(fā)現(xiàn)益生菌可能通過抑制N F-k B信號(hào)通路降低小鼠集體腸道炎癥，改善結(jié)腸炎小鼠的病理學(xué)損傷。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果初步推斷，M I M Bb75能夠通過營(yíng)造有益的腸道微環(huán)境降低腸道p H值，從而有利于腸道有益菌的定制，減少腸道有害菌，改善腸道菌微生態(tài)分布，從而抑制結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸損傷。

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R574.62

A

10.14025/j.cnki.jlny.2017.13.016

郭慧慧，在讀碩士研究生，研究方向：微生物資源開發(fā)與利用。

宋慧，博士，教授，研究方向：生物大分子結(jié)構(gòu)與功能。

項(xiàng)目名稱：M IMBb75菌株動(dòng)物學(xué)試驗(yàn)研究；標(biāo)注：橫向聯(lián)合項(xiàng)目，與吉林大學(xué)白求恩醫(yī)科大學(xué)制藥廠