孫兆遠(yuǎn)，翟瑋瑋，張麗芳，曹陽(yáng)

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

紅椒根際促生菌液體發(fā)酵條件研究

孫兆遠(yuǎn)，翟瑋瑋*，張麗芳，曹陽(yáng)

（江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安223003）

為了合理開(kāi)發(fā)利用PGPR生物菌肥，以600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD600）和IAA產(chǎn)量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)紅椒根際促生細(xì)菌（PGPR）的發(fā)酵條件進(jìn)行研究，探討了碳源、氮源、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、溶液pH值和裝液量等因素對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響，并通過(guò)正交試驗(yàn)對(duì)發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果表明：最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時(shí)間60 h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50 mL；各因素對(duì)IAA產(chǎn)量的影響順序?yàn)檠b液量＞培養(yǎng)時(shí)間＞溶液pH值＞培養(yǎng)溫度。

辣椒；根際細(xì)菌；液態(tài)發(fā)酵；吲哚乙酸

植物根際促生細(xì)菌（plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根際的一類可促進(jìn)植物生長(zhǎng)、提高作物產(chǎn)量、防治病害的有益菌類[1]。PGPR能夠通過(guò)解磷、自生固氮和螯合Fe3+等方法給植物提供更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以達(dá)到促進(jìn)植物根系生長(zhǎng)，改變根系形態(tài)，增加根毛度、根毛數(shù)、側(cè)根數(shù)、根重量和根表面積的作用[2]；還可以分泌IAA等植物激素，提升細(xì)胞壁的疏松度和可塑性，促進(jìn)RNA和蛋白質(zhì)的合成，溶解細(xì)胞壁糖，改變細(xì)胞內(nèi)環(huán)境，進(jìn)而起到促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)，增加細(xì)胞體積和質(zhì)量的作用[3，4]。

早在1953年我國(guó)生物學(xué)家就從陜西徑陽(yáng)縣老苜蓿根系土壤中分離出“5406”P(pán)GPR菌株（細(xì)黃鏈霉菌乳糖變種），經(jīng)誘變處理制成生物菌肥，該菌肥具有防病保苗、促進(jìn)生長(zhǎng)、肥地松土的作用[5]。但由于當(dāng)時(shí)發(fā)酵設(shè)備和技術(shù)較為落后，所產(chǎn)生物菌肥肥效穩(wěn)定性差，特效菌株繁殖性能弱，雜菌污染嚴(yán)重，因此，大大限制了該生物菌肥的大規(guī)模應(yīng)用[6]。近年來(lái)，發(fā)酵設(shè)備和發(fā)酵工藝的快速發(fā)展，為規(guī)模化生產(chǎn)PGPR生物菌肥提供了物質(zhì)和技術(shù)支撐[7]。

PGPR生物菌肥的促生防病效果，不僅取決于菌株本身，而且還取決于外界條件，如培養(yǎng)基成分和培養(yǎng)條件等[8]。為此，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)PGPR菌株液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，得到其最適的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件，以期為合理開(kāi)發(fā)利用PGPR生物菌肥提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅椒根際PGPR，分離自淮安紅椒根際。由江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室分離、篩選、鑒定和保存。

種子培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.2，121℃滅菌20 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液：L-色氨酸100 mg，（NH4）2SO42 g，NaH2PO40.50 g，K2HPO40.50 g，MgSO40.20 g，CaCl20.10 g，蒸餾水1 000 mL。

試劑：3-IAA標(biāo)準(zhǔn)品為Sigma公司產(chǎn)品，其余化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液制備將斜面保存的紅椒根際PGPR菌株接種到種子培養(yǎng)基中，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60 h，制成活菌含量＞108CFU/mL的種子液[9]。

1.2.2 碳源和氮源的選擇

1.2.2.1 碳源的選擇。分別向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1%（W/V）的葡萄糖、木糖、蔗糖、果糖、甘露醇、乳糖，配制成不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)液。裝入250 mL三角瓶中，裝液量100 mL/瓶，滅菌后加入5%（V/V）的種子液，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)60 h，比較不同碳源對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳碳源種類。

1.2.2.2 氮源的選擇。分別向基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)液中加入1%（W/V）的蛋白胨、酵母粉、硝酸鉀、谷氨酸、硫酸銨、硝酸銨，配制成不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)液。按照“1.2.2.1”所述方法培養(yǎng)，比較不同氮源對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源種類。

1.2.3 發(fā)酵條件的選擇與優(yōu)化

1.2.3.1 培養(yǎng)時(shí)間的選擇。應(yīng)用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調(diào)節(jié)至7，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度30℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中分別培養(yǎng)12、24、36、48、60、72和84 h，比較不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.2 培養(yǎng)溫度的選擇。應(yīng)用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調(diào)節(jié)至7，按照“1.2.2.1”所述方法接種，分別在溫度20、25、30、35、40和45℃，轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同培養(yǎng)溫度對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.3 pH值的選擇。應(yīng)用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值分別調(diào)節(jié)至4、5、6、7、8、9和10，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同pH值對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.4 裝液量的選擇。應(yīng)用優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)液，用磷酸將pH值調(diào)節(jié)至6，分別取25、50、75、100和150 mL裝入三角瓶中，按照“1.2.2.1”所述方法接種，在溫度35℃、轉(zhuǎn)速150 r/min的恒溫振蕩箱中培養(yǎng)48 h，比較不同裝液量對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)狀況和IAA產(chǎn)量的影響。

1.2.3.5 最佳發(fā)酵條件的優(yōu)化。采用L9（43）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)（表1），考察培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、培養(yǎng)液pH值和裝液量對(duì)IAA產(chǎn)量的影響，確定PGPR菌株的最佳發(fā)酵條件。

表1 L9（43）正交試驗(yàn)的因素及其水平Table 1 Factors and levels in orthogonal array design

1.2.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.4.1 PGPR菌株生長(zhǎng)狀況。用600 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD600）表示。取發(fā)酵后的菌懸液10 mL，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后，在600 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[10]。

1.2.4.2 IAA產(chǎn)量。采用Salkowski比色法測(cè)定。將菌懸液10 000 r/min離心10 min，取上清液，加入等體積的Salkowski比色液，避光靜置30 min，取出后立即在530 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度[11]。根據(jù)IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線（采用3-IAA標(biāo)準(zhǔn)品繪制），計(jì)算IAA產(chǎn)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果（圖1）顯示，6種碳源均對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，其中，葡萄糖、蔗糖和甘露醇的效果較為明顯；果糖和乳糖對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)有一定的作用；而木糖對(duì)OD600影響很小。說(shuō)明PGPR對(duì)葡萄糖、蔗糖和甘露醇的吸收利用效果較好，但基本不吸收木糖。

從IAA產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果看，蔗糖可以大幅提高IAA產(chǎn)量，其次是甘露醇和果糖，木糖的效果仍然不明顯。值得注意的是，葡萄糖并沒(méi)有大幅度提升IAA產(chǎn)量，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊钠咸烟窃诜磻?yīng)終止時(shí)仍會(huì)大量殘留，而殘留的葡萄糖則與IAA形成無(wú)活性的糖基-IAA復(fù)合體，降低了游離態(tài)IAA的產(chǎn)量[3]。

綜合分析不同碳源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳碳源為蔗糖。

圖1 不同碳源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of carbon sources on grow th of PGPR and IAA concentration

2.2 氮源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果（圖2）顯示，蛋白胨和酵母粉2種有機(jī)氮源對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量均有明顯的促進(jìn)作用；硝酸鉀能夠顯著提高IAA產(chǎn)量，但對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)影響甚微；谷氨酸和硫酸銨對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)增效不顯著，但硫酸銨明顯提高了IAA產(chǎn)量，而谷氨酸對(duì)IAA產(chǎn)量作用不大；硝酸銨能較大幅度地提高IAA產(chǎn)量，但卻阻礙了PGPR菌體生長(zhǎng)。

綜合分析不同氮源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳氮源為酵母粉。

圖2 不同氮源種類對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of nitrogen source on grow th of PGPR and IAA concentration

2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果（圖3）顯示，在0～24 h內(nèi)，PGPR菌株快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期；24 h后逐漸進(jìn)入穩(wěn)定期，并在48 h后達(dá)到最高點(diǎn)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)60 h時(shí)OD600略有下降，說(shuō)明PGPR細(xì)菌開(kāi)始死亡。

從產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果看，在12～24 h內(nèi)，有少量IAA產(chǎn)生，且IAA產(chǎn)量變化不大；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)24 h后，IAA產(chǎn)量快速提高，這主要是因?yàn)镮AA是PGPR的次級(jí)代謝產(chǎn)物，只有在PGPR成熟穩(wěn)定后才能大量產(chǎn)生并積累；當(dāng)發(fā)酵時(shí)間超過(guò)60 h后，IAA產(chǎn)量略有下降，這主要是因?yàn)榧?xì)胞死亡導(dǎo)致的次生代謝產(chǎn)物降低和IAA降解酶將IAA分解[12]。

綜合分析不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響，確定最佳培養(yǎng)時(shí)間為60 h。

圖3 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of fermentation time on grow th of PGPR and IAA concentration

2.4 培養(yǎng)溫度對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

測(cè)定結(jié)果（圖4）顯示，隨著溫度的升高，OD600和IAA產(chǎn)量均呈先快速增加后快速降低的變化趨勢(shì)，且指標(biāo)值均在培養(yǎng)溫度為35℃時(shí)達(dá)到最大。說(shuō)明PGPR菌株生長(zhǎng)的最適溫度為35℃，且在此條件下，菌株次級(jí)代謝產(chǎn)物IAA產(chǎn)量最高。

圖4 不同培養(yǎng)溫度對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of tem perature on grow th of PGPR and IAA concentration

2.5 pH值對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果（圖5）顯示，pH值為4和10時(shí)，PGPR菌體均不生長(zhǎng)，也不產(chǎn)生IAA，這是因?yàn)镻GPR為中性微生物，在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿環(huán)境下均不能生長(zhǎng)；當(dāng)pH值為5～9時(shí)，PGPR菌體均能較好地生長(zhǎng)，說(shuō)明PGPR生長(zhǎng)具有較寬的pH值適應(yīng)范圍，但是pH值＞6后IAA產(chǎn)量有所降低，說(shuō)明PGPR積累IAA的最適pH值為6左右。

圖5 發(fā)酵培養(yǎng)液不同pH值對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of pH of solutions on grow th of PGPR and IAA concentration

2.6 裝液量對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響

菌株生長(zhǎng)測(cè)定結(jié)果（圖6）顯示，裝液量為25 mL時(shí)，三角瓶中的氧氣最為充足，但PGPR菌株生長(zhǎng)量和IAA產(chǎn)量并不是最大，說(shuō)明過(guò)多的氧氣并不適合PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA的產(chǎn)生，這可能是因?yàn)楦邼舛鹊难鯕鈺?huì)對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，影響了菌體的分裂和次生產(chǎn)物的代謝；裝液量為50 mL時(shí)，PGPR菌株生長(zhǎng)量和IAA產(chǎn)量均為最大；當(dāng)裝液量＞50 mL后，隨著裝液量的增加，PGPR菌株生長(zhǎng)量和IAA產(chǎn)量均逐漸降低，這是因?yàn)檠b液量增加，PGPR細(xì)菌數(shù)量增加，三角瓶中相對(duì)溶解氧氣的數(shù)量就會(huì)減少，菌體生長(zhǎng)變慢，IAA產(chǎn)量下降。這也說(shuō)明PGPR為嚴(yán)格好氧菌，IAA的合成是好氧代謝，培養(yǎng)基中溶氧量的減少將會(huì)影響菌株的生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量[13]。

圖6 不同裝液量對(duì)PGPR菌株生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of quantity of sam ples on grow th of PGPR and IAA concentration

2.7 最佳發(fā)酵條件的確定

極差分析結(jié)果（表2）顯示，試驗(yàn)因素對(duì)PGPR菌株發(fā)酵效果的影響順序?yàn)镈＞A＞C＞B。說(shuō)明裝液量對(duì)PGPR菌株發(fā)酵效果影響最大，培養(yǎng)時(shí)間次之，培養(yǎng)溫度的影響最小。

從各水平對(duì)應(yīng)的k值可以看出，最佳發(fā)酵條件為A2B2C2D2，即：培養(yǎng)時(shí)間60 h，培養(yǎng)溫度35℃，發(fā)酵液pH值6，裝液量50 mL。

表2 正交試驗(yàn)的IAA產(chǎn)量Table 2 IAA concentration of the orthogonal test

3 結(jié)論與討論

PGPR菌株發(fā)酵過(guò)程極其復(fù)雜，影響因素眾多，對(duì)其發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化顯得尤為重要[14～16]。作者在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過(guò)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)對(duì)影響PGPR菌株發(fā)酵的培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，不同的發(fā)酵液成分（碳源、氮源）和培養(yǎng)條件（培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵液pH值和裝液量）均會(huì)影響PGPR菌體的生長(zhǎng)和IAA產(chǎn)量，這與前人的研究結(jié)果[17，18]相吻合。發(fā)酵液成分試驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄糖、蔗糖、甘露醇、蛋白胨和酵母粉對(duì)PGPR菌體生長(zhǎng)有較好的促進(jìn)作用，而蔗糖、蛋白胨、酵母粉和硝酸鉀可以大幅度提高IAA產(chǎn)量，這與文獻(xiàn)報(bào)道的觀點(diǎn)[19，20]略有不同，可能是因?yàn)榫瓴煌斐傻?；通過(guò)正交試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵條件對(duì)IAA產(chǎn)量的影響順序?yàn)檠b液量＞培養(yǎng)時(shí)間＞溶液pH值＞培養(yǎng)溫度，最佳發(fā)酵條件為培養(yǎng)時(shí)間60 h、培養(yǎng)溫度35℃、發(fā)酵液pH值6、裝液量50 mL，與前人對(duì)不同菌株的發(fā)酵條件和培養(yǎng)基成分研究結(jié)果[21]相比較，不同種類菌株之間差異很大。

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［21］鄭文波，申飛，閆小梅，張舒玄，孫波.紅壤中產(chǎn)吲哚乙酸并具解磷作用的促生菌篩選鑒定及促生效果研究［J］.土壤，2015，47（2）：361-368.研究［J］.

Optim ization of Submerged Fermentation of Plant Grow th-promoting Rhizobacteria From Hot Pepper

SUN Zhao-yuan，ZHAI Wei-wei*，ZHANG Li-fang，CAO Yang
（Jiangsu Food&Pharmaceutical Science College，Huaian 223003，China）

Fermentation conditions of a plant growth-promoting rhizobacteria（PGPR）from hot pepper were optimized by OD600and content of indoleacetic acid.The effects of six reaction parameters，including carbon sources，nitrogen source，fermentation time and temperature，pH of solutions and quantity of samples，on the growth of PCRR and content of indoleacetic acid were conducted to explore by single factor experiments and orthogonal experiment.The results showed that an optimum yield of indoleacetic acid was obtained by 50 mL samples，at pH 6 and 35℃with standing time of 60 h.In addition，other factors had the largest impact on the yield of indoleacetic acid followed by quantity of sample，fermentation time，pH of solutions and fermentation temperature.

Hot pepper；Rhizosphere bacteria；Liquid state fermentation；IAA

S144.9

：A

：1008-1631（2017）02-0061-05

2016-08-31

江蘇省政策引導(dǎo)類計(jì)劃（產(chǎn)學(xué)研合作）項(xiàng)目（BY2015054-01）

孫兆遠(yuǎn)（1978-），男，江蘇沛縣人，講師，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分提取與應(yīng)用研究。E-mail：sun_zyuan@126.com。

翟瑋瑋（1968-），女，江蘇淮安人，教授，碩士，主要從事天然產(chǎn)物活性成分提取與應(yīng)用研究。E-mail：zaiww6810@126.com。