侯德寶，蔡國林，朱德偉，吳殿輝，陸 健

(1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

油料蛋白

生物技術(shù)法處理對花生粕飼用品質(zhì)影響的研究

侯德寶1，2，3，蔡國林1，3，朱德偉1，3，吳殿輝1，3，陸 健1，2，3

(1.江南大學 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江蘇 無錫214122；2.江南大學 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫 214122)

花生粕存在黃曲霉毒素B1(AFB1)易超標、非淀粉多糖含量高和蛋白質(zhì)品質(zhì)不佳等缺陷，利用微生物(枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、乳酸片球菌)發(fā)酵結(jié)合復合酶制劑處理花生粕，可以綜合改善其飼用品質(zhì)。研究表明：處理后花生粕中AFB1的去除率為94.6%，非淀粉多糖含量由30%降低至10.5%，蛋白質(zhì)含量由47.8%提高至61.5%，大分子蛋白明顯降解為小分子蛋白，小肽含量由5.36% 提高至25.21%，必需氨基酸總量提高了19.67%，乳酸含量由0.7%提高至2.8%。經(jīng)過生物技術(shù)法處理，花生粕的飼用品質(zhì)得到了明顯改善。

花生粕；混合發(fā)酵；黃曲霉毒素B1；非淀粉多糖

花生粕是花生仁提取油脂后的副產(chǎn)品，花生粕中蛋白質(zhì)含量高達48%左右，是一種潛在的優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。但是花生粕容易感染黃曲霉，黃曲霉在生長代謝過程中會產(chǎn)生黃曲霉毒素B1(AFB1)，AFB1會對動物的肝臟造成傷害，并影響其生長性能[1]。國家飼料衛(wèi)生標準(GB 13078—2001)規(guī)定花生粕中AFB1最高限量為50 μg/kg，配合飼料中AFB1的最高限量為10～20 μg/kg。目前市場上的花生粕基本都含有AFB1，污染嚴重者達到180 μg/kg[2]。花生粕還含有高達30%左右的非淀粉多糖(NSP)，多為難消化利用的纖維素和半纖維素[3]，過量的NSP會導致飼料蛋白質(zhì)利用率降低，是植物源蛋白飼料中常見的抗營養(yǎng)因子。此外，花生粕中蛋白質(zhì)品質(zhì)不佳，如氨基酸不平衡(賴氨酸含量低)，肽含量也相對偏少，造成其消化率偏低[4]。上述飼用品質(zhì)缺陷的存在，在一定程度上限制了花生粕在飼料行業(yè)的應用。

目前，對花生粕的研究主要有酶解生產(chǎn)抗氧化肽和抗菌肽，制備膳食纖維和發(fā)酵花生粕等。任曉靜等[5]利用植物乳桿菌對花生粕進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵后蛋白質(zhì)品質(zhì)有所提升，但AFB1去除率僅為 44.61%，且可能存在AFB1解吸附的風險。徐銘乾[6]采用解淀粉芽孢桿菌對花生粕進行固態(tài)發(fā)酵，AFB1去除率達到81.39%，但對AFB1含量高(145.17 μg/kg)的花生粕發(fā)酵后仍能殘留27.01 μg/kg的AFB1。目前的研究主要針對花生粕的個別飼用品質(zhì)缺陷進行改善，且沒有關(guān)注主要抗營養(yǎng)因子NSP的降解，導致產(chǎn)品難以高比例替代魚粉等優(yōu)質(zhì)蛋白飼料。

本研究在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上，嘗試采用微生物發(fā)酵并結(jié)合復合酶制劑的生物技術(shù)法處理花生粕，在高效降解花生粕中AFB1的同時，降低抗營養(yǎng)因子NSP的含量，提高蛋白質(zhì)的品質(zhì)，實現(xiàn)花生粕資源節(jié)約化和解決飼料安全性問題。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

花生粕，由山東魯花集團有限公司提供；纖維素酶、木聚糖酶、果膠酶，均購自白銀賽諾生物科技有限公司；β-葡聚糖酶，購自康地恩生物科技有限公司；AFB1標準品(純度大于99%)，甲醇、乙腈為色譜純，購自Sigma公司；三氟乙酸為化學純，正己烷為分析純,購自國藥集團化學試劑有限公司；氮氣，購自無錫新南化學氣體有限公司；SPE柱，購自無錫科奧美萃生物科技有限公司；枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、乳酸片球菌(Pediococcusacidilactici)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，均為實驗室保藏菌株。

U3000高效液相色譜儀，美國Dionex公司；KT260凱氏定氮儀，福斯賽諾(蘇州)分析儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 生物技術(shù)法處理花生粕

花生粕(50 g)和水按1∶0.8比例混合，121℃滅菌20 min，冷卻后接種二級活化的枯草芽孢桿菌，接種量10%，發(fā)酵72 h；取出后加水至料水比1∶3，添加復合酶制劑(纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶各以100 U/g添加，果膠酶以200 U/g添加)并置于45℃下酶解反應4 h；酶解反應后將樣品進行沸水浴20 min，冷卻后添加經(jīng)二級活化好的釀酒酵母和乳酸片球菌，各接種5%，發(fā)酵48 h后固液分離，烘干、粉碎。

1.2.2 AFB1含量的測定

花生粕中AFB1含量用乙腈-水(84∶16)溶液提取，提取液經(jīng)SPE柱凈化，凈化后的AFB1提取液進行柱前衍生，衍生后過0.45 μm微孔濾膜，采用高效液相色譜法測定AFB1的含量[5]。

1.2.3 NSP和還原糖含量的測定

NSP含量按總糖含量減去還原糖含量計算。

還原糖含量、總糖含量的測定參照文獻[7]進行。

1.2.4 蛋白質(zhì)含量的測定

按照GB 5009.5—2010方法測定蛋白質(zhì)含量[8]。

1.2.5 花生粕中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE分析

稱取處理前后的粉碎花生粕各1.000 0 g，加入10.00 mL 0.1 mol/L的Tris-HCl緩沖液(pH 8.0)浸提2 h，然后于3 000×g，4℃離心10 min，取上清液，再于10 000 r/min，4℃離心5 min，收集上清液用于SDS-PAGE電泳[5]。

1.2.6 小肽含量的測定

按照GB/T 22492—2008方法測定花生粕小肽的含量。

1.2.7 氨基酸組成的測定

按照GB/T 5009.124—2003方法測定氨基酸組成。

1.2.8 總酸含量的測定

采用0.1 mol/L標準NaOH溶液滴定，計算總酸含量(以乳酸計)[8]。

2 結(jié)果與討論

2.1 AFB1含量的變化

經(jīng)生物技術(shù)法處理后花生粕中AFB1含量的變化如圖1所示。

由圖1可知，處理前后花生粕中AFB1的含量明顯降低，經(jīng)計算，處理前其含量為169.28 μg/kg，處理后僅為9.14 μg/kg，AFB1的去除率達到94.6%。文獻報道，飼料中添加0.2%的蒙脫石可有效解決飼料中AFB1污染問題；此外，水合氯硅酸鈉鈣、沸石、膨潤土等吸附劑也能夠有效吸附AFB1[9]。Luo等[10]用臭氧處理被AFB1污染的玉米，AFB1降解率約為80%。這些物理或化學方法雖然可以減少AFB1的含量，但費時、費力，且對花生粕的營養(yǎng)成分造成流失，還存在潛在的副作用。本研究利用農(nóng)業(yè)部規(guī)定使用的有益微生物添加劑對花生粕進行混合發(fā)酵，AFB1含量低至9.14 μg/kg，遠低于國家標準對花生粕中AFB1含量的限量要求(≤50 μg/kg)；也低于市場上配合飼料、水產(chǎn)飼料等對AFB1含量一般不得超過20 μg/kg的要求，明顯提高了花生粕的應用范圍。

圖1 處理前(a)后(b)花生粕中AFB1含量的變化

2.2 NSP含量和還原糖含量的變化

本研究基于花生粕中NSP成分的特點，添加以纖維素酶、木聚糖酶、β-葡聚糖酶、果膠酶組成的復合酶制劑，考察酶解前后花生粕中NSP、還原糖含量的變化情況，結(jié)果如圖2所示。

圖2 處理前后花生粕中NSP、還原糖含量的變化

由圖2可知，花生粕中NSP含量從30%降至10.5%，而還原糖含量則從0.45%提高至6.72%。NSP被酶解后，其產(chǎn)物可為后續(xù)的混菌發(fā)酵提供碳源，并轉(zhuǎn)化成有益代謝產(chǎn)物，可以提高發(fā)酵水平。Hogberg等[11]曾對不同動物、同一動物的不同生長階段兩種條件下對NSP的抗營養(yǎng)作用進行了系統(tǒng)研究，在持續(xù)飼喂高NSP含量的日糧后，實驗組家禽、幼齡牲畜的體重明顯低于空白組 (P<0.05)，這表明家禽、幼齡階段的牲畜對NSP的抗營養(yǎng)作用更敏感。因此，NSP含量的減少可降低花生粕的抗營養(yǎng)作用，提高其飼用品質(zhì)。

2.3 蛋白質(zhì)含量和小肽含量的變化

處理前后花生粕中蛋白質(zhì)含量和小肽含量的變化如圖3所示。

圖3 處理前后花生粕中蛋白質(zhì)、小肽含量的變化

由圖3可知，經(jīng)過處理后的花生粕中蛋白質(zhì)含量由原來的47.8%提高到了61.5%，這主要是由于復合酶酶解了其中的NSP。同時，微生物發(fā)酵產(chǎn)生CO2，使蛋白質(zhì)得到了一定程度的濃縮。目前市場上的飼料蛋白以魚粉、發(fā)酵豆粕為主，一級魚粉蛋白質(zhì)含量都在60%以上，發(fā)酵豆粕的蛋白質(zhì)含量也在50%以上。通過本研究處理后的花生粕中蛋白質(zhì)含量可以達到一級魚粉的水平，這也提高了花生粕在飼料蛋白市場的競爭力。處理后花生粕中的小肽含量也由5.36%提升至25.21%。小肽營養(yǎng)價值高，可以改善飼料適口性、減少仔豬腹瀉、促進骨骼生長，其運轉(zhuǎn)系統(tǒng)速度快、耗能低、不易飽和,對動物生長意義重大[12]。

通過SDS-PAGE考察處理前后花生粕中蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)，評價生物技術(shù)法處理的花生粕中蛋白質(zhì)的降解情況，結(jié)果見圖4。

圖4 處理前后花生粕中蛋白質(zhì)的SDS-PAGE變化

由圖4可知，經(jīng)過處理后，蛋白質(zhì)中的大分子蛋白質(zhì)明顯降解為小分子蛋白質(zhì)。小分子蛋白質(zhì)對腸道健康和功能發(fā)揮具有保護作用，可以促進腸道上皮細胞增殖，改善蛋白質(zhì)代謝，提高腸道黏膜免疫功能和抗氧化能力，從而促進腸道發(fā)育[13]。

2.4 氨基酸組成的變化

用氨基酸自動分析儀測定處理前后花生粕中必需氨基酸組成的變化，結(jié)果見表1。

表1 處理前后花生粕中必需氨基酸組成的變化 %

注：-表示低于檢出限。

由表1可知，處理后花生粕中必需氨基酸總量提高了19.67%。脊椎動物等自身無法合成必需氨基酸，而必需氨基酸在體內(nèi)又是合成蛋白質(zhì)必不可缺的要素。在腸道代謝過程中，必需氨基酸是小腸黏膜的重要能量物質(zhì)，參與腸道內(nèi)氨基酸、谷胱甘肽和多胺等多種生物活性物質(zhì)的合成，必需氨基酸對維持腸黏膜的完整性和腸道功能有重要意義[14]。本研究處理后的花生粕，可整體提高必需氨基酸含量19.67%，賴氨酸含量提高了16.89%，蛋氨酸含量提高了18.00%，蘇氨酸含量提高了25.17%，緩解了花生粕氨基酸不平衡的問題。

2.5 總酸含量的變化

本研究添加了乳酸菌對花生粕進行發(fā)酵實驗，通過測定處理前后花生粕的pH和總酸含量(以乳酸計)，發(fā)現(xiàn)pH從處理前的6.39降至4.80，乳酸含量從處理前的0.7%提高至2.8%。飼料中添加乳酸菌可維持腸道菌群的微生態(tài)平衡，Demecková等[15]通過向多產(chǎn)母豬飼喂經(jīng)植物乳桿菌發(fā)酵的液體飼料，發(fā)現(xiàn)其糞便中的大腸桿菌類細菌下降顯著(P<0.01)。此外，花生粕呈酸性，在儲藏過程中不易滋生沙門氏菌、大腸桿菌、霉菌等致病菌，可使花生粕的品質(zhì)穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

利用微生物(枯草芽孢桿菌、釀酒酵母、乳酸片球菌)發(fā)酵結(jié)合復合酶制劑的生物技術(shù)法處理花生粕，比較處理前和處理后花生粕中AFB1含量、NSP含量、蛋白質(zhì)含量、小肽含量、氨基酸組成、總酸含量的變化，綜合考察了生物技術(shù)法處理對花生粕品質(zhì)的改善情況。研究發(fā)現(xiàn)，AFB1的去除率為94.6%。NSP從30%降至10.5%,還原糖從0.45%提高至6.72%。蛋白質(zhì)含量由47.8%提高到61.5%，大分子蛋白明顯降解為小分子蛋白，必需氨基酸總量提高19.67%；其中，賴氨酸含量提高了16.89%，蛋氨酸含量提高了18.00%，蘇氨酸含量提高了25.17%。而有益代謝產(chǎn)物乳酸含量從0.7%提高到2.8%。經(jīng)生物技術(shù)法處理后花生粕的品質(zhì)有明顯提高，尤其是AFB1的降解非常明顯，蛋白質(zhì)含量也大大提高。而生物技術(shù)法降解AFB1的機理有待進一步研究。

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Effect of biotechnology treatment on feeding quality of peanut meal

HOU Debao1,2,3, CAI Guolin1,3,ZHU Dewei1,3,WU Dianhui1,3,LU Jian1,2,3

(1.National Engineering Laboratory for Cereal Fermentation Technology, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China; 2. Key Laboratory of Industrial Biotechnology, Ministry of Education,Jiangnan University, Wuxi 214122, Jiangsu, China; 3. School of Biotechnology, Jiangnan University,Wuxi 214122, Jiangsu, China)

Peanut meal has defects of aflatoxin B1(AFB1) easy to exceed standard, high content of non-starch polysaccharides(NSP), poor quality of protein, etc. Peanut meal was treated by microbial(Bacillussubtilis,SaccharomycescerevisiaeandPediococcusacidilactici) fermentation combined with complex enzyme. The feeding quality of peanut meal was improved. The results showed that after treatment the removal rate of AFB1in peanut meal was 94.6%, NSP content decreased from 30% to 10.5%, protein content increased from 47.8% to 61.5% and macromolecular protein obviously degraded into small molecule protein. The small peptide content increased from 5.36% to 25.21% and the total content of essential amino acid was improved by 19.67%. Additionally, the content of lactic acid increased from 0.7% to 2.8%. The quality of peanut meal was greatly improved by biotechnology treatment.

peanut meal; mixed fermentation; aflatoxin B1; non-starch polysaccharides

2016-10-19;

2017-02-21

國家973計劃(2013CB733602)；江蘇省普通高校研究生實踐創(chuàng)新計劃項目(SJLX5-0545)；山東省自主創(chuàng)新及成果轉(zhuǎn)化專項(2014XGA06056)；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目

侯德寶(1991)，男，碩士研究生，研究方向為飼料原料的生物技術(shù)處理(E-mail)517470343@qq.com。

陸 健，教授，博士生導師(E-mail)jlu@jiangnan.edu.cn。

TS201.3; TQ92

A

1003-7969(2017)06-0093-04