張怡一，徐 茜，陳 琳，姚軼俊，鞠興榮，王立峰*（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

薏米中多酚化合物的分離純化及抗氧化活性分析

張怡一，徐 茜，陳 琳，姚軼俊，鞠興榮，王立峰*
（南京財經(jīng)大學食品科學與工程學院，江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇高校糧油質(zhì)量安全控制及深加工重點實驗室，江蘇 南京 210023）

利用葡聚糖凝膠將薏米中兩類多酚類物質(zhì)進行分離純化，從而得到6 個不同的組分。采用Folin-Ciocalteu法測定該6 個組分總酚含量，采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）、過氧化氫自由基清除能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）和細胞內(nèi)抗氧化能力（cellular antioxidant activity assay，CAA）分析法測定所得6 個組分抗氧化能力。在所得的6 個組分中選擇抗氧化活性最強的3 個組分進行半制備，可制得4 種薏米多酚純化物，并測定其4 種純化物的抗氧化活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所分離的6 個組分中，薏米中的多酚主要存在于組分2、組分3及組分5中，其總酚含量分別為（30.56±2.25）、（17.40±2.76）、（25.18±1.10）mg GAE/100 g薏米粉末，結(jié)合型酚類化合物占薏米總酚含量1/3以上。組分2、組分3及組分5薏米多酚的抗氧化能力較強。經(jīng)過半制備液相得到的4 種多酚純化物質(zhì)分別為N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺、對香豆酸、阿魏酸及蘆丁，其中N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺為游離型多酚的主要物質(zhì)，而阿魏酸為結(jié)合型多酚的主要物質(zhì)，但在游離型多酚中也有少許存在。4 種酚類化合物均具有強抗氧化活性，是薏米中多酚類物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作用的主要活性成分。

薏米；多酚；分離純化；抗氧化活性

薏米（Coix lacryma-jobi）又名薏苡，屬于禾本科薏苡屬草本植物，在中國、越南、巴西、日本等許多國家都有種植，我國南北方都種植薏米，主要產(chǎn)地為福建、河北、遼寧等地。薏米富含蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物、維生素等多種營養(yǎng)物質(zhì)以及磷、鐵、鈣、鋅、鉀等礦質(zhì)元素，被譽為“世界禾本科植物之王”。目前研究較多的薏米藥理作用主要為抗腫瘤研究[1-3]，除此以外，薏米還有消炎抗敏、降血壓降血脂、瘦身美白等功效[4-7]。

薏米屬于藥食兩用物質(zhì)，在發(fā)揮諸多藥理作用的同時具有很高的食用安全性，這歸功于薏米中較多的植物化學物質(zhì)[8-9]。多酚是一類廣泛存在于植物內(nèi)的多元酚化合物，具有很強的抗氧化能力[10-12]，薏米中的多酚類物質(zhì)也是薏米發(fā)揮諸多生理功能的主要活性物質(zhì)之一。薏米中的多酚類物質(zhì)分為游離型酚類化合物和結(jié)合型酚類化合物，關(guān)于谷物中的結(jié)合型分類化合物研究較少，Adom等[13]的研究中指出，全谷物食品中的多酚含量由于忽略了結(jié)合型酚類化合物而被大大低估。王立峰等[14]曾比較了3 種不同產(chǎn)地的薏米中總酚含量和抗氧化能力，其中薏米提取物中結(jié)合型多酚含量接近游離型多酚，但結(jié)合型多酚的抗氧化能力則明顯高于游離型部分，而該提取物并沒有進行分離純化，也就是說兩類酚類化合物真正發(fā)揮抗氧化作用的物質(zhì)暫時還未可知。本研究將薏米中的游離型與結(jié)合型酚類化合物進行進一步分離得到不同組分，并對活性成分最高的幾個組分進行純化，研究其所得純化物的抗氧化活性，為今后對薏米多酚的進一步研究做鋪墊與準備。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

薏米品種為貴州小薏米。

石油醚、乙醇、乙酸乙酯、乙酸、丙酮（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；沒食子酸、兒茶素、綠原酸、對羥基苯酸、香草酸、香草醛、對香豆酸、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、山柰酚、N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺和沒食子酸甲酯標準品為色譜純 美國Sigma公司；乙腈（色譜級） 德國默克公司；葡聚糖凝膠LH-20填料 瑞典GE公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SX-500快速自動高壓滅菌鍋 日本Tomy Digital Biology公司；FW100高速粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司；J6高速冷凍離心機 美國Beckman Coulter公司；pHS-3C型精密數(shù)顯pH計 上海精密科學儀器廠；TP-214電子分析天平 丹佛儀器北京有限公司；THZ-D臺式恒溫振蕩器 江蘇太倉市強樂實驗設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋 國華電器有限公司；ULT1386-5-V超低溫冰箱 美國Thermo Scientific公司；ALpHA2-4型真空冷凍干燥機 德國Christ公司；QL-861漩渦振蕩器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司；Milli-Q Academic超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司；層析柱（1.5 cm×76 cm） 瑞典GE公司；玻璃砂芯過濾裝置 天津津騰實驗設(shè)備有限公司；Anke TDL-5-A離心機 上海安亭科學儀器廠；SHZ-D III予華牌循環(huán)水真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上海亞榮化學儀器廠；HD-3紫外檢測儀、HL-2恒流泵、XWT-S小型臺式記錄儀、BSZ-100自動收集器 上海滬西分析儀器廠；2707自動進樣器、高效液相色譜儀1525二元泵、2998檢測器、餾分收集器 美國Waters公司；SpectraMax M2酶標儀 美國Molecular Devices公司；Dionex Ultimate 3000 美國Thermo Fisher公司。

1.3 方法

1.3.1 薏米多酚提取物的制備

薏米樣品中游離型和結(jié)合型多酚類化合物的提取采用丙酮提取法和NaOH消化法[13,15]，并稍作修改。共2 kg脫脂薏米粉分多次以料液比1∶10（m/V）的比例用80%的丙酮水溶液振蕩提取1 h，混合液在3 000 r/min條件下離心25 min，收集上清液，殘渣用相同的方法重復提取3 次，將上清液合并收集，在40 ℃條件下用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀真空濃縮，經(jīng)濃縮后的提取液再經(jīng)冷凍干燥，得到薏米游離多酚粗提物干粉，將干粉置于－20 ℃條件下保存。剩余薏米殘渣采用NaOH消化法，首先將殘渣與20 mL 2 mol/L的NaOH溶液混勻，振蕩1 h進行消化處理，加入濃鹽酸調(diào)節(jié)pH值為2，按料液比1∶3（m/V）加入乙酸乙酯，于冷凍離心機3 500 r/min提取結(jié)合多酚，重復5 次，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋干，溶于去離子水，用冷凍干燥機凍干樣品至粉末狀，保存于－20 ℃條件下，即薏米結(jié)合多酚粗品。

1.3.2 薏米多酚的分離與純化

參考Wang Lifeng等[16]的方法，將1.3.1節(jié)所得游離粗提物及結(jié)合粗提物粉末分別溶于10 mL甲醇，置于葡聚糖凝膠LH-20進行分離（1.5 cm×76 cm，40～120 μm），流速40 mL/h，由成分收集器收集，吸收波長調(diào)節(jié)至280 nm。

1.3.3 總酚含量的測定

所有組分的總酚含量測定選用Singleton等[17]所描述的Folin-Ciocalteu比色法，并稍作改動。經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的所有組分凍干成粉末后，取一定量溶于去離子水中，并使其可讀取范圍在標準曲線0.0～600.0 μg GAE/mL范圍內(nèi)。之后與Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)，一定時間后使用碳酸鈉終止反應(yīng)。室溫條件下放置90 min后，用酶標儀于760 nm波長處測定吸光度?？偡雍恳悦?00 g干質(zhì)量等同于沒食子酸的毫克數(shù)（mg GAE/100 g）表示。

1.3.4 氧自由基吸收能力的測定

所有組分的氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）值參照Huang Dejian[18]、Zhang Mingwei[19]等的方法并稍作改動。具體操作方法如下：經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的所有組分凍干成粉末后，溶于pH 7.4濃度為75 mmol/L的磷酸緩沖溶液進行稀釋，于96 孔板各孔中加入20 μL樣品或者Trolox標準溶液（0.00、6.25、12.50、25.00、50.00 μg/mL）后將96 孔板置于酶標儀中37 ℃溫育20 min，之后每孔加入200 μL Fluorescein熒光指示劑（0.96 μmol/mL），再次將96 孔板置于酶標儀中37 ℃溫育20 min，然后每孔注入20 μL 2,2’-偶氮二（2-脒基丙烷）二鹽酸鹽（2,2’-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride，AAPH），設(shè)定酶標儀在485 nm波長處激發(fā)，于520 nm波長處測定，每1 min記錄讀數(shù)，共記錄100 min。曲線下面積由SoftMax Pro（Version 5.4.1）計算而得。各組分ORAC值以每100 g干質(zhì)量薏米粉末等同于Trolox的毫克數(shù)表示；純化物ORAC值以每克干質(zhì)量純化物等同于Trolox的毫克數(shù)表示。

1.3.5 清除過氧化自由基能力測定

所有組分的清除過氧化自由基能力（peroxyl radical scavenging capacity，PSC）測定參照Adom等[20]的方法并稍作改動。經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的所有組分凍干成粉末后，溶于pH 7.4濃度為75 mmol/L的磷酸緩沖溶液。將2.5 mg二氯二氫熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA）溶于2 mL甲醇（A溶液），取400 μL A溶液溶于3.74 mL甲醇（B溶液），取11 μL B溶液混合于989 μL的KOH，避光反應(yīng)5 min后，用75 mmol/L磷酸緩沖溶液定容到8 mL，得到DCFH溶液。取96 孔板，對照區(qū)域加入250 μL蒸餾水，樣品區(qū)域加入100 μL樣品以及100 μL DCFH溶液和50 μL的200 mmol/L的AAPH，標準品區(qū)域加入不同質(zhì)量濃度Trolox標準溶液（3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg/mL）以及100 μL DCFH溶液和50 μL的200 mmol/L的AAPH，反應(yīng)在37 ℃進行，設(shè)定酶標儀在485 nm波長處激發(fā)，于538 nm波長處測定，每1 min記錄讀數(shù)，共記錄40 min。PSC根據(jù)式（1）計算。

式中：各組分PSC值以每100 g干質(zhì)量薏米粉末等同于Trolox的毫克數(shù)表示；純化物PSC值以每克純化物干質(zhì)量等同于Trolox的毫克數(shù)表示；As為樣品或者標準品的曲線下面積；Ac為空白對照的曲線下面積；本實驗中的半最大效應(yīng)濃度（concentration for 50% of maximal effect，EC50）由PSC的計算得出，即每個組分和純品引起50%抑制DCFH的氧化作用所需要的劑量。

1.3.6 細胞培養(yǎng)

細胞生長培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)基，混合10%胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、50 U/mL青霉素和50 μg/mL鏈霉素構(gòu)成，細胞放置在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。本實驗使用細胞代數(shù)在22～32 代之間。

1.3.7 細胞毒性實驗

細胞毒性分析采用噻唑藍（3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide，MTT）法[21]，具體操作步驟為：將HepG2細胞以6×104個/孔的數(shù)量接種到96 孔板中，并于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。把粗提物、各組分和純化物用培養(yǎng)液溶解，并將96 孔板中的培養(yǎng)液棄掉，換成100 μL含有不同質(zhì)量濃度樣品的培養(yǎng)液繼續(xù)孵育，不含樣品的培養(yǎng)液視為對照組。24 h后，吸出培養(yǎng)液，每孔加入20 μL的MTT溶液（5 mg/mL），繼續(xù)在37 ℃條件下培養(yǎng)4 h。之后吸出MTT溶液，每孔加入150 μL的二甲基亞砜（dimethyl sulphoxide，DMSO）溶液，將孔板置于恒溫振蕩箱中振蕩反應(yīng)30 min。利用多功能酶標儀測定吸光度，最大吸收波長設(shè)置在570 nm。當細胞的死亡率與對照組相比超過10%的時候就認為該質(zhì)量濃度下的樣品具有毒性[18]。

1.3.8 細胞抗氧化活性測定

細胞抗氧化活性（cellular antioxidant activity，CAA）測定采用Wolfe等[22]建立的方法并根據(jù)特定的樣品做了細微的改動，具體操作步驟如下：抗氧化處理液的配制：將DMEM溶液與2 mmol/L L-谷氨酰胺和10 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸4-羥乙基哌嗪乙磺（4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid，HEPES）溶液混合。氧化處理液的配制：將Hank’s平衡鹽溶液溶液與10 mmol/L的HEPES溶液混合。DCFH-DA工作液的配制：先用甲醇配制20 mmol/L的DCFH-DA儲存液，將50 μL DCFH-DA儲存液與20 mL抗氧化處理液混合均勻，置于－20 ℃條件下備用。200 mmol/L AAPH儲存液的配制：將0.542 3 g AAPH粉末溶于10 mL去離子水中并置于－40 ℃條件下備用。600 μmol/L AAPH工作液的配制：將21 μL AAPH儲存液添加到7 mL氧化處理液中混勻備用。

將HepG2細胞以6×104個/孔的數(shù)量種到96 孔板中，由于孔板最外層的孔的數(shù)值變化大，所以最外層不培養(yǎng)細胞。將粗提物、各組分和純化物溶在DMEM培養(yǎng)液中。細胞在培養(yǎng)大約24 h后，將培養(yǎng)液棄掉，每孔用100 μL的磷酸鹽緩沖液清洗一次，并加入100 μL含有25 μmol/L DCFH-DA的樣品液處理1 h。之后棄掉樣品液，加入100 μL 600 μmol/L的AAPH工作液。96 孔板立即置于多功能酶標儀上讀取熒光值，溫度設(shè)置在37 ℃。發(fā)射波長設(shè)置在538 nm，激發(fā)波長設(shè)置在485 nm，每5 min測定1 次，總共測定1 h。每個孔板都要設(shè)置空白組和對照組，對照組不添加樣品，只添加DCFH-DA工作液和AAPH工作液；而空白組只添加DCFH-DA工作液。

采用曲線下峰面積來計算CAA，公式如式（2）所示。

式中：∫As為樣品組的峰面積；∫Ac為對照組的峰面積。

槲皮素在本實驗中作為標準品使用，樣品的CAA定義為：各組分CAA值以每100 g干質(zhì)量薏米粉末等同于槲皮素的物質(zhì)的量表示；純化物CAA值以每克純化物干質(zhì)量等同于槲皮素的物質(zhì)的量表示。

1.3.9 半制備RP-HPLC的分離及HPLC-DAD分析薏米多酚純化物

組分2、3及組分5采用半制備反相-高效液相色譜（reversed phase high-performance liquid chromatography，RP-HPLC）進一步分離純化，該半制備RP-HPLC連接有二極管陣列檢測器（diode array detector，DAD）、四元泵、柱溫箱、自動進樣器和樣品收集系統(tǒng)。制備柱采用Waters C18柱，柱溫為30 ℃。其中組分2、組分3的條件為：流動相A為水溶液，B為乙腈，梯度洗脫的方法為：0～15 min，0%～17% B、100%～83% A；15～50 min，17%～28% B、83%～72% A；50～65 min，28%～80% B、72%～20% A；65～75 min，80%～0% B、20%～100% A；75～80 min，100% A；流動相的流速為3.5 mL/min。樣品溶于甲醇，進樣前需過0.22 μm濾膜，質(zhì)量濃度為10 mg/mL，單次進樣100 μL，最佳吸收波長設(shè)置為280 nm。分離所得薏米多酚純化物于HPLC-DAD進行分析并與所購標準品進行比較。分析柱使用Acclaim 120型C18柱，柱溫為25 ℃。流動相A為0.1%的乙酸-水溶液，B相為乙腈溶液。優(yōu)化后的梯度洗脫程序為：0～15 min，0%～17% B、100%～83% A； 15～50 min，17%～28% B、83%～72% A；50～65 min，28%～80% B、72%～20% A；65～75 min，80%～0% B、20%～100% A；75～80 min，100% A。進樣量為10 μL，流速設(shè)置為0.5 mL/min。紫外吸收波長設(shè)置為280 nm，樣品溶于甲醇，進樣前需過0.22 μm濾膜。

1.4 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 多酚粗提物的分離

薏米經(jīng)研磨脫脂后，提取所需樣品，100 g薏米粉末可得1.5 g游離型多酚粗提物以及0.2 g結(jié)合型多酚粗提物。如圖1所示，游離型多酚經(jīng)葡聚糖LH-20凝膠分離后可得3 個不同的組分，分別為組分1、組分2及組分3，而結(jié)合型多酚經(jīng)葡聚糖LH-20凝膠分離后也可得3 個不同的組分，分別為組分4、組分5及組分6。

圖1 葡聚糖LH-20凝膠分離薏米游離型多酚粗提物（A）及結(jié)合型多酚粗提物（B）Fig. 1 Sephadex LH-20 chromatogram of free polyphenols (A) and bound polyphenols (B) in adlay

2.2 薏米中的總酚含量分析

Adom等[13,20]的研究指出，在全谷物化合物中，除了游離型的多酚外，還含有較多的結(jié)合型多酚。而總酚含量與抗氧化活性之間具有顯著正相關(guān)關(guān)系。因而總酚含量也能間接反映各組分的抗氧化活性[23-24]。因此除了薏米中的游離型酚類物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作用，還應(yīng)當將結(jié)合型酚類化合物考慮在內(nèi)。薏米中酚類化合物經(jīng)葡聚糖凝膠分離后的6 個組分的總酚含量分別見表1，組分2的總酚含量最高，為（30.56±2.25） mg GAE/100 g薏米粉末，組分5和組分3的總酚含量次之，分別為（25.18±1.10） mg GAE/100 g及（17.40±2.76）mg GAE/100 g，而其余的組分1、4、6中的多酚含量均較低，也就是說，薏米中多酚類物質(zhì)大部分存在于組分2、3、5中。組分1、2、3的總酚含量之和與組分4、5、6的總酚含量之和相差不大，間接證明結(jié)合型酚類物質(zhì)多酚含量是計算薏米中總酚含量不可忽視的一部分，該結(jié)果與Adom等[13,20]的結(jié)果一致。

表1 薏米多酚各組分ORAC、PSC、 CAA、EC50和細胞毒性（s，n＝3）Table 1 ORAC, PSC, CAA, EC50, cellular antioxidant activity and cytotoxicity of different fractions from adlay (±s,n= 3)

表1 薏米多酚各組分ORAC、PSC、 CAA、EC50和細胞毒性（s，n＝3）Table 1 ORAC, PSC, CAA, EC50, cellular antioxidant activity and cytotoxicity of different fractions from adlay (±s,n= 3)

注：同列肩標小寫字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。表4同。

細胞毒性/（mg/mL）組分10.57±0.12d17.80±2.81c7.90±1.01c1.07±0.47c154.88±5.57b＞0.1組分230.56±2.25a194.70±10.79a77.64±7.12a5.85±1.22a24.25±2.12d＞0.1組分317.40±2.76c122.06±17.95b54.53±1.90b4.57±1.34ab33.88±1.46d＞0.1組分40.03±0.01d0.34±0.06c0.25±0.03c0.15±0.03c190.54±11.29a＞0.1組分525.18±1.10b181.53±5.32a64.78±5.88b3.38±0.93b30.90±1.97d＞0.1組分60.29±0.04d0.99±0.09c4.44±0.06c0.48±0.07c128.82±6.38c＞0.1成分總酚含量/（mg GAE/100 g）ORAC/（mg TE/100 g）PSC/（mg TE/100 g）CAA/（μmol QE/100 g）EC50/（μg/mL）

2.3 薏米總酚抗氧化活性分析

ORAC法是目前評價抗氧化活性最為簡單、靈敏的方法[25]。它具有生物相關(guān)性強、可以通過改變自由基和反應(yīng)體系的溶劑測定脂溶性和水溶性物質(zhì)的抗氧化活性、方法的專一性強等優(yōu)點[26]。由表1可知，經(jīng)過葡聚糖凝膠分離后的各組分中，組分2的ORAC最高，為（194.70±10.79） mg TE/100 g（以干質(zhì)量計，下同），組分5的抗氧化活性次之，為（181.53±5.32）mg TE/100 g，且兩者之間差異性不顯著（P＞0.05）。組分3也表現(xiàn)出較高的抗氧化活性，其ORAC為（122.06±17.95）mg TE/100 g。組分1、4、6的的抗氧化活性則遠小于組分2、3、5，其值分別為（17.80±2.81）、（0.34±0.06）、（0.99±0.09）mg TE/100 g。ORAC與總酚含量表現(xiàn)出極顯著正相關(guān)（P＜0.01），相關(guān)系數(shù)為0.993（表2）。所以無論在游離型多酚粗提物中還是在結(jié)合型多酚粗提物中，總酚含量最高的組分2表現(xiàn)出了最高ORAC，總酚含量最低的結(jié)合型粗提物組分4表現(xiàn)出了最低的ORAC，這與前人研究相符合[23]。

表2 各指標相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis among antioxidant parameters

2.4 PSC和EC50的確定

由表1可知，組分4的EC50最高，為（190.54±11.29） μg/mL，組分2最低，為（24.25±2.12）μg/mL，其中，組分2、3、5的EC50沒有顯著性差異（P＞0.05），即抗氧化能力相近。PSC與EC50值呈顯著負相關(guān)（P＜0.05），由表2可見，其相關(guān)系數(shù)為－0.900。從表1的PSC數(shù)據(jù)可知，粗品中萃取的各組分中，組分2的PSC最強（77.64±7.12）mg TE/100 g，其次為組分5（64.78±5.88） mg TE/100 g，組分3（54.53±1.90）mg TE/100 g。其余組分并沒有展現(xiàn)較強的PSC。其結(jié)果與ORAC實驗結(jié)果相似，從表2可知，ORAC與PSC的相關(guān)系數(shù)為0.990，極顯著相關(guān)（P＜0.01）。從以上兩個抗氧化實驗中發(fā)現(xiàn)，組分2、3、5的抗氧化能力較強，因此進一步進行CAA實驗。

2.5 薏米總酚CAA結(jié)果

化學抗氧化方法被廣泛地用于測定純品化合物與植物提取物的抗氧化能上，然而這種方法不能準確地反映體內(nèi)抗氧化的具體情況。而以動物模型和人體實驗為基礎(chǔ)的體內(nèi)抗氧化實驗雖然方法先進，但花費高、耗時長，且不適用于測定最基本的抗氧化性能[27]。CAA法是以細胞的吸收、傳質(zhì)和代謝為基礎(chǔ)建立的一種細胞內(nèi)抗氧化方法，這種方法能克服化學抗氧化方法的不足，更具有生物相關(guān)性，同時比動物和人體實驗花費更低、耗時更短、操作更為方便[28]。在CAA實驗之前進行了MTT實驗，由表1可知，各組分細胞毒性均超過0.1 mg/mL，本實驗所用各組分質(zhì)量濃度均在0.1 mg/mL內(nèi)。由表1可知，經(jīng)過分離后的組分中，組分2、組分3以及組分5的CAA比較突出，其值分別為（5.85±1.22）、（4.57±1.34）、（3.38±0.93）μmol QE/100 g薏米粉末。這一結(jié)果與總酚含量呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05），其相關(guān)性系數(shù)達0.858。

從上述3 個抗氧化實驗可以得知，各組分的總酚含量與抗氧化呈現(xiàn)顯著正相關(guān)（P＜0.05，P＜0.01），且組分2、3、5中含有薏米中存在的絕大部分的多酚化合物。

2.6 半制備RP-HPLC分離純化及HPLC分析薏米多酚

半制備RP-HPLC技術(shù)是分離純化天然產(chǎn)物有效成分的一種必備方法，這種方法分離效果好、所得組分純度高，但也有著分離樣品少、成本高的缺點。本研究將半制備液相法作為最終的純化方法來制備分離上述3 個組分，以期獲得薏米多酚單體化合物。從圖2可知，組分2與組分5中多酚種類較為單一，皆可分離出一種主要的多酚類物質(zhì)，組分3中則可分離出4 種多酚類物質(zhì)。游離型多酚中，4 種純化物已被鑒定，分別為N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺、對香豆酸、阿魏酸及蘆丁[3]。為此，將所純化的6 種多酚物質(zhì)與標準品出峰時間進行對比。如圖3所示，化合物1與2出峰時間皆為39.1 min，與標準品N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺出峰時間一致?；衔?出峰時間為50.8 min，該出峰時間則對應(yīng)標準品對香豆酸。化合物4與化合物6（皆為棕黃色粉末）出峰時間皆為55.5 min，與阿魏酸出峰時間一致，說明薏米游離型多酚與結(jié)合型多酚均含有阿魏酸?；衔?的出峰時間為60.5 min，對應(yīng)蘆丁。半制備液相中獲取該4 種多酚純化物其得率見表3，由表3可以看出，在4 種薏米多酚純化物中，N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺與阿魏酸得率最高，薏米游離型多酚主要為N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺，而薏米結(jié)合型多酚主要為阿魏酸。

圖2 半制備RP-HPLC分離組分2（A）、組分3（B）、組分5（C）Fig. 2 Semi-preparative HPLC chromatogram of fraction Ⅱ (A),Ⅲ (B) and Ⅴ (C)

表3 薏米多酚純化物占粗提物的得率（±s，n＝3）Table 3 Yields of phenolic compounds from crude extract±s,n= 3)

表3 薏米多酚純化物占粗提物的得率（±s，n＝3）Table 3 Yields of phenolic compounds from crude extract±s,n= 3)

注：a.游離型多酚混合物半制備所得；b.結(jié)合型多酚混合物半制備所得。

化合物N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺a對香豆酸a阿魏酸a蘆丁a阿魏酸b得率/%1.01±0.110.17±0.010.26±0.020.12±0.010.95±0.06

圖3 混合標準品溶液（A）及6 個純化物（B～G）的高效液相色譜圖Fig. 3 HPLC chromatograms of mixed phenol standard compounds (A) and six purified compounds (B–G)

2.7 薏米多酚純化物的抗氧化活性分析

表4 薏米多酚純化物ORAC、PSC、CAA、EC50和細胞毒性（s，n＝3）Table 4 ORAC, PSC, cytotoxicity concentrations, EC50, cellular antioxidant activity and CAA of different purified phenolic compounds from adlay (±s,n= 3)

表4 薏米多酚純化物ORAC、PSC、CAA、EC50和細胞毒性（s，n＝3）Table 4 ORAC, PSC, cytotoxicity concentrations, EC50, cellular antioxidant activity and CAA of different purified phenolic compounds from adlay (±s,n= 3)

酚類化合物ORAC/（mg TE/g）PSC/（mg TE/g）CAA/（μmol QE/g）EC50/（μg/mL）細胞毒性/（mg/mL）N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺1 556.81±42.13c314.32±18.28a143.88±53.06a19.37±0.44c＞0.1對香豆酸1 743.81±29.76d000＞0.1阿魏酸1 420.99±37.33b590.99±27.83b259.21±12.69b18.17±0.83b＞0.1蘆丁664.71±20.58a549.93±32.65b1 143.88±80.98c4.12±0.11a＞0.1

表4顯示了4 種薏米多酚純化物的抗氧化能力。該4 種純化物ORAC最高的化合物是對香豆酸，為（1 743.81±29.76) mg TE/g，其他依次為N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺（1 556.81±42.13）mg TE/g、阿魏酸（1 420.99±37.33）mg TE/g和蘆?。?64.71±20.58）mg TE/g。Eom等[29]的研究結(jié)果表明，酚類化合物上的—OCH3能增強其抗氧化活性，然而在本研究中，對香豆酸的ORAC高于阿魏酸，阿魏酸比對香豆酸多一個—OCH3取代基，這可能是由于使用的抗氧化測定方法不同所致。而本次研究結(jié)果與Zhao Mouming等[30]的研究結(jié)果一致。

薏米多酚純化物的PSC具有顯著性差異（P＜0.05），PSC由強到弱順序如下：阿魏酸＞蘆?。綨1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺，而對香豆酸PSC為0。此外，對4 種化合物的CAA進行了測定，其中蘆丁具有最強的CAA，為（1 143.88±80.98） μmol QE/g，其他依次為阿魏酸（259.21±12.69） μmol QE/g和N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺（143.88±53.06） μmol QE/g，與PSC分析相同，對香豆酸也沒有顯示出細胞抗氧化能力。

3 結(jié) 論

本實驗首先分別提取薏米中游離型與結(jié)合型的酚類粗提物，兩者多酚含量較為相近，說明薏米結(jié)合型多酚的含量是薏米總酚含量不可忽視的一部分。薏米總酚含量與抗氧化活性呈正相關(guān)，因此，結(jié)合型酚類化合物也是薏米發(fā)揮抗氧化作用的活性成分之一。本實驗利用葡聚糖LH-20凝膠柱將薏米中游離型酚類化合物和結(jié)合型酚類化合物進行分離得到6 個不同的組分，選擇其中抗氧化活性最佳的3個組分進行半制備后，得到4 種薏米多酚純化物。薏米游離型多酚包括：N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺、對香豆酸、阿魏酸及蘆丁，且N1,N5-雙（對香豆酰）亞精胺為主要成分。而所提取薏米結(jié)合型多酚粗提物雜質(zhì)少并且所含多酚類物質(zhì)單一，主要為阿魏酸。利用ORAC、PSC、CAA 3 個方法繼續(xù)對該4 種純化物質(zhì)進行抗氧化活性測定后，證明了該4 種酚類化合物具有較強的抗氧化活性，確定為薏米多酚類物質(zhì)發(fā)揮抗氧化作用的活性成分，本研究結(jié)果可為薏米多酚發(fā)揮抗氧化作用提供理論依據(jù)。

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Isolation and Purification of Polyphenols from Adlay and Their Antioxidant Activity

ZHANG Yiyi, XU Qian, CHEN Lin, YAO Yijun, JU Xingrong, WANG Lifeng*
(Jiangsu Key Laboratory for Grain and Oil Quality Control and Further Processing Technology, Jiangsu Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety, College of Food Science and Engineering, Nanjing University of Finance and Economics, Nanjing 210023, China)

In this study, Sephadex LH-20 column chromatography was used to separate and purify six polyphenol fractions from adlay. The Folin-Ciocalteu method was used for the determination of the total phenolic content in each fraction. Three different antioxidant assays namely, oxygen radical absorbance capacity (ORAC), peroxyl radical scavenging capacity (PSC) and cellular antioxidant activity (CAA) were carried out to evaluate antioxidant capacity of six fractions. Among these, three fractions (Ⅱ, Ⅲ and V) with the strongest antioxidant activity were purified by semi-preparative HPLC to obtain four polyphenol compounds, whose antioxidant activity was investigated. The results indicated that polyphenols were mainly distributed in fraction Ⅱ, Ⅲand V, with total phenolic contents of (30.56 ± 2.25), (17.40 ± 2.76) and (25.18 ± 1.10) mg GAE/100 g md. It was also found that bound phenolic compounds accounted for more than one third of the total phenolics in adlay. The purified phenolics were identified as N1,N5-double (p-coumaroyl) spermine, p-coumaric acid, ferulic acid and rutin, with N1,N5-double (p-coumaroyl) spermine being the major free phenolic compound and ferulic acid being the major bound one, which also existed in a small quantity in the bound form. All these phenolics were the main active compounds responsible for the strong antioxidant activity of polyphenols from adlay.

adlay; polyphenols; isolation; antioxidant activity

10.7506/spkx1002-6630-201713005

2016-10-29

國家自然科學基金面上項目（31571766）；江蘇省自然科學基金面上項目（BK20141485）；江蘇省高校自然科學重大項目（15KJA550002）

張怡一（1993—），女，碩士研究生，主要從事食品安全與營養(yǎng)研究。E-mail：Zhangyiyi_happy@163.com

*通信作者：王立峰（1977—），男，教授，博士，主要從事活性蛋白肽及植物多酚的研究與開發(fā)。E-mail：wanglifeng_8@163.com

TS201.1

A

1002-6630（2017）13-0026-08

張怡一, 徐茜, 陳琳, 等. 薏米中多酚化合物的分離純化及抗氧化活性分析[J]. 食品科學, 2017, 38(13): 26-33.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713005. http://www.spkx.net.cn

ZHANG Yiyi, XU Qian, CHEN Lin, et al. Isolation and purification of polyphenols from adlay and their antioxidant activity[J]. Food Science, 2017, 38(13): 26-33. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201713005. http://www.spkx.net.cn