范巧蘭，李永山，王慧，席凱鵬，席吉龍，史俊東，張建誠(chéng)

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.運(yùn)城農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤細(xì)菌群落的影響

范巧蘭1，2，李永山1，2，王慧1，2，席凱鵬1，2，席吉龍1，2，史俊東1，2，張建誠(chéng)1，2

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所，山西運(yùn)城044000；2.運(yùn)城農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山西運(yùn)城044000）

為了評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響，試驗(yàn)采用轉(zhuǎn)基因棉花品種晉棉26號(hào)及其非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號(hào)以及傳統(tǒng)棉花品種中棉所12號(hào)進(jìn)行了長(zhǎng)期定位試驗(yàn)，利用高通量基因測(cè)序法研究了轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)的影響。結(jié)果表明，3個(gè)棉花土壤細(xì)菌共檢測(cè)到1 585個(gè)OTUs、除1個(gè)未分類門和4個(gè)待定候選門外，其余分別屬于已知的21個(gè)門；主要優(yōu)勢(shì)種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門；每個(gè)品種有獨(dú)特的種群，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)獨(dú)有的種群為棲熱菌門，晉棉7號(hào)獨(dú)有種群為WCHB1-60；轉(zhuǎn)基因棉花土壤細(xì)菌的多樣性降低，但沒有改變土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)。

轉(zhuǎn)基因棉花；土壤；細(xì)菌；群落結(jié)構(gòu)；高通量測(cè)序

2015年的生物技術(shù)作物商業(yè)化20周年，全球種植轉(zhuǎn)基因作物面積是1996年的100多倍，達(dá)1.797億hm2。2015年全球種植棉花3 200萬(wàn)hm2，75%的種植面積是轉(zhuǎn)基因棉花，其中，我國(guó)種植370萬(wàn)hm2轉(zhuǎn)基因棉花，占全國(guó)棉花總面積的96%[1]。隨著轉(zhuǎn)基因作物種植面積的不斷擴(kuò)大，轉(zhuǎn)基因植物的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)日益受到人們的關(guān)注，轉(zhuǎn)基因?qū)ν寥郎鷳B(tài)安全評(píng)價(jià)成為研究熱點(diǎn)[2]，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究了轉(zhuǎn)Bt基因抗蟲棉對(duì)土壤微生物的影響[3-12]。由于根系分泌物和殘?bào)w中的Bt毒素在土壤中的積累，連續(xù)種植棉花會(huì)導(dǎo)致土壤微生物種群結(jié)構(gòu)變化。由于大田和實(shí)驗(yàn)室采用的試驗(yàn)方法（傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法、PFLA和DGGE等）、試材等條件的不同，導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不一致，多數(shù)結(jié)果認(rèn)為，連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因作物對(duì)土壤微生物沒有影響或影響很小[13-16]，但也有相反的結(jié)果[17-22]。近年來(lái)，高通量測(cè)序技術(shù)是一種新的技術(shù)，在微生物分子生態(tài)學(xué)等方面得到了廣泛應(yīng)用[23]。

本研究應(yīng)用Illumina平臺(tái)的Miseq高通量測(cè)序土壤細(xì)菌16S rDNA，以轉(zhuǎn)Bt基因棉花晉棉26號(hào)及其非轉(zhuǎn)基因棉花親本晉棉7號(hào)以及傳統(tǒng)品種中棉所12號(hào)為試材，進(jìn)行田間定位試驗(yàn)，旨在探索連續(xù)多年種植轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)棉花土壤細(xì)菌組成、結(jié)構(gòu)及多樣性的影響，為轉(zhuǎn)基因棉花安全評(píng)價(jià)提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)設(shè)在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所牛家凹試驗(yàn)農(nóng)場(chǎng)。試驗(yàn)地為黃壤土，肥力中等偏上，有機(jī)質(zhì)10.91 g/kg，全氮2.13 g/kg，速效氮186.04 mg/kg，速效磷6.52 mg/kg，速效鉀145.14 mg/kg，土壤pH值為7.2。

1.2 試驗(yàn)材料

供試棉花品種為轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)（JM26）及其非轉(zhuǎn)基因棉花親本品種晉棉7號(hào)（JM7）和非轉(zhuǎn)基因品種中棉所12號(hào)（CRI12）。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3次重復(fù)，小區(qū)面積30 m2。從2008年開始進(jìn)行定位試驗(yàn)，于2014年棉花收獲期采集土樣，采集的土樣放在無(wú)菌封口塑料袋中，揀出根系，立即將其放置在-80℃冰箱中保存待測(cè)。

1.4 土壤微生物總DNA的提取及細(xì)菌的高通量測(cè)序及分析

稱取土壤樣品0.5 g，用E.Z.N.A Soil DNA（OMEGA，USA）試劑盒進(jìn)行土壤總DNA提取后，用核酸定量?jī)x（NanoDrop ND-1000）和1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)土壤總DNA的濃度和純度。

高通量測(cè)序主要步驟：按指定測(cè)序區(qū)域，合成帶有bar code的特異引物。PCR采用TransGenAP221-02:TransStart Fastpfu DNA Polymerase；PCR儀:ABI GeneAmpR9700型。

土壤細(xì)菌的PCR的擴(kuò)增引物：采用16S rRNA的擴(kuò)增引物515F（5′-GTGCCAGCMGCCGCGG-3′）和907R（5′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′）來(lái)擴(kuò)增土壤細(xì)菌的16S rRNA基因。PCR反應(yīng)體系共20 μL：4 μL 5×FastPfu Buffer，2 μL 2.5 mmol/L dNTPs，0.8 μL Forward Primer（5 μmol/L），0.8 μL Reverse Primer（5 μmol/L），2 μL Template（10 ng DNA），0.4 μL FastPfu Polymerase和10 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min；95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃下延伸45 s，共有27個(gè)循環(huán)；最后在72℃下終延伸10 min結(jié)束。每個(gè)樣本3次重復(fù)，將同一樣本的PCR產(chǎn)物混合后再用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，使用AxyPrepDNA凝膠回收試劑盒（AXYGEN公司）切膠回收PCR產(chǎn)物，Tris-HCl洗脫；2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的純度和濃度。

將PCR產(chǎn)物用QuantiFluorTM-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng)（Promega公司）進(jìn)行定量檢測(cè)，之后按照每個(gè)樣品的測(cè)序量要求，進(jìn)行相應(yīng)比例的混合，進(jìn)行Miseq測(cè)序。

通過(guò)利用QIIME軟件技術(shù)，依照序列的相似度方法把序列分為數(shù)個(gè)OTUs（operational taxonomic unit）。統(tǒng)計(jì)出每個(gè)測(cè)試樣品中OTU情況以及各個(gè)OTU中序列的個(gè)數(shù)。在Silva（Release115 http://www. arb-silva.de）數(shù)據(jù)庫(kù)中將序列進(jìn)行比對(duì)和物種分類。采用RDP classifier貝葉斯算法在97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行生物信息分類學(xué)分析，分別在phylum（門）和genus（屬）水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成，并對(duì)OTU進(jìn)行生態(tài)學(xué)分析，計(jì)算土壤Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)、物種豐富度Chaol指數(shù)等。

土樣樣品由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司應(yīng)用Illumina平臺(tái)的MiSeq進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤樣品的測(cè)序結(jié)果

表1 不同棉花品種土壤細(xì)菌DNA測(cè)序結(jié)果

通過(guò)對(duì)3種棉花土壤細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行測(cè)序，過(guò)濾掉樣品中低質(zhì)量的原始序列后，得到總數(shù)為65 470個(gè)的有效序列，共獲得55 577條讀數(shù)（reads），并在97%相似度下將其聚類為用于物種分類的OUT。由表1可知，晉棉7號(hào)的土壤中含有最多數(shù)量的OTUs，其次是轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)，中棉所12號(hào)OTUs數(shù)量最少；與晉棉7號(hào)相比，晉棉26號(hào)的土壤OTUs數(shù)量減少2.98%，中棉所12號(hào)土壤減少18.36%；3個(gè)棉花土樣共產(chǎn)生1 585個(gè)OTUs，其中，3個(gè)棉花品種共享1 124個(gè)OTUs，共享率達(dá)70.91%（圖1）。

2.2 土壤細(xì)菌的種類分析

在門水平上，3個(gè)棉花土壤共檢測(cè)到21個(gè)細(xì)菌門，除1個(gè)未被分類（unclassified）群體外，還有4個(gè)候選細(xì)菌門。其中，相對(duì)豐度較大的有變形菌門（Proteobacteria）、酸桿菌門（Acidobacteria）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、硝化螺菌門（Nitrospirae）、厚壁菌門（Firmicutes）、藍(lán)藻門（Cyanobacteria）等10個(gè)細(xì)菌門，占到3個(gè)處理各自土壤細(xì)菌總量的94.9%以上。不同相對(duì)豐度大于5%的主要優(yōu)勢(shì)種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，分別占總量的26.6%～29.2%，19.1%～22.6%，8.8%～11.9%，9.2%～10.8%，7.4%～9.2%，6.6%～8.7%。其中，晉棉26號(hào)獨(dú)有的種群為棲熱菌門（Deinococcus-Thermus，相對(duì)豐度0.059 6%），晉棉7號(hào)獨(dú)有的種群為WCHB1-60（相對(duì)豐度0.033%）。

在屬水平上，3種棉花土壤細(xì)菌共有相對(duì)豐度＞1%的優(yōu)勢(shì)屬數(shù)量19個(gè)，3個(gè)棉花品種中均有分布的優(yōu)勢(shì)種屬有12個(gè)。晉棉26號(hào)、晉棉7號(hào)土壤中優(yōu)勢(shì)屬的種類最多，均為15個(gè)；中棉所12號(hào)土壤中優(yōu)勢(shì)屬的種類最少，為14個(gè)（圖2）。每個(gè)品種皆有自己特有的種群，但相對(duì)豐度很小，其中，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)土壤細(xì)菌有Truepera，D05-2_ norank，Methylohalomonas，34P16_norank，Tepidibacter種群，相對(duì)豐度0.004%～0.060%，而晉棉7號(hào)土壤細(xì)菌有Aliihoeflea，PAUC26f_norank，Mucilaginibacter，Martelella，Nubsella，WCHB1-60_norank，Propionibacterium種群，相對(duì)豐度為0.012 5%～0.060 0%，中棉所12號(hào)有Parasegetibacter種群，相對(duì)豐度為0.02%等。

聚類分析結(jié)果表明，3個(gè)棉花品種可分為2大類，其中一類為傳統(tǒng)棉花品種中棉所12號(hào)，另一類為轉(zhuǎn)基因棉花品種晉棉26號(hào)及其非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號(hào)。表明轉(zhuǎn)基因晉棉26號(hào)土壤細(xì)菌種群結(jié)構(gòu)與親本晉棉7號(hào)沒有明顯差異（圖3）。

2.3 轉(zhuǎn)基因棉花土壤細(xì)菌的多樣性分析

試驗(yàn)結(jié)果表明（表2），轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)的Shannon指數(shù)低于其非轉(zhuǎn)基因親本晉棉7號(hào)，但高于傳統(tǒng)品種中棉所12號(hào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因棉花土壤細(xì)菌多樣性低于非轉(zhuǎn)基因；Chaol指數(shù)大小依次為晉棉7號(hào)＞晉棉26號(hào)＞中棉所12號(hào)，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因棉花豐富度低于非轉(zhuǎn)基因親本；Simpson指數(shù)依次為中棉所12＞晉棉26＞晉棉7，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26多樣性低于晉棉7號(hào)。

表2 不同棉花品種對(duì)土壤細(xì)菌多樣性的影響

3 結(jié)論與討論

本研究利用高通量的測(cè)序技術(shù)對(duì)土壤細(xì)菌16S rDNA進(jìn)行擴(kuò)增測(cè)序，結(jié)果表明，在相似度為97%的條件下，OTUs囊括了土壤細(xì)菌量的94%以上；而且測(cè)序還發(fā)現(xiàn)了很多未被分類細(xì)菌，表明高通量測(cè)序可以得到更為全面的微生物信息，很多未知細(xì)菌或未分類菌也能通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)。因此，利用高通量基因測(cè)序研究微生物是一種有效的方法。

轉(zhuǎn)基因作物主要通過(guò)根系分泌物或殘?bào)w進(jìn)入土壤生態(tài)環(huán)境，從而影響特定的微生物種群。HU等[14]采用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法進(jìn)行研究，結(jié)果表明，連續(xù)5 a種植轉(zhuǎn)基因棉花，其根際土壤功能細(xì)菌沒有受到明顯影響。LI等[15]研究發(fā)現(xiàn)，連續(xù)3 a種植轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤微生物沒有影響（傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法）。ZHANG等[16]采用PCR-DGGE進(jìn)行3 a田間研究，結(jié)果表明，NC33B棉花對(duì)土壤細(xì)菌、真菌、放線菌沒有影響。本研究表明，棉花土壤細(xì)菌的優(yōu)勢(shì)種群有變形菌門、酸桿菌門、放線菌門、浮霉菌門、綠彎菌門、擬桿菌門，轉(zhuǎn)基因晉棉26號(hào)有獨(dú)有的種群棲熱菌門，晉棉7號(hào)獨(dú)有的種群為WCHB1-60；在屬水平，轉(zhuǎn)基因棉花晉棉26號(hào)土壤細(xì)菌有Truepera，D05-2_norank，Methylohalomonas，34P16_ norank，Tepidibacter，而晉棉7號(hào)土壤細(xì)菌有Aliihoeflea，PAUC26f_norank，Mucilaginibacter，Martelella，Nubsella，WCHB1-60_norank，Propionibacterium，這些獨(dú)特的種群相對(duì)豐度都很低，沒有影響細(xì)菌的種群結(jié)構(gòu)。SINGH等[23]用RFLP-PCR檢測(cè)出轉(zhuǎn)Bt基因茄子土壤獨(dú)有藍(lán)藻細(xì)菌（Cyanobacteria）和擬桿菌（Bacteroidetes），而非轉(zhuǎn)基因茄子土壤中獨(dú)有β變形菌、綠屈撓菌屬、梭桿菌門和浮霉菌門，并沒有改變土壤細(xì)菌菌落結(jié)構(gòu)。但也有研究表明，連續(xù)種植轉(zhuǎn)基因棉花會(huì)對(duì)土壤細(xì)菌菌落產(chǎn)生影響[17-21]。因此，有關(guān)轉(zhuǎn)基因棉花對(duì)土壤微生物的影響需要建立多學(xué)科、多種方法、長(zhǎng)期定位進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，才能獲得更加有效準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)。

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Effects of Transgenic Cotton on Soil Bacteria Community

FANQiaolan1，2，LI Yongshan1，2，WANGHui1，2，XI Kaipeng1，2，XI Jilong1，2，SHI Jundong1，2，ZHANGJiancheng1，2
（1.Institute ofCotton，Shanxi Academy ofAgricultural Sciences，Yuncheng 044000，China；2.Yuncheng Academy ofAgricultural Sciences,Yuncheng 044000，China）

The experiement was conducted to evaluate the effects of transgenic cotton on soil bacterial community structure and diversity.Transgenic Bt cotton Jinmian 26 and its non-Bt parental line Jinmian 7,and traditional cultivar CRI 12 were used in long-term experiment site to evaluate the effects of transgenic cotton on soil bacterial community structure by high throughput sequencing method. High throughput sequencing analysis showed 1 585 OTUs were detected in soil bacterial communities.Twenty one phylum,one unclassified and 4 candidate bacteria were detected in soils.Dominant phylum were Proteobacteria,Acidobacteria,Actinobacteria, Planctomycetes,Chloroflexi,Bacteroidetes,Gemmatimonadetes,Nitrospirae/Firmicutes,Cyanobacteria,in all soils.Deinococcus-Thermus in transgenic Jinmian 26 soil and WCHB1-60 in non-Bt Jinmian 7 were found uniquely in phylum.Shannon index in Bt-soil bacteria was lower than non-Bt soil,and soil bacteria community structure was not affected by transgenic cotton.

transgenic cotton;soil;bacteria;community structure;high throughput sequencing

S154.38＋1

：A

：1002-2481（2017）07-1124-04

10.3969/j.issn.1002-2481.2017.07.21

2016-12-29

山西省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2014011029-2）；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31372143，30871601）

范巧蘭（1965-），女，山西夏縣人，助理研究員，主要從事植物保護(hù)和轉(zhuǎn)基因植物安全評(píng)價(jià)研究工作。李永山為通信作者。