葉思 李勁濤 蔡振海 汪楊俊琦 SaraKhodahemmati 趙維堅(jiān) 李紅霞 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(葉思、李勁濤、汪楊俊琦、Sara Khodahemmati、趙維堅(jiān)、曾毅)；522000 揭陽市人民醫(yī)院(蔡振海)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李紅霞、曾毅)

·技術(shù)方法·

潮汕地區(qū)食管癌血清標(biāo)本中HPV的抗體檢測

葉思 李勁濤 蔡振海 汪楊俊琦 SaraKhodahemmati 趙維堅(jiān) 李紅霞 曾毅

100124 北京工業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與生物工程學(xué)院病毒與藥理室(葉思、李勁濤、汪楊俊琦、Sara Khodahemmati、趙維堅(jiān)、曾毅)；522000 揭陽市人民醫(yī)院(蔡振海)；100052 北京，中國疾病預(yù)防控制中心病毒病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(李紅霞、曾毅)

目的 檢測潮汕地區(qū)食管癌患者血清中人乳頭瘤病毒(HPV)相關(guān)抗體的存在情況，為我國食管癌患者的監(jiān)測提供參考數(shù)據(jù)。方法 分別構(gòu)建包含HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7基因的pSecTag重組載體，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞后分別表達(dá)HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7的融合蛋白，以融合蛋白為抗原，用免疫酶法檢測76份食管癌患者血清及149份正常體檢人群血清中HPV的IgG抗體；用L1做抗原的ELISA法檢測相同樣本的血清。結(jié)果 使用免疫酶法，E6/E7融合蛋白做抗原在所有血清標(biāo)本中只有一份食管癌患者血清顯示免疫陽性；使用ELISA法，L1做抗原，76例食管癌患者中有37例檢測到抗體IgG陽性反應(yīng)，陽性率為48.7%，149例體檢人群中，79例有抗體IgG陽性反應(yīng)，陽性率為53.0%。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析二者無顯著性差異。結(jié)論 HPV相關(guān)抗體檢測方法尚不能作為食管癌的篩查工具，HPV感染的血清學(xué)檢測用于食管癌的診斷有待于進(jìn)一步的研究。

Fund programs: Beijing University of Technology School Fund (015000514314004)； State key Laboratory of Infectious Disease Prevention and Control of Autonomous Research Project (2012AA02A404); Beijing Natural Science Fund Projects (Z2015001201601)

目前，食管癌是我國高發(fā)的一種癌癥，多數(shù)患者臨床發(fā)現(xiàn)時(shí)已是中晚期，中晚期預(yù)后很差。針對(duì)食管癌的早期診斷方法進(jìn)展比較緩慢，血清學(xué)診斷預(yù)警癌癥是目前腫瘤診斷研究的熱點(diǎn)，食管癌血清學(xué)診斷方法尚無突破。由于我國部分食管癌有HPV的存在，HPV是其重要病因，因此可以探討HPV相關(guān)抗體的檢測是否可作為食管癌診斷的指標(biāo)。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道中均使用了ELISA法[1,2]，且大多以HPV的病毒樣顆粒為抗原來檢測HPV相關(guān)的IgG抗體。研究結(jié)果提示HPV抗體陽性者食管癌發(fā)病危險(xiǎn)性確實(shí)較高，但是HPV相關(guān)的血清抗體陽性率較低，約為23%左右[3,4]。為此，本研究借鑒EBV抗體可以預(yù)測鼻咽癌的檢測思路，將HPVE6/E7癌蛋白做抗原的免疫酶法運(yùn)用到食管癌血清中HPV相關(guān)抗體的檢測，同時(shí)也采用了病毒樣顆粒為抗原目前較為靈敏的酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)來檢測HPV相關(guān)抗體做對(duì)照，探討不同方法應(yīng)用于HPV相關(guān)腫瘤血清學(xué)檢測的可行性。

1 材料與方法

1.1 血清標(biāo)本來源 樣品來自潮汕地區(qū)食管癌患者血清76份及體檢人群血清149份。抽取食管癌患者以及體檢者全血4～5 ml，3 000 g離心3 min，取上清，-20 ℃冰保存?zhèn)溆谩５怯浕颊叩男彰?、年齡等基本信息，電子存檔。

1.2 真核表達(dá)載體的構(gòu)建 用內(nèi)切酶KpnⅠ和EcoRⅠ將pSecTag2B載體進(jìn)行雙酶切，回收切開的線性質(zhì)粒。將目的基因片段HPV16型E6/E7基因和HPV18型E6/E7基因與線性pSecTag2B載體連接，形成重組載體。將構(gòu)建成功的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5α，氨芐青霉素篩選后擴(kuò)增培養(yǎng)。用德國Qiagen試劑盒提取無內(nèi)毒素的質(zhì)粒DNA，備用。以重組質(zhì)粒為模板，用合成的引物擴(kuò)增目的片段，檢測載體是否構(gòu)建成功。

1.3 質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染及表達(dá)鑒定 用DMEM高糖培養(yǎng)基(10%FBS，1%PS)培養(yǎng)293細(xì)胞，37 ℃，5%CO2培養(yǎng)過夜。待達(dá)到60%～70%的細(xì)胞融合度后，換無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。分別將16優(yōu)化型、18優(yōu)化型重組質(zhì)粒及pSecTag2B空質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞中。培養(yǎng)4 h后，換含10%FBS的培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，停止細(xì)胞生長。收集細(xì)胞，制成細(xì)胞涂片。加20 μl 5%BSA到固定的細(xì)胞組織上，37 ℃孵育30 min。去掉多余BSA，加20 μl鼠抗myc標(biāo)簽蛋白的一抗到細(xì)胞上，37 ℃孵育50 min。去掉多余一抗，PBS洗細(xì)胞組織3遍，每遍3 min。加辣根酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG二抗，37 ℃孵育40 min。棄多余二抗，PBS洗4遍，每遍3 min。配制DAB顯色試劑，滴加到細(xì)胞組織上，顯色2～5 min。終止顯色反應(yīng)，鏡下觀察。

1.4 免疫酶法(IEMA)檢測 在76份食管癌患者血清和149份體檢人群血清標(biāo)本中，使用免疫酶鑒定為陽性表達(dá)的細(xì)胞為材料，BSA封閉30 min。取食管癌患者血清，稀釋5倍，滴30 μl到細(xì)胞組織上，37 ℃孵育1 h。加辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗人IgG二抗，37 ℃孵育30 min。加DAB顯色液，顯色2～5 min。顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.5 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 將所有樣品對(duì)應(yīng)微孔按順序編號(hào)，每孔設(shè)陰性對(duì)照2孔、陽性對(duì)照2孔、空白對(duì)照(不加樣品及酶標(biāo)試劑)1孔。在陰性孔中不加樣品，加50 μl水或PBS代替，在陽性孔中加50 μl試劑盒提供的陽性對(duì)照。在樣品孔中加先加40 μl樣品稀釋液，再加10 μl血清。用封板膜封住后37 ℃孵育30 min，將30倍的濃縮洗液加水稀釋至1倍工作液后備用。揭掉封板膜，棄孔中液體，每孔加滿洗液，靜置30 s后棄液體，重復(fù)5次，拍干。每孔加酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔不加，重復(fù)上述步驟。每孔加顯色劑A 50 μl，再加顯色試劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液50 μl，終止反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀檢測。

2 結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體構(gòu)建結(jié)果 由北京天一輝遠(yuǎn)生物科技有限公司合成引物，HPV16型E6/E7基因的片段大小為771 bp，HPV18型E6/E7基因片段大小為793 bp，兩目的片段擴(kuò)增結(jié)果如圖1。質(zhì)粒送公司測序鑒定，連接框架和準(zhǔn)確性均符合要求，說明成功構(gòu)建了HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7基因表達(dá)載體。

圖3 A： 免疫酶法檢測食管癌血清中HPV相關(guān)IgG抗體陽性反應(yīng)；B： 免疫酶法檢測食管癌血清中HPV相關(guān)IgG抗體陰性反應(yīng)Fig.3 A：The positive reaction for IgG in serum by immunoenzymatic method; B： The negative reaction for IgG in serum by immunoenzymatic method

圖1 HPV16E6/E7和HPV18E6/E7基因片段擴(kuò)增電泳鑒定Fig.1 Electrophoresis analysis of HPV16E6/E7 and HPV 18E6/E7 PCR amplified products

2.2 載體在真核細(xì)胞中的表達(dá)鑒定 由于pSecTag2B載體自帶myc標(biāo)簽，myc與HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7形成融合蛋白，用于檢測效果較好。通過免疫酶方法，采用抗myc標(biāo)簽蛋白的一抗檢測發(fā)現(xiàn)在兩個(gè)轉(zhuǎn)染了重組質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中均有強(qiáng)的棕褐色陽性反應(yīng)，而且陽性著色細(xì)胞比例非常高，而在未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的HEK293細(xì)胞中沒有陽性著色反應(yīng)，如圖2，說明在HEK293細(xì)胞中有myc標(biāo)記的融合蛋白的表達(dá)。結(jié)果表明，在本次實(shí)驗(yàn)中真核表達(dá)載體構(gòu)建成功且能在真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。

2.3 免疫酶法檢測血清中HPV抗體結(jié)果 在所有血清標(biāo)本中，用該方法只在一例食管癌患者血清中檢測到有HPV相關(guān)的IgG抗體陽性反應(yīng)，但陽性著色細(xì)胞比例較少，其他血清均沒有陽性著色反應(yīng)，如圖3。

2.4 利用病毒樣顆粒抗原的ELISA法檢測結(jié)果 ELISA方法操作簡單快速，成本低，可用于大規(guī)模血清學(xué)普查。本次試驗(yàn)利用ELISA試劑盒對(duì)血清進(jìn)行試驗(yàn)，本試劑盒是利用病毒狀顆粒作為抗原，陰性對(duì)照孔的OD值為0.002，則臨界值為0.152。凡是OD值大于0.152的樣品均定為HPV抗體IgG陽性反應(yīng)。經(jīng)檢測統(tǒng)計(jì)，食管癌患者組中抗體IgG陽性反應(yīng)的有37例，陽性率為48.7%；體檢人群中抗體IgG陽性反應(yīng)的有79例，陽性率為53.0%，見表1。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析食管癌患者和正常體檢人群HPV陽性率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P>0.05。

表1 ELISA法檢測結(jié)果Tab.1 Result of ELISA method

3 討論

有研究表明，部分頭頸部腫瘤(食管癌、喉癌、舌癌)及生殖系統(tǒng)腫瘤等的發(fā)生與HPV密切相關(guān)[5,6]。在不同人群中，經(jīng)過反復(fù)感染或者病毒整合血液中會(huì)持續(xù)表達(dá)相應(yīng)抗體，這些抗體表達(dá)的高低有可能會(huì)作為診斷指標(biāo)，對(duì)病毒感染和腫瘤發(fā)生進(jìn)行診斷。HPV血清學(xué)檢測結(jié)果既可提示既往有無感染，也可提示當(dāng)前有無感染，但是至今HPV很難在體外培養(yǎng)，也無合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，對(duì)其檢測主要依賴于形態(tài)學(xué)方法和分子生物學(xué)技術(shù)，且高水平的病毒基因表達(dá)都在上皮細(xì)胞外面[7]，這些使得HPV血清學(xué)發(fā)展相對(duì)滯后。目前已有研究發(fā)現(xiàn)HPV16 E6、E7血清抗體反應(yīng)與宮頸癌密切相關(guān)，HPV16 E6血清抗體有可能成為篩選宮頸癌高危人群的血清學(xué)標(biāo)志[8]。而對(duì)頭頸部腫瘤中HPV相關(guān)抗體檢測很少，對(duì)相關(guān)腫瘤與HPV抗體變化的關(guān)系分析更少。

研究發(fā)現(xiàn)ELISA與免疫酶法效果相似[2]，但是對(duì)于病毒相關(guān)腫瘤的診斷ELISA與免疫酶的特異性對(duì)不同病毒結(jié)果不同。為了探討血液中HPV相關(guān)抗體能否作為食管癌的診斷指標(biāo)，開展了本次研究。本研究225份血清標(biāo)本中，使用HPV16型E6/E7和HPV18型E6/E7融合蛋白作抗原的免疫酶法只在一例食管癌血清樣本中檢測到HPV相應(yīng)的IgG抗體陽性。此方法靈敏度較低，可能與我們之前檢測HPV陽性食管癌患者病毒拷貝數(shù)較低，表達(dá)較低有關(guān)。因此我們認(rèn)為現(xiàn)階段的免疫酶法不適合食管癌血清中HPV相關(guān)抗體的檢測，需要不斷地改進(jìn)提高靈敏度再進(jìn)行嘗試，以期達(dá)到理想效果。在以L1作抗原的ELISA法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果中，HPV血清陽性率在食管癌中為48.7%，在體檢人群中血清陽性率為53.0%，兩者的數(shù)據(jù)與相關(guān)報(bào)道基本一致[9]。且患者和正常體檢人群之間無明顯差異，也不能作為診斷指標(biāo)。而免疫酶法我們檢測發(fā)現(xiàn)，比例很低，與ELISA方法檢測差距較遠(yuǎn)。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測HPV在人群中的感染是普遍存在的，并能引起機(jī)體免疫反應(yīng)產(chǎn)生相應(yīng)的IgG抗體，這種病毒的普遍感染可能對(duì)人體健康產(chǎn)生影響，尤其是反復(fù)感染時(shí)對(duì)相應(yīng)腫瘤的發(fā)生可能會(huì)有促進(jìn)作用。但是，本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示不能通過HPV IgG抗體血清陽性檢測來對(duì)食管癌的發(fā)生進(jìn)行診斷，對(duì)其他類型抗體需要進(jìn)一步研究。目前免疫酶法HPV的血清學(xué)檢測也不能作為食管癌的篩查工具，可能由于食管癌感染HPV拷貝數(shù)不高，蛋白表達(dá)不高，相應(yīng)抗體產(chǎn)生滴度較低，因此用免疫酶法檢測相關(guān)抗體效果不好。而ELISA法即使能檢測到IgG抗體血清陽性，但食管癌患者和正常體檢人群HPV陽性率無顯著性差異，因此也不能作為食管癌的篩查工具。HPV感染的血清學(xué)檢測用于食管癌的診斷同樣有待于進(jìn)一步的研究，本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究分析食管癌血清中標(biāo)志物研究作參考。

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(本文編輯：陳培莉)

Detection of HPV antibodies in the serum specimens of esophageal cancer patients in Chaoshan region

Ye Si, Li Jintao, Cai Zhenhai, Wang Yangjunqi, Sara Khodahemmati, Zhao Weijian, Li Hongxia, Zeng Yi

Laboratory of Virology and Pharmocology, College of Life Science and Bioengineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China (Ye S, Li JT, Wang YJQ, Sara Khodahemmati, Zhao WJ, Zeng Y); People′s Hospital of Jieyang City, Jieyang 522000, China (Cai Zhenhai); State Key Laboratory for Infectious Disease Prevention and Control, National Institute for Viral Disease Control and Prevention, Beijing 100052, China (Li HX, Zeng Y)

Zeng Yi, Email:zengyicdc1@gmail.com；Li Jingtao, Email:ljt2000593@163.com

Objective To detect the presence of HPV associated antibodies in the serum of patients diagnosed with esophageal cancer in Chaoshan region and to provide data that could possibly be used as reference for the monitoring of patients with esophageal cancer. Methods The pSecTag recombinant vectors containing the HPV16 E6/E7 and HPV18 E6/E7 genes were constructed respectively to express HPV16 E6/E7 and HPV18 E6/E7 fusion proteins in 293 cell line after transfecting the cell line. Immunoenzymatic method was employed with the fusion proteins as antigen to detect IgG antibody against HPV in serum of 76 esophageal cancer patients and 149 normal persons undergoing health checkup. In addition, the same sera were assessed by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) method using L1 as antigen. Results Only one esophageal cancer patient’s serum presented as positive for IgG by immunoenzyme technique when E6/E7 was used as antigen. However, when the L1 was used as antigen in ELISA assay, 37 of the 76 cases of esophageal cancer patients (48.7%) were HPV antibody-positive. Among the 149 health checkup persons, 79 (53.0%) were HPV antibody-positive. No significant difference was found between the two groups (P>0.05). Conclusion HPV related antibodies in the serum remain inapplicable as a screening tool for serological detection of esophageal cancer. Further research is needed to understand the role and diagnostic applications of HPV infection in esophageal cancer.

Esophageal neoplasms; Papillomavirus human; Enzyme-linked immunosorbent assay

曾毅，Email: zengyicdc1@gmail.com；李勁濤，Email:ljt2000593@163.com

10.3760/cma.j.issn.1003-9279.2017.03.018

食管腫瘤；乳頭瘤狀病毒,人；免疫酶法；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

北京工業(yè)大學(xué)校級(jí)基金(015000514314004)；傳染病預(yù)防控制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自主研究重點(diǎn)課題(2011SKLID103);北京市自然科技基金面上項(xiàng)目(Z2015001201601)

2016-05-11)