曹治家 張家彬 李翠云 吳英松

DA8600測(cè)序平臺(tái)對(duì)EGFR基因檢測(cè)最低DNA用量的探討

曹治家1張家彬1李翠云1吳英松2

目的 基于DA8600測(cè)序平臺(tái)，探討AmpliSeq建庫(kù)方法檢測(cè)EGFR基因突變所需最低樣本DNA用量，以評(píng)估下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）檢測(cè)技術(shù)的性能。方法本研究選擇10例EGFR突變的石蠟包埋組織樣本，分別取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng樣本DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，使用DA8600半導(dǎo)體測(cè)序儀進(jìn)行檢測(cè)，并比較檢測(cè)結(jié)果。結(jié)果10 ng和20 ng DNA用量均可全部準(zhǔn)確檢出EGFR基因突變；5 ng DNA用量準(zhǔn)確檢出7例EGFR基因突變，1例文庫(kù)質(zhì)量不合格無(wú)法進(jìn)行測(cè)序，1例無(wú)法檢出EGFR突變，1例測(cè)序數(shù)據(jù)量不足檢測(cè)失??；1 ng DNA用量構(gòu)建文庫(kù)全部質(zhì)量不合格，無(wú)法進(jìn)行測(cè)序。結(jié)論通過(guò)對(duì)10例樣本不同DNA用量構(gòu)建文庫(kù)的檢測(cè)結(jié)果分析，說(shuō)明10 ng DNA即可采用AmpliSeq建庫(kù)方法在DA8600半導(dǎo)體測(cè)序儀進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。

DA8600；EGFR基因突變；DNA測(cè)序用量

DA8600型基因測(cè)序儀是新一代的高通量測(cè)序產(chǎn)品，基于半導(dǎo)體技術(shù)，通過(guò)實(shí)時(shí)檢測(cè)DNA聚合反應(yīng)時(shí)自然產(chǎn)生的H+離子流pH值變化獲得堿基序列信息，無(wú)需激發(fā)光源和光學(xué)檢測(cè)設(shè)備，無(wú)需焦磷酸酶化學(xué)級(jí)聯(lián)，無(wú)需標(biāo)記熒光染料和化學(xué)發(fā)光的配套試劑，具有檢測(cè)速度快、運(yùn)行成本低、操作自動(dòng)化程度高、實(shí)驗(yàn)靈活性好等特點(diǎn)［1-3］，在婦嬰生育保健領(lǐng)域，尤其是無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查、新生兒遺傳病篩查、胚胎移植前染色體異常/遺傳病檢測(cè)等方面帶來(lái)了新的機(jī)遇［4-5］。

EGFR基因位于7p12，編碼酪氨酸激酶型受體。EGFR的酪氨酸激酶功能區(qū)由外顯子18～24編碼。EGFR與配體結(jié)合形成二聚體激活細(xì)胞內(nèi)的激酶通路，進(jìn)一步誘導(dǎo)下游通路的磷酸化，誘導(dǎo)細(xì)胞增殖。腺癌EGFR基因突變的發(fā)生率在亞洲人群達(dá)到50%，在不吸煙者、女性以及非粘液性腫瘤中發(fā)生率更高［6-7］。迄今為止發(fā)現(xiàn)的EGFR基因突變主要位于外顯子18～21，尤其是G719S和L861Q，與腫瘤細(xì)胞對(duì)酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinases inhibitors，TKI）的敏感度密切相關(guān)［8-9］。EGFR酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）能特異性地抑制具有EGFR基因突變的非小細(xì)胞肺癌的生長(zhǎng)，改善預(yù)后［10］。因此，《非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南（中國(guó)版）》［11］推薦，在使用酪氨酸激酶抑制劑治療前，肺癌患者進(jìn)行EGFR基因的突變檢測(cè)。

目前，應(yīng)用二代測(cè)序技術(shù)檢測(cè)EGFR基因突變的方法有多種。但在采用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)腫瘤樣本進(jìn)行檢測(cè)過(guò)程中，經(jīng)常面臨著樣本量少、數(shù)據(jù)量大等挑戰(zhàn)。本研究針對(duì)臨床檢測(cè)過(guò)程中組織樣本獲取困難、樣本量少的問(wèn)題，通過(guò)DA8600測(cè)序平臺(tái)，采用AmpliSeq方法，分別對(duì)10例EGFR突變石蠟包埋組織樣本進(jìn)行DNA建庫(kù)用量的梯度檢測(cè)，旨在探討二代測(cè)序檢測(cè)方法所需最小樣本DNA用量，為臨床上檢測(cè)EGFR基因突變提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

選取10例EGFR基因突變石蠟包埋組織樣本［采用Sanger測(cè)序法和下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）技術(shù)驗(yàn)證其突變類型及頻率］，具體突變型別見(jiàn)表1。

1.2 主要試劑和儀器

1.2.1 主要試劑

環(huán)保脫蠟劑（廣州和實(shí)生物技術(shù)有限公司）；QIAamp DNA FFPE Tissue KIT（50）（Qiagen公司，德國(guó)）；Qubit dsDNA HS Assay Kit，Nuclease-Free Water，Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0，Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit，Ion PITMHi-QTMSequencing 200 Kit（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；氫氧化鈉溶液（Sigema公司，美國(guó)）；無(wú)水乙醇（分析純）（廣州化學(xué)試劑廠）。

1.2.2 主要儀器

K30B恒溫金屬?。ê贾輮W盛儀器有限公司）；5430小型高速離心機(jī)（Eppendorf公司，德國(guó)）；Qubit?3.0熒光定量?jī)x，ABI7500熒光定量PCR儀，Ion One TouchTM2.0 System（Thermo Fisher Scientific公司，美國(guó)）；DA8600測(cè)序儀（中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司）。

表1 樣本EGFR基因突變型別Table 1 The EGFR gene mutants of samples

1.3 方法

1.3.1 樣本DNA提取

采用環(huán)保脫蠟劑對(duì)石蠟包埋組織樣本進(jìn)行脫蠟處理，按照QIAamp DNA FFPE Tissue KIT說(shuō)明書提取樣本DNA，并采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行定量，然后每個(gè)樣本稀釋到5 ng/μL。

1.3.2 文庫(kù)構(gòu)建

每個(gè)樣本分別取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng，按照Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。經(jīng)過(guò)磁珠純化后采用50 μL洗脫液進(jìn)行洗脫，得到文庫(kù)樣本。

1.3.3 文庫(kù)定量

取2 μL文庫(kù)樣本，采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行定量，定量濃度為Too Low的文庫(kù)質(zhì)量不合格。根據(jù)定量濃度把合格文庫(kù)等質(zhì)量混合，混合采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x進(jìn)行定量，并稀釋到100 pmol/L，然后進(jìn)行模板制備。

1.3.4 模板制備與富集

取 8 μL 混合文庫(kù)和 200 μL ISP 磁珠，按照Ion PITMHi-QTMOT2 Reagents 200 kit說(shuō)明書進(jìn)行模板制備；然后離心回收制備好的模板，通過(guò)Ion One TouchTMES的磁珠技術(shù)分離富集得到陽(yáng)性模板。

1.3.5 上機(jī)測(cè)序

在富集的陽(yáng)性模板中，加入質(zhì)控模板，按照Ion PITMHi-QTMSequencing 200 Kit說(shuō)明書進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.3.6 結(jié)果分析

利用測(cè)序儀配套服務(wù)器和軟件進(jìn)行序列比對(duì)和分析。

表2 樣本DNA提取濃度Table 2 The concentration of extracted samples DNA

運(yùn)行Coverage Analysis插件，得到各樣本“數(shù)據(jù)量”、“平均深度”等信息。

運(yùn)行Variant Caller插件，得到樣本的分析結(jié)果。在“Allele Name”列中篩選出樣本對(duì)應(yīng)的COSMIC ID，該行信息即為對(duì)應(yīng)位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果。

表3 構(gòu)建文庫(kù)的DNA樣本用量Table 3 The amount of samples DNA in library construction

2 結(jié)果

2.1 樣本DNA提取結(jié)果

采用QIAamp DNA FFPE Tissue KIT試劑盒對(duì)10例石蠟包埋組織樣本進(jìn)行DNA提取，100 μL洗脫液進(jìn)行洗脫，Qubit?3.0熒光定量?jī)x定量結(jié)果如表2。

2.2 文庫(kù)構(gòu)建樣本用量

按照Ion AmpliSeqTMLibrary Kit 2.0試劑盒說(shuō)明書，分別取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng的樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建，各樣本用量如表3。

2.3 文庫(kù)定量結(jié)果

文庫(kù)構(gòu)建完成后，采用Qubit?3.0熒光定量?jī)x定量，結(jié)果如表4，1 ng DNA構(gòu)建的文庫(kù)濃度均為Too Low；5 ng DNA構(gòu)建的文庫(kù)有1例為Too Low，其他在 0.084～0.783 ng/μL；10 ng DNA 構(gòu)建的文庫(kù)濃度在 0.367～1.14 ng/μL；20 ng DNA 構(gòu)建的文庫(kù)濃度在0.707～1.31 ng/μL。文庫(kù)濃度為Too Low的不合格，不能進(jìn)行進(jìn)一步測(cè)序。把合格的文庫(kù)進(jìn)行混樣，混樣體積如表4，混合后樣本濃度為0.402 ng/μL。

2.4 測(cè)序結(jié)果

按照試劑盒說(shuō)明書運(yùn)行分析插件Variant Caller和 Coverage Analysis，檢測(cè)結(jié)果如表5，5 ng DNA構(gòu)建的文庫(kù)上機(jī)檢測(cè)9例，2例檢測(cè)結(jié)果不符合：FL-5-5樣本COSM6224位點(diǎn)的“Frequency”為2.2%（＜5%），判定為野生型；FL-7-5樣本“數(shù)據(jù)量”小于0.2M，“平均深度”小于1000，樣本數(shù)據(jù)量不足，檢測(cè)失??；10 ng DNA構(gòu)建的文庫(kù)上機(jī)檢測(cè)10例，“數(shù)據(jù)量”均大于0.2M，“平均深度”均大于1000，“突變頻率”均大于5%，“覆蓋度”均大于2500，檢測(cè)結(jié)果全部符合要求；20 ng DNA構(gòu)建的文庫(kù)上機(jī)檢測(cè)10例，“數(shù)據(jù)量”均大于0.2M，“平均深度”均大于1000，“突變頻率”均大于5%，“覆蓋度”均大于2500，檢測(cè)結(jié)果全部符合要求。

2.5 檢測(cè)結(jié)果匯總

根據(jù)文庫(kù)構(gòu)建及上機(jī)檢測(cè)結(jié)果，比較不同DNA建庫(kù)用量的檢出率，如表6，1 ng DNA量建庫(kù)合格率為0，無(wú)法進(jìn)行上機(jī)測(cè)序；5 ng DNA建庫(kù)合格率為90%，測(cè)序結(jié)果符合率為77.78%；10 ng DNA建庫(kù)合格率為100%，測(cè)序結(jié)果符合率為100.00%；20 ng DNA建庫(kù)合格率為100%，測(cè)序結(jié)果符合率為100.00%。

表4 文庫(kù)定量及混樣Table 4 Quantitative and mixed the library

表5 樣本測(cè)序結(jié)果Table 5 The sequencing results of samples

表6 不同DNA用量檢出率Table 6 The detection rate of different amount of DNA samples

3 討論

2015年美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬頒布“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”（precision medicine initiative，PMI），“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”被《Nature》雜志列為2015年度十大科學(xué)事件之一［12］?；驕y(cè)序技術(shù)作為“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”的核心飛速發(fā)展，NGS作為基因組學(xué)領(lǐng)域中增長(zhǎng)最快的子行業(yè)，成為測(cè)序市場(chǎng)的主流。半導(dǎo)體測(cè)序技術(shù)是目前市場(chǎng)上主流的測(cè)序技術(shù)之一，DA8600測(cè)序儀是中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司與Life Technologies公司合作開(kāi)發(fā)的半導(dǎo)體測(cè)序系統(tǒng)，該系統(tǒng)采用天然核苷酸和聚合酶，無(wú)需激發(fā)光源、熒光標(biāo)記、焦磷酸酶化學(xué)級(jí)聯(lián)以及照相系統(tǒng)，而是通過(guò)直接實(shí)時(shí)檢測(cè)測(cè)序時(shí)產(chǎn)生的氫離子濃度，有效提高堿基判讀準(zhǔn)確性［13-15］。測(cè)序反應(yīng)開(kāi)始5 min后即開(kāi)始得到測(cè)序數(shù)據(jù)，測(cè)序芯片反應(yīng)微孔大于160M，產(chǎn)出數(shù)據(jù)量可達(dá)10G。相比一代測(cè)序具有檢測(cè)快速，通量高，能同時(shí)檢測(cè)出多種不同的突變型別等優(yōu)勢(shì)［1-2，16］。本研究旨在探討二代測(cè)序檢測(cè)方法所需樣本DNA用量，為臨床上檢測(cè)EGFR基因突變提供參考。

有文獻(xiàn)顯示，來(lái)源于腫瘤FFPE樣本的10 ng DNA即可采用Ampliseq建庫(kù)方法進(jìn)行基因突變檢測(cè)［17］。本研究中對(duì)10例EGFR基因突變的肺癌石蠟包埋組織樣本分別取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并對(duì)文庫(kù)合格樣本進(jìn)行測(cè)序［18-20］：采用1 ng DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的10例樣本，全部文庫(kù)質(zhì)量不合格，無(wú)法進(jìn)行正常測(cè)序；采用5 ng DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建10例樣本，1例樣本文庫(kù)質(zhì)量不合格，1例樣本數(shù)據(jù)量不足，1例檢測(cè)結(jié)果判定為野生型；采用10 ng DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的10例樣本，檢測(cè)結(jié)果均與原檢測(cè)結(jié)果相符合；采用20 ng DNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建的10例樣本，檢測(cè)結(jié)果均與原檢測(cè)結(jié)果相符合。上述研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相符合，說(shuō)明來(lái)源于腫瘤FFPE樣本的10 ng DNA即可采用Ampliseq建庫(kù)方法在DA8600測(cè)序平臺(tái)上進(jìn)行EGFR基因突變檢測(cè)。這對(duì)于臨床上組織樣本獲取困難、樣本量少的問(wèn)題具有重要現(xiàn)實(shí)意義，即可實(shí)現(xiàn)樣本基因突變檢測(cè)的準(zhǔn)確性，又可有效提高樣本利用率，為患者的診斷和治療提供更多的參考信息。

NGS測(cè)序技術(shù)相較一代測(cè)序和熒光PCR法具有通量高、靈敏度高、數(shù)據(jù)量大、樣本用量少等優(yōu)勢(shì)，是未來(lái)臨床基因檢測(cè)的主力。但NGS技術(shù)作為新興行業(yè)，技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)還不完善，臨床應(yīng)用還不廣泛。因此，本研究組下一步將對(duì)DA8600測(cè)序平臺(tái)檢測(cè)EGFR基因突變的頻率檢測(cè)范圍進(jìn)行研究，以期進(jìn)一步了解NGS技術(shù)的檢測(cè)性能，為臨床中腫瘤靶向基因的檢測(cè)提供參考，提高腫瘤的分子診斷以及個(gè)體化診療水平。

［1］Life.Ion Chef System［EB/OL］.http：//www.thermofisher.com/cn/zh/home/life-science/sequencing/nextgeneration-sequencing/ion-torrent-next-generation-sequencing-workflow/prepare-template/ion-torrent-nextgeneration-sequencing-ion-chef-system.html.2015-07-28/2016-09-07.

［2］中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司.測(cè)序儀［EB/OL］.http：//www.daangene.com.cn/product/info.aspx?MID=02060206.2014-12-17/2016-09-07.

［3］Salto-Tellez M，de Castro DG.Next generation sequencing：a change of paradigm in molecular diagnostic validation［J］.J Pathol，2014，234（1）：5-10.

［4］李晟，程福東，孫嘯.高通量DNA測(cè)序技術(shù)與基本診斷及預(yù)防［J］.生物醫(yī)學(xué)工程與臨床，2016，20（2）：210-215.

［5］鮑蕓，肖艷群，王華梁.高通量測(cè)序技術(shù)在無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查中的臨床應(yīng)用及研究進(jìn)展［J］.檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)，2016，31（6）：541-545.

［6］Wu K，Huang RS，House L，et al.Next-generation sequencing for lung cancer［J］.Future Oncol，2013，9（9）：1323-1336.

［7］Joseph Schlessinger.Cell signaling by receptor tyrosine kinases［J］.Cell，2000，103：211-225.

［8］Arcila ME，Nafa K，Chaft JE，et al.EGFR exon 20 insertion mutations in lung adenocarcinomas：prevalence，molecular heterogeneity，and clinicopathologic characteristics［J］.Mol Cancer Ther，2013，12（2）：220-229.

［9］Su KY，Chen HY，Li KC，et al.Pretreatment epidermal growth factor receptor（EGFR）T790M mutation predicts shorter EGFR tyrosine kinase inhibitor response duration in patients with non-small-cell lung cancer［J］.J Clin Oncol，2012，30（4）：433-440.

［10］Yu JY，Yu SF，Wang SH，et al.Clinical outcomes of EGFR-TKI treatment and genetic heterogeneity in lung adenocarcinoma patients with EGFR mutations on exons 19 and 21［J］.Chin J Cancer，2016，35（30）：1-10.

［11］NCCN.非小細(xì)胞肺癌臨床實(shí)踐指南（中國(guó)版）［EB/OL］.http：//www.nccn.org.2016-01-25/2016-09-07.

［12］生物探索.Nature：2015年度十大科學(xué)事件出爐［EB/OL］.http：//www.biodiscover.com/news/research/124778.html.2015-12-13/2016-09-07.

［13］Golan D，Medvedev P.Using state machines to model the ion torrent sequencing process and to improve read error rates［J］.Bioinformatics，2013，29（13）：344-351.

［14］Parson W，Strobl C，Huber G，et al.Evaluation of next generation mtGenome sequencing using the Ion Torrent Personal Genome Machine（PGM）［J］.Forensic Sci Int Genet，2013，7（5）：543-549.

［15］劉宇軒，張文瓊，黃代新.測(cè)序新技術(shù)Ion Torrent PGM及其法醫(yī)學(xué)應(yīng)用［J］.中國(guó)法醫(yī)學(xué)雜志，2015，30（1）：52-55.

［16］廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司.產(chǎn)品中心［EB/OL］.http：//www.daruibiotech.com/products/pro.aspx?typename=%E9%AB%98%E9%80%9A%E9%87%8F%E6%B5%8B%E5%BA%8F%E5%B9%B3%E5%8F%B0.2015-05-18/2016-09-07.

［17］Peng Fang，Zhenyu Yan，Paul Labrousse，et al.Oncomine focus assay：Simultaneous detection of clinically relevant hotspot mutations，CNVs，and gene fusions in 52 oncogenes relevant to solid tumors［J］.Cancer Research，2016，76（14）：1397.

［18］Pop LA，Puscas E，Pileczki V，et al.Quality control of ion torrent sequencing library［J］.Cancer Biomark，2014，14（2）：93-101.

［19］Caboche S，Audebert C，Lemoine Y，et al.Comparison of mapping algorithms used in high-throughput sequencing：application to ion torrent data［J］.BMC Genomics，2014，15（1）：264.

［20］Lin MT，Mosier SL，Thiess M，et al.Clinical validation of KRAS，BRAF，and EGFR mutation detection using next-generation sequencing［J］.Am J Clin Pathol，2014，141（6）：856-866.

The lowest amount of DNA inEGFRgene sequencing by DA8600 sequencing platform

CAO Zhijia1，ZHANG Jiabin1，LI Cuiyun1，WU Yingsong2
（1.Guangzhou Darui Biotechnology Co.LTD，Guangzhou，Guangdong，China，510665；2.School of Laboratory Medicine and Biotechnology，School of Biotechnology，Southern Medical University，Guangzhou，Guangdong，China，510515）

Objective To discuss the minimum dosage of DNA in EGFR mutations detection by Ampliseq library construct method on DA8600 sequencing platform,and assess its feasibility in clinical molecular diagnostic applications. Methods 10 cases of paraffin-embedded tissue samples of EGFR mutations were selected,and 1 ng,5 ng,10 ng and 20 ng DNA were taken to construct libraries and then sequenced by DA8600,respectively. Results All the EGFR mutations in 10 samples could be detected while the libraries were constructed by 10 ng and 20 ng DNA;7 EGFR mutations could be detected while the libraries were constructed by 5 ng DNA;1 EGFR mutation couldn't be sequenecd because of substandard library;1 EGFR mutation couldn't be detected;and 1 EGFR mutation had too less sequencing data to analyze.And all the samples couldn't be sequenced because of the substandard libraries which were constructed by 1 ng DNA. Conclusion Using AmpliSeq library construct method,10 ng DNA is enough for EGFR mutation detection in DA8600 sequencing platform.

DA8600;EGFR mutations;DNA sequencing dosage

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用型專項(xiàng)資金（2015B020233009）；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目應(yīng)用型專項(xiàng)資金（2015B020233009）

1.廣州市達(dá)瑞生物技術(shù)股份有限公司，廣東，廣州510665

2.南方醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)與生物技術(shù)學(xué)院，廣東，廣州510515

吳英松，E-mail：wg@smu.edu.cn