王昶，賀春貴，張麗娟，楊曉明*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州 730070)

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豌豆抗豌豆象育種及其綜合防治研究進展

王昶1，賀春貴2，張麗娟1，楊曉明1*

(1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院作物研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學院，甘肅 蘭州 730070)

豌豆是重要的豆科經(jīng)濟作物，世界范圍內(nèi)均有種植，因其營養(yǎng)價值高深受人們喜愛。豌豆象是嚴重危害豌豆的害蟲，全球普遍發(fā)生。豌豆象幼蟲可蛀食籽粒超過50%的子葉部分，導致籽?？瞻T，發(fā)芽率降低，品質(zhì)變差，商品價值喪失。豌豆象已成為嚴重制約豌豆產(chǎn)業(yè)健康持續(xù)發(fā)展的因素之一。豌豆栽培種中尚未發(fā)現(xiàn)可遺傳的豌豆象抗性資源，然而在豌豆近緣野生種中發(fā)現(xiàn)了抗性資源，遺傳研究表明3對隱性基因控制豆象抗性。α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor，α-AI)和豌豆neoplastic pod(Np)基因突變體植株可有效減輕豌豆象危害。豌豆轉(zhuǎn)基因抗蟲育種雖然已獲成功，但由于安全性問題，目前唯一有效的防治方法仍然是化學藥劑的使用。為了解和掌握豌豆象最新研究前沿動態(tài)，促進豌豆象有效防治，本研究從豌豆象、豌豆抗豆象及豌豆象綜合防治等3方面研究進展進行了綜述?；诖?，指出我國目前研究中存在的問題，并提出豌豆象、豌豆抗豆象育種及其綜合防治領(lǐng)域未來的研究重點和方向。

豌豆；豌豆象；α淀粉酶抑制劑；Np突變體；抗豆象基因；防治

豌豆(Pisumsativum)為一年生攀援草本植物，自花授粉，二倍體(2n=2x=14)，屬豆科(Fabaceae)，世界范圍內(nèi)均有種植，是世界第四大豆類作物[1]。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計數(shù)據(jù)庫(FAOSTAT)2014年數(shù)據(jù)[2]顯示，世界干豌豆種植面積686.8萬hm2，產(chǎn)量1133.3萬t，主要生產(chǎn)國有加拿大、中國、印度、法國、澳大利亞。我國2014年干豌豆種植面積90.7萬hm2，產(chǎn)量157.5萬t，居世界第二位，僅次于加拿大。豌豆富含蛋白質(zhì)和淀粉，是人類重要的食物來源，動物的優(yōu)質(zhì)飼料[3]。因其特殊的固氮效應(yīng)，豌豆在輪作倒茬，改良土壤[4]，改善生態(tài)環(huán)境及農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展等方面發(fā)揮著重要作用。

豌豆象(Bruchuspisorum)屬鞘翅目(Coleoptera)，豆象科(Bruchidae)，是危害豌豆的昆蟲中具有經(jīng)濟重要性的害蟲之一[5-6]，豌豆象在世界幾乎所有豌豆種植區(qū)均有發(fā)生[7]。豌豆象是澳大利亞豌豆生產(chǎn)中最重要的害蟲，其造成的產(chǎn)量損失可達40%[8]。在埃塞俄比亞豌豆象嚴重威脅豌豆生產(chǎn)，每年導致60%的產(chǎn)量損失[9]。據(jù)推測豌豆象在我國是抗戰(zhàn)時期隨著侵華日軍馬料傳入，此后由于濟荒調(diào)運糧食傳播蔓延開來[10]。20世紀50年代在江蘇北部[10]、陜西中部[11]、60年代在甘肅武威[12]、80年代在寧夏[13]、90年代在甘肅定西[14]等地豌豆象猖狂發(fā)生，給農(nóng)戶造成了嚴重的經(jīng)濟損失，一度導致豌豆播種面積銳減?！笆濉逼陂g，國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系對我國豌豆象的發(fā)生危害作了系統(tǒng)調(diào)查，發(fā)現(xiàn)豌豆象普遍發(fā)生，危害率在1%～85%之間，已嚴重制約了我國豌豆產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展，為此，國家食用豆體系將豌豆象的防控列為重點任務(wù)，開展了大量工作，取得了良好的效果。為了更好地掌握國內(nèi)外研究動態(tài)和未來研究方向，本研究就豌豆抗豆象育種及其綜合治理方面國內(nèi)外研究進展進行綜述和展望，以期為豌豆抗蟲品種的培育和豌豆象綜合治理提供參考和指導。

1 豌豆象研究進展

1.1 分布

豌豆象在世界廣泛分布。豌豆象是和豌豆在長期協(xié)同進化過程中發(fā)展而來，中東肥沃新月地區(qū)(fertile Crescent)是其起源中心。由于人類的活動以及全球氣候變暖等原因，豌豆象傳播蔓延迅速，目前已在世界除南極洲外的其余六大洲發(fā)生[7](圖1)。據(jù)文獻報道，美國、智利[15-16]、西班牙、葡萄牙、塞爾維亞、中國[17]、南非和澳大利亞[18]豌豆象發(fā)生普遍，并且是豌豆生產(chǎn)中最難防治的害蟲之一[19-20]。

圖1 豌豆象的世界分布Fig.1 Map of pea weevil (B. pisorum) distribution in the world 綠點代表該地區(qū)豌豆象發(fā)生。Green points indicate the districts of pea weevil occurrence. 來源：國際農(nóng)業(yè)和生物科學中心(CABI)的植物智慧計劃 (2014)。 Source: Plantwise from CABI(2014).

1.2 生物學特性

豌豆象一年發(fā)生1代，春天氣溫回升至16～20 ℃時，豌豆象成蟲從樹木、樹葉、籬笆、雜物、倉庫縫隙、豆粒內(nèi)等越冬場所出現(xiàn)。豌豆象飛翔能力強，可飛越5 km遠[21]。田間豌豆花開時成蟲飛往田間采食花粉、花蜜。豌豆象雄蟲冬眠后性成熟，但雌蟲需要采食豌豆花粉后才能成熟[22]。有報道雌性豆象也采食其他非寄主植物的花粉[22-23]，但更多學者認為豌豆是豌豆象所需花粉的唯一來源。雌性豆象到達豌豆田2～2.5周后開始產(chǎn)卵，第一次選擇將卵產(chǎn)在花朵即將凋謝的鮮嫩豆莢上，其后選擇任意大小的豆莢[21]，但更傾向于在長度為10～20 mm豆莢表面產(chǎn)卵[8]，但從不把卵產(chǎn)在豌豆干籽粒上[24]。雌蟲產(chǎn)卵15～140粒，卵橢圓形、黃色，21 d左右成熟，孵化前兩天在卵末端出現(xiàn)黑色的小點，幼蟲孵化后在豆莢壁咬食一個大約0.2 mm的洞，穿過豆莢壁和種皮，蛀入未成熟的豆粒內(nèi)部。盡管幾頭幼蟲可以同時侵染一粒豌豆，但最終只有一頭能夠成活，并且完成生活史[25]。幼蟲以子葉為食，經(jīng)4～8周的時間，完成1～4齡幼蟲的發(fā)育后在籽粒中化蛹，蛹期持續(xù)12～14 d[26]后羽化為成蟲。豌豆象危害后在種子外部不易觀察，但仔細檢查會發(fā)現(xiàn)一個圓形的小窗口，其內(nèi)是蛹或成蟲，受到擾動或條件適宜時成蟲從圓形窗口飛出，在種子上形成一個直徑3 mm左右的洞口。

1.3 危害特性

豌豆象的危害主要發(fā)生在幼蟲時期蛀食豌豆子葉造成。豌豆象單主寄生，危害豌豆，有學者認為可危害蠶豆(Viciafaba)和其他作物[27]，不過后來得以糾正。豌豆象世界范圍內(nèi)的危害率為10%～90%[28]。豌豆象的危害主要發(fā)生在幼蟲時期(1～4齡)，幼蟲能夠蛀食籽粒30%～40%的子葉[29]，收獲后2～3個月可蛀食超過50%的子葉[30]，豌豆象幼蟲發(fā)育到4齡時對籽粒產(chǎn)生的危害最大[31]。

1.4 豌豆象的寄主選擇性

植食性昆蟲通過植物釋放的揮發(fā)性化學物質(zhì)作為信息物質(zhì)尋找定位寄主植物[32-33]，昆蟲通過感官系統(tǒng)基于揮發(fā)性物質(zhì)和接觸-化學感應(yīng)來評判寄主植物是否適合取食和產(chǎn)卵[34]，而昆蟲的取食和產(chǎn)卵行為可激發(fā)植物信息物質(zhì)的釋放[35]。

豌豆象在長期協(xié)同進化過程中同豌豆形成了相互適應(yīng)機制。豌豆象通過感知豌豆的揮發(fā)物來判斷、鑒別后選擇其作為寄主植物進而完成取食、交配、產(chǎn)卵等一系列生命活動。豌豆各物候期揮發(fā)性物質(zhì)鑒定主要為萜烯類(terpenes)和綠葉揮發(fā)物(green leaf volatiles，GLVs)，但在不同物候期釋放的揮發(fā)性物質(zhì)的種類和數(shù)量不同[36]。豌豆在營養(yǎng)生長和開花階段釋放的揮發(fā)物濃度最高[37]，花期釋放的主要是萜烯類化合物，如α和β萜烯，這些單萜烯類物質(zhì)可高度吸引甲蟲。Ceballos等[36]通過Y型嗅覺儀測定發(fā)現(xiàn)豌豆花揮發(fā)物可吸引豌豆象成蟲。嗅覺偏愛指數(shù)(olfactometric-preference index，OPI)反映了植物揮發(fā)性物質(zhì)對昆蟲刺激的效應(yīng)，即昆蟲對揮發(fā)性物質(zhì)的偏好程度。Ceballos等[36]通過嗅覺測定獲得的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成OPI，發(fā)現(xiàn)豌豆象雌性和雄性成蟲均偏愛豌豆花和莢的揮發(fā)物，但雌性表現(xiàn)出更強的偏好。觸角電位圖(electroantennography，EAG)測定表明，與雄性豆象(1.02 mV)相比，雌性豆象(1.35 mV)對豆莢揮發(fā)性物質(zhì)表現(xiàn)出更大的EAG響應(yīng)[36]。這可能是因為雌性昆蟲需要找到適合的寄主為其后代提供更好的食物和棲居環(huán)境[38]。

2 豌豆抗豌豆象研究進展

2.1 豌豆象抗性測定和評價

豌豆對豌豆象的抗性測定有各種不同的方法。有學者將豌豆抗性分為：1)莢抗性(pod resistance)：莢抗性(%)=100-(ep/p)×100，式中：ep為幼蟲蛀入豆莢的刺孔數(shù)，p為放置在豆莢表面的卵粒數(shù)；2)莢壁/種皮抗性(pod wall/seed coat resistance)：莢壁/種皮抗性(%)=100-(esc/ep)×100，式中：esc為種皮的刺孔數(shù)；ep為幼蟲蛀入豆莢的刺孔數(shù)；3)種皮抗性(seed coat resistance)：種皮抗性(%)=100-(ec/esc)×100，式中：ec為子葉刺孔數(shù)，esc為種皮的刺孔數(shù)；4)種子抗性(seed resistance)[39]：有3種方法可用來評價種子的抗性，一是用帶有刺孔和出孔口種子所占比例來表示，另一種方法是用帶有刺孔的種子賦予值“1”，沒有刺孔的種子賦予值“0”來表示，最后一種方法是用帶有出孔口的種子所占的比例來表示。Clement等[30]提出了種子損害評價分級標準(a seed damage rating scale，SDRS)：SDR=1，子葉未被1齡幼蟲采食；SDR=2，1齡幼蟲接觸子葉，但采食子葉<5%；SDR=3，2～4齡幼蟲采食子葉≥5%；SDR=4，發(fā)育到預(yù)蛹階段，對子葉產(chǎn)生較大程度的危害；SDR=5，發(fā)育到成蟲階段，伴有出孔口和出孔窗，產(chǎn)生實質(zhì)性的危害?？偟腟DR≤2被認為具有豌豆象抗性。

Hardie等[8]提出了種子豆象抗性百分比(percentage pea weevil resistance in seeds，PWR)和種子損害率(seed damage rating，SDR)，SDR測定方法要求解剖每一粒種子檢查幼蟲的發(fā)育程度，耗時耗力，相對麻煩，而PWR測定方法是通過快速檢察種子上出孔口判斷豆象的存在，這種方法得到了Redden等[40]及Fernandez等[41]的支持，后來這一方法也被用來測定綠豆象(Callosobruchuschinensis)抗性[42]。豌豆象侵染率百分比(percentage pea weevil infestation ratio)常作為豆象抗性指數(shù)用來評價豌豆種質(zhì)的抗性[8，20]，因其精準也被用作綠豆象[43]和四紋豆象(Callosobruchusmaculatus)[44]抗性測定。

2.2 豌豆抗豆象基因型鑒定與評價

作物栽培種與野生種在長期進化過程中形成了對昆蟲不同的防御機制。在栽培種馴化過程中人們往往更多關(guān)注農(nóng)藝性狀而忽視了抗蟲性，在缺乏昆蟲壓力條件下導致栽培種抗蟲基因喪失。而野生種在進化過程中遵從優(yōu)勝劣汰自然法則，易受昆蟲侵染的個體被淘汰，而具有一定抗性水平的個體則存活下來，最終導致野生種群中抗性基因頻率增加，馴化種群中抗性基因頻率減少甚至喪失。野生種質(zhì)資源中抗蟲基因的存在為作物抗蟲育種提供了基因源，育種家常利用富含抗性基因的野生種或野生近緣種來改良栽培種，這在西紅柿(Lycopersiconesculentum)[45]、甜菜(Betavulgaris)[46]和小麥(Triticumaestivum)[47]等作物上已獲成功。栽培作物改良的首要條件是抗性基因的獲得。因此，對栽培種、野生種及野生近緣種等種質(zhì)資源進行抗性基因的鑒定、評價和篩選顯得尤為重要。豌豆種質(zhì)資源對豌豆象的抗性鑒定始于20世紀70年代[16，30，39，48]，但鮮有成功。Hardie等[48]利用4年時間在超過9個地點對1900份豌豆屬(Pisum)種質(zhì)進行了17個田間抗性鑒定試驗，以種子危害百分率(percent seed damage，PSD)小于10%作為具有潛在抗性評判標準，結(jié)果只有19份屬于豌豆近緣野生種(Pisumfulvum)的種質(zhì)具有潛在抗性，其余1881份屬于栽培豌豆(P.sativum)的種質(zhì)全部淘汰。Teshome等[3]對來自埃塞俄比亞的602份豌豆種質(zhì)資源連續(xù)兩年利用田間和溫室相結(jié)合的鑒定方法篩選出種子危害率小于40%的種質(zhì)兩份(32454和235002)，PSD值分別為17%和33%。大量研究[6，16，30，48]證實栽培豌豆種質(zhì)具有較低的抗性水平，而目前在栽培豌豆中還未發(fā)現(xiàn)可遺傳豆象抗性[49]。有學者在栽培種中篩選出抗豆象豌豆品系，然而隨后在智利、美國、澳大利亞的試驗中證實這些品系不抵抗豌豆象的侵染[48]。在栽培種中及關(guān)聯(lián)半野生亞種(associated semi-wild subspecies)中雖然沒有發(fā)現(xiàn)可遺傳的豆象抗性，但是在近緣野生種(P.fulvum)中發(fā)現(xiàn)了可遺傳的豆象抗性[8，48]。研究發(fā)現(xiàn)采自以色列耶路撒冷以西2 km森林中(原代號Z708)[50]的豌豆近緣野生種(P.fulvum)“ATC113”對豌豆象表現(xiàn)出較好的抗性[8，30]。此后，圍繞該抗性種質(zhì)開展了大量的豆象抗性遺傳規(guī)律、抗蟲機制和抗蟲基因鑒定的研究工作[51-53]。

2.3 豌豆抗豆象機理

2.3.1 α淀粉酶抑制劑 普通菜豆(Phaseolusvulgaris)種子中的α-淀粉酶抑制劑(α-amylase inhibitor，α-AI)對豆象科害蟲具有較好的抑制效應(yīng)。普通菜豆種子中至少含有α-淀粉酶抑制劑-1(α-AI-1)和α-淀粉酶抑制劑-2(α-AI-2)兩種不同的α-AI[54]。前者廣泛分布于大多數(shù)栽培種中[55-56]，能夠抑制綠豆象(C.chinensis)和四紋豆象(C.maculatus)中腸淀粉酶以及幾種哺乳動物的淀粉酶，但對巴西豆象(Zabrotessubfasciatus)中腸淀粉酶無效[57]。α-AI-2存在于某些野生菜豆種質(zhì)中，與α-AI-1的氨基酸有78%的一致性，但α-AI-2不能抑制哺乳動物的淀粉酶[58-59]，卻能夠抑制巴西豆象中腸淀粉酶[58-60]。研究發(fā)現(xiàn)當有針對性地在食物中加入1%濃度的α-AI時對豆類倉儲期兩種重要害蟲綠豆象和四紋豆象幼蟲表現(xiàn)抑制效應(yīng)[57]，低濃度的α-AI-1對綠豆象表現(xiàn)抗性，而較高濃度則對四紋豆象和豌豆象均有抗性[61-62]。

菜豆中的α-AI基因已被轉(zhuǎn)入栽培豌豆中成功用來防治豌豆象[54，62]。Schroeder等[62]用農(nóng)桿菌介導法將普通菜豆種子編碼α-AI的cDNA轉(zhuǎn)入栽培豌豆中，由菜豆的另一種植物血凝素的啟動子驅(qū)動表達，α-AI基因在轉(zhuǎn)基因豌豆種子中穩(wěn)定表達至T5代，T5代種子中豌豆象早期幼蟲發(fā)育受阻；α-AI在該種子中積聚濃度達可溶性蛋白的3%，而這一水平比菜豆中正常含量還要高1%～2%；α-AI基因由來自種子特有的菜豆凝集素[bean PHA (dlec2)]基因的側(cè)翼序列調(diào)控，它們的表達被限制在種子子葉和胚軸的位置，因此在轉(zhuǎn)入α-AI基因的豌豆種子中豌豆象幼蟲到達子葉后其早期幼蟲(1或2齡)發(fā)育很快停止，與未轉(zhuǎn)入α-AI基因的豌豆相比這些品系種子被害率明顯降低。α-AI通過阻止豌豆象幼蟲對種子中淀粉的消化，削弱和阻礙幼蟲發(fā)育，導致其死亡[3]。α-AI-1可通過抑制1或2齡幼蟲體內(nèi)淀粉酶，阻止消化種子中淀粉而導致其死亡；但α-AI-2對豌豆象的抑制效應(yīng)較小，僅僅延遲了大約30 d左右的幼蟲發(fā)育時間，對總的死亡率沒有影響[54]。

α-AI的抑制效應(yīng)與豆象體內(nèi)pH值密切相關(guān)。α-AI-1在pH值4.5～6.5范圍內(nèi)可抑制豌豆象80%的淀粉酶，而α-AI-2僅在pH值4.0～4.5范圍內(nèi)抑制40%的淀粉酶。基于a-AI表達的pH值范圍不同，α-AI-1在溫室和大田條件下與α-AI-2相比均對豌豆象表現(xiàn)出較高的抑制效應(yīng)。因此，明確豆象腸道pH值，推測α-AI在該pH值條件下的抑制效應(yīng)尤為重要。目前未有文獻報道豌豆象消化道的pH值，但最近研究發(fā)現(xiàn)豆象科Bruchuidaeaffinis中腸的pH值是5.5～6.5，淀粉酶發(fā)揮活性的最佳pH值為5.5[63]。而研究發(fā)現(xiàn)α-AI-2在pH值5.5～6.5范圍內(nèi)的抑制效應(yīng)很低，據(jù)此推測α-AI-2延緩?fù)愣瓜笥紫x發(fā)育很可能是在豌豆象中腸pH值環(huán)境下淀粉酶活性部分被抑制所致[54]，也有學者認為豌豆象很可能像其他昆蟲一樣擁有多種α-淀粉酶[64-65]，這些淀粉酶不能全部被α-AI-2抑制[54]。

α-AI對大多數(shù)哺乳動物淀粉酶的抑制無效。用含有α-AI-1的轉(zhuǎn)基因豌豆飼養(yǎng)老鼠，當食物中含30%的轉(zhuǎn)基因豌豆時老鼠體重正常增加，對碳水化合物、氮代謝及內(nèi)臟的生長無不良影響。而人類[66]食用α-AI-1蛋白(20世紀80年代在美國α-AI-1蛋白被用作減肥食品消費)后對碳水化合物的代謝也無影響。α-AI在哺乳動物中的失效可能由于以下幾個因素：α-AI可能在胃液中失活[66]；α-AI表達的最適pH值低于人類十二指腸中pH值[67]；人類消化道中α-淀粉酶過量生產(chǎn)[68]。

2.3.2Np突變體 研究發(fā)現(xiàn)攜帶Neoplastic pod(Np)基因的豌豆突變體植株可有效減輕豌豆象的侵染危害。其作用機理為：1)Np基因型豌豆豆莢在雌性豌豆象產(chǎn)卵位置形成瘤狀突起(neoplastic)(也有學者稱之為愈傷組織，callus)，使豆莢腫大變厚，延遲和阻礙了豆象幼蟲穿透莢壁侵入籽粒蛀食危害[69-70]；2)愈傷組織(callus)在死亡后隨同附著在其上的卵一起掉落離開豆莢而減輕了豆象的侵染危害[69]。但多數(shù)情況愈傷組織死亡前大部分幼蟲已經(jīng)蛀入豆莢，因此，由Np基因型提供的抗性有限。

基于豆莢抗性的研究發(fā)現(xiàn)單個顯性基因控制豆莢上瘤狀突起。Nuttall等[71]在溫室條件下用Np突變體和正常豌豆(正常豌豆植株作為花粉受體，Np突變體作為花粉供體)雜交，F(xiàn)1代植株豆莢表現(xiàn)瘤狀突起。Doss等[70]以C887-332(Np/Np)和I3(np/np)雜交獲得的F4代為試驗材料，通過田間豌豆象自然侵染研究發(fā)現(xiàn)攜帶純合隱性基因np/np豌豆種子侵染率為85.4%，而攜帶純合顯性基因Np/Np種子侵染率為62.2%。有研究發(fā)現(xiàn)在溫室條件下通過避免紫外線照射Np基因型豌豆也可形成瘤狀突起，Np基因型豌豆在大田和高粱(Sorghumbicolor)間作，因高粱的遮擋而減少了紫外線的照射可導致大約30%的豌豆豆莢瘤狀突起形成[71]，但在大田生產(chǎn)過程中通過抑制紫外線使豌豆植株表達Np基因形成豆莢瘤狀突起是十分困難的[3]。攜帶Np基因的豌豆栽培種[70]和近緣野生種[72]豆莢瘤狀突起是由于豆莢上豌豆象產(chǎn)卵部位受“Bruchins”物質(zhì)刺激形成。“Bruchins”最初從四紋豆象上分離得到，是第一個從昆蟲上分離出的天然產(chǎn)物，鑒定為單酯3-羥基丙酸(monoester of 3-hydroxypropanoic acid)和長鏈脂肪醇[a long-chain fatty alcohol (diol)]等化合物，這類化合物可導致細胞的去分化和有絲分裂，刺激細胞分裂[70]。豌豆象產(chǎn)卵刺激形成的瘤狀突起來源于豆莢氣孔復(fù)合體細胞[73]，是豆莢氣孔愈傷組織的產(chǎn)物[74]。由于豌豆豆莢保衛(wèi)細胞周圍的構(gòu)造和莖葉組織中的差異[73-74]，“Bruchins”不能誘導莖和葉組織形成瘤狀突起。用“Bruchins”處理攜帶純合的隱性np/np基因豌豆植株，豆莢變淡褐色，輕微腫脹，無瘤狀突起的形成?！癇ruchins”物質(zhì)是植物防御反映的激發(fā)子，引發(fā)自發(fā)熒光，增加防御物質(zhì)的水平?！癇ruchins”物質(zhì)處理激發(fā)了植物抗毒素(phytoalexin)、酚類防御化合物(phenolic defense compound)、豌豆素(pisatin)的積累表達[75-76]。關(guān)于“Bruchins”物質(zhì)刺激和抑制紫外線導致Np基因型豌豆植株豆莢產(chǎn)生瘤狀突起的不同機理，還有待深入研究。

2.3.3 豌豆生物學特性與豆象抗性 豌豆生物學特性與豆象抗性的關(guān)系并無確切的定論。有學者研究發(fā)現(xiàn)豌豆的花色[48]、籽粒顏色[49]和豆象的抗性沒有必然關(guān)系。Peshoet等[16]發(fā)現(xiàn)花梗長度和豆象抗性呈負相關(guān)，花梗越短，對豆象抗性越高，解釋為較短的花梗有利于花朵和豆莢在葉片和植株群體間隱藏，可避免豌豆象取食和產(chǎn)卵。但后來有學者發(fā)現(xiàn)當豌豆象種群密度較大時這一現(xiàn)象并不存在[48]。Teshome等[3]發(fā)現(xiàn)在埃塞俄比亞白色籽粒的豌豆相比其他顏色的更容易感染豆象，解釋可能原因為：眾多白色籽粒的豌豆是圓形的，圓形籽粒相對具有更多子葉，這保證了充足的豌豆象幼蟲發(fā)育所需食物；其次，可能是與褶皺籽粒相比，圓形籽粒為豆象提供了更大的生存空間。豌豆象產(chǎn)卵對豆莢大小有選擇性，豌豆象傾向于在扁平、飽滿，長度為10～20 mm的豆莢表面產(chǎn)卵[8]。此外，豆莢和種子表面的蠟狀物、絨毛、二氧化硅等物質(zhì)也是阻礙豆象侵染的天然障礙物。鑒于此，在篩選、鑒定抗豆象種質(zhì)時，應(yīng)該更多地關(guān)注褶皺、綠色、褐色等特征的豌豆資源。

2.4 豌豆抗豆象基因的遺傳分析

野生豌豆和栽培豌豆之間存在染色體不親和性，但在實踐中發(fā)現(xiàn)以野生豌豆為花粉供體，與栽培豌豆雜交可獲得重組子代，這為野生豌豆抗豆象基因的遺傳分析研究提供了可能的途徑。2005年Bryne[51]通過對感豆象栽培種“Pennant”和抗豆象野生豌豆“ATC113”雜交獲得的F2代種子的抗性檢測發(fā)現(xiàn)符合1∶37∶26(抗、混合反映、感)和3基因遺傳模式(1∶63)，說明至少有3對隱性基因控制豆象抗性，通過分別測定F1代(n=7)和F2代(n=270)豆莢和種子抗性，確定抗豆象遺傳位點位于子葉內(nèi)，豆象的完全抗性是由3個隱性等位基因控制(pwr1，pwr2，pwr3)，完全感性是由3個顯性等位基因控制(PWR1，PWR2，PWR3)。2008年Byrne等[52]再次通過對Pennant/ATC113雜交獲得的F2代豆莢和種子的危害率檢測表明，豆莢抗性為數(shù)量遺傳，具有越親分離現(xiàn)象，豆莢抗性從F2代遺傳到F3代已經(jīng)很弱，但種子抗性能夠從F2代連續(xù)遺傳到F5代，并且通過回交能夠成功轉(zhuǎn)入新的群體中，基于F2群體的63∶1的分離比例證明了3基因模式，提出完全抗性由3個成對隱性等位基因(pwr1pwr1)、(pwr2pwr2)和(pwr3pwr3)控制，中抗到高抗植物至少含有1個顯性等位基因(pwr1pwr1)、(PWR2-)、(pwr3pwr3)，中感到高感至少含有2個顯性等位基因(PWR1-)、(PWR2-)、(pwr3pwr3)，完全感性則是由3個顯性等位基因(PWR1-)、(PWR2-)、(PWR3-)控制。

2.5 豌豆抗豆象基因遺傳圖譜構(gòu)建和分子標記

現(xiàn)代分子生物學的不斷發(fā)展，為豌豆抗豌豆象基因的研究提供了新的途徑。近年來，通過分子標記技術(shù)發(fā)掘了許多抗豆象基因與主效QTL(quantitative trait locus)，為抗性基因的發(fā)掘與利用、分子標記輔助選擇抗蟲育種奠定了基礎(chǔ)。2014年澳大利亞學者Aryamanesh等[53]首次在豌豆屬(Pisum)種質(zhì)資源中用QTL檢測到抗豆象基因，他們利用抗豆象近緣野生種ATC113(PI 595933) (P.fulvum)和感豆象栽培種Pennant(P.sativum)雜交，對獲得的270個F2群體采用SSR分子標記技術(shù)對豆粒子葉、豆莢壁/種皮、豆莢壁抗性研究表明，3個主效的QTL基因定位在連鎖群LG2、LG4和LG5上，這3個主效基因解釋子葉抗性表型變異率為80%；2個主效QTL基因定位在連鎖群LG2和LG5上，解釋了豆莢壁/種皮抗性表型變異率為70%；對子葉和豆莢壁/種皮抗性的QTL共線性分析結(jié)果表明，這兩個性狀的抗性機制可能存在共同的信號調(diào)控途徑，僅僅1個主效QTL基因定位在連鎖群LG7，解釋了豆莢壁抗性表型變異率為9%。Bryne[51]2005年通過對感豆象栽培種“Pennant”和抗豆象近緣野生豌豆“ATC113”雜交構(gòu)建F3群體，用AFLP標記(amplified fragment length polymorphisms)探尋親本及F3抗感后代多態(tài)性，通過約束最大似然法(restricted maximum likelihood，REML)分析確定13個與豌豆象抗性相關(guān)的AFLP標記以及23個與豌豆象感性相關(guān)AFLP標記的統(tǒng)計顯著性，主成分分析(principal coordinate analysis，PCO)顯示AFLP標記位點在PCO的空間形成聚類，顯示可能存在3個基因位點。8個AFLP標記被克隆、測序并轉(zhuǎn)換成序列特征性擴增區(qū)域標記(sequence characterized amplified regions，SCAR)，兩個SCAR標記，SC47359和SC47435在抗性親本與感性親本之間具有多態(tài)性，這兩個標記都與抗性后代及30%～36%的感性后代共分離。

2.6 豌豆抗豌豆象育種

利用抗性品種防治病蟲害是最簡便、經(jīng)濟、有效和綠色的方法，而利用野生種或近緣種進行遠緣雜交和基因滲入改良作物是進行抗性育種的有效途徑。在前期豌豆資源抗豆象鑒定的基礎(chǔ)上，多位學者已將野生豌豆的抗豆象基因[20，49]、菜豆中的α-淀粉酶抑制基因[54，62]分別成功轉(zhuǎn)入栽培豌豆中用來防治豌豆象，但關(guān)于轉(zhuǎn)基因豌豆的安全性一直存在爭議，導致轉(zhuǎn)基因豌豆品種應(yīng)用受阻。有學者研究發(fā)現(xiàn)用含有α-淀粉酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因豌豆飼喂老鼠后引發(fā)肺炎[77]。因此，有人指出轉(zhuǎn)基因豌豆不適宜人類的消費和動物的飼養(yǎng)[78]。此外，由于近緣野生豌豆具有種子黑色柔軟、無限生長[50，79]、豆莢上卷和種子彈射[80]等習性，這些不良性狀會因為連鎖被轉(zhuǎn)入栽培豌豆中而不受歡迎。

總之，由于轉(zhuǎn)基因豌豆的健康安全問題，不同環(huán)境條件下基因的表達差異[81]，不良性狀的連鎖以及消費者對轉(zhuǎn)基因豌豆的認知和接受能力等諸多因素限制了轉(zhuǎn)基因豌豆的發(fā)展，使得轉(zhuǎn)基因豌豆商業(yè)化應(yīng)用困難[78]。

3 豌豆象綜合防治研究進展

豌豆象綜合防治策略(integrated pest management，IPM)包括物理防治、化學防治、應(yīng)用栽培措施、天敵和抗蟲品種等多種措施。

3.1 栽培措施

栽培措施因簡便、綠色、環(huán)保的特點在農(nóng)作物病蟲害防治中發(fā)揮著重要的作用，但實踐證明栽培措施對豌豆象的防效有限。在澳大利亞通過適時早播、補種、早收和輪作等栽培措施防治豆象均表現(xiàn)出較低的防效，不過早播、早收、收獲后放牧采食殘茬、侵染的種子及幼蟲，可有效減少來年豆象的種群數(shù)量和危害程度[3,82]。由于豆象具有飛翔性，同一地區(qū)農(nóng)民能否協(xié)作防治是影響栽培措施防效大小的關(guān)鍵。

栽培與其他措施(如抗性品種)結(jié)合能達到較好的防效。利用不同品種混種可有效抑制害蟲的發(fā)生[83-84]，其作用機理在于不同基因型品種混種產(chǎn)生的補償和增效作用抵抗了生物和非生物脅迫[85]，例如，選擇基因型品種與間作和輪作結(jié)合，則寄主植物的中等抗性會得到加強，這為我們防治豆象提供了一種新的思路。

3.2 物理防治

物理防治是指采用物理的方法消滅害蟲或改變其物理環(huán)境，創(chuàng)造一種對害蟲有害或阻隔其侵入的一種方法[86]，研究顯示物理防治可有效滅殺豌豆象幼蟲、減輕危害。高溫滅蟲是物理防治害蟲常用的方法之一，其作用機理是持續(xù)高溫使昆蟲體內(nèi)蛋白質(zhì)變性失活，破壞酶系統(tǒng)而使有機體的生理功能紊亂，最終導致死亡[87]。夏季太陽直射溫度達50 ℃左右時，幾乎對所有儲糧害蟲都有致死作用[87]。豌豆收獲后，選擇晴天，將豌豆置于陽光下暴曬，當溫度達到50 ℃左右，持續(xù)8 h，豌豆象幼蟲因不耐高溫而死亡[88]。開水燙種法因操作簡便，防效好，早在20世紀50年代就在我國湖北地區(qū)被廣泛應(yīng)用[17]。開水燙種法是將豌豆種子置于容器中，以熱開水沖燙，用水量以覆蓋豆種為宜，持續(xù)時間20～30 s，燙種后濾水曬干。開水燙種時間把握至關(guān)重要，時間過短防效較低，時間過長影響發(fā)芽，最好控制在20～30 s。此外，還可以通過氣調(diào)法、輻射法、微波法等措施進行防治，但對農(nóng)戶來說這些方法操作相對復(fù)雜，成本過高，不宜實施。

3.3 化學防治

目前為止，豌豆象在世界范圍內(nèi)唯一有效的防治方法是田間殺蟲劑的噴施和儲藏期化學藥劑的熏蒸[49]。田間噴施殺蟲劑僅對成蟲有效，對豆莢表面的卵和籽粒內(nèi)的幼蟲無效[51]，因此，在田間豆象成蟲產(chǎn)卵前通過滅殺抑制其蟲口密度，減少卵和幼蟲數(shù)量是防治豆象唯一有效的途徑[18]。豌豆象成蟲采食花粉花蜜后才能交配產(chǎn)卵，因此，田間豌豆開花期噴施殺蟲劑對豆象防效至關(guān)重要。

在澳大利亞，Horne等[28]分別以每hm2有效成分40 g氯氰菊酯(cypermethrin)和350 g硫丹(endosulfan)藥劑單獨噴施，豆象危害率從未噴施的11%減少到4%，以每hm2有效成分340 g滅多威(methomyl)和有效成分40 g的氰戊菊酯(fenvalerate)噴施，危害率分別降為6%和8%，通過室內(nèi)實驗進一證實氯氰菊酯是豌豆象最有效的殺蟲劑。豆象的蟲態(tài)、大小和持續(xù)時間決定了噴施藥劑的種類和數(shù)量[48]。豌豆象的侵染危害能持續(xù)幾周，而許多化學藥劑最長藥效期為7 d，因此，田間需多次噴施才能達到較好的防效。

儲藏期豌豆籽粒內(nèi)豆象可通過化學藥劑熏蒸滅殺[51]?；瘜W藥劑熏蒸能顯著減少豌豆籽粒上的豆象蟲孔數(shù)量[82]。豌豆成熟后及時收獲，豆象蛀食最大僅能造成26%的種子重量損失，其余74%的損失由儲藏期豌豆象幼蟲在種子內(nèi)蛀食危害(至少蛀食兩個月以上)造成。因此，儲藏期種子重量損失完全可以通過收獲后及時熏蒸而挽回。熏蒸越及時損失越小，成熟后1周收獲熏蒸處理與成熟后2、3和4周收獲處理相比產(chǎn)量損失最低[82]。

化學殺蟲劑長期、不合理使用容易產(chǎn)生環(huán)境污染和抗藥性[89]，且價格昂貴，特別增加了農(nóng)民經(jīng)濟負擔[49]。因此，開發(fā)和研制防效高、環(huán)境友好、價格低廉的生物農(nóng)藥是今后豆象防治的研究熱點。

3.4 生物防治

利用天敵防治農(nóng)田作物害蟲是生物防治最重要的方法，應(yīng)在生產(chǎn)實踐中大力倡導。豌豆象天敵種類較多，如小黃蜂(Chalcidoidwasps)[90]、Uscanasenex[91]、U.chiliensissp.nov[92]、Triaspisthoracicus[21，90]、Eupteromalusleguminis和Microdontomerusanthonomi，這些天敵都是豌豆象幼蟲或蛹的擬寄生物。Annis等[90]研究發(fā)現(xiàn)雖然Chalcidoidwasps通過豆象羽化孔能進出豆粒中，卻不能有效防治豆象。T.thoracicus可寄生田間豆莢上豌豆象的卵[90]。澳大利亞聯(lián)邦科學與工業(yè)研究組織(CSIRO)從法國引進了T.thoracicus來防治豌豆象，但因其不能在澳大利亞越冬而宣告失敗[93]。在過去，生物防治豆象很少被重視，因此，全面系統(tǒng)研究這些天敵防治豌豆象的作用、效果和機理顯得尤為重要[24]。

4 展望與討論

豌豆作為豆科重要的經(jīng)濟作物，可糧、菜、飼兼用，被稱作“三營養(yǎng)作物”，即營養(yǎng)人類、營養(yǎng)畜禽、培肥地力。豌豆因其適應(yīng)性強、用途廣泛、營養(yǎng)價值高、經(jīng)濟效益好而深受人們喜愛，在改善人們膳食結(jié)構(gòu)和可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展方面發(fā)揮了重要作用。豌豆象嚴重危害豌豆，因其完全變態(tài)發(fā)育的特點，再加之生活環(huán)境多變、危害時間長，其防治十分困難。各國學者圍繞豌豆象[21-22，36]、豌豆抗豌豆象種質(zhì)資源的篩選與鑒定[16，30，39，48-50]、抗性遺傳及抗性基因的挖掘與分子定位[51-53]、抗豌豆象育種[20，49，54，62]和豌豆象綜合防治[17，28，82，93]等方面開展了大量工作，取得了階段性成果。

豌豆在我國是小宗作物，長期以來不受重視，與大宗作物相比，研究基礎(chǔ)相對薄弱。目前，在我國關(guān)于豌豆抗豌豆象育種及豌豆象綜合防治方面的研究鮮有報道，且僅有的研究還停留在20世紀豌豆象的調(diào)查和簡單防治方面[10-12，17]。時過境遷，21世紀豌豆象在我國發(fā)生十分猖獗(如在甘肅定西、臨夏危害率達65%以上，嚴重地塊達80%以上)，導致豌豆播種面積銳減，嚴重制約豌豆產(chǎn)業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展。因此，加強豌豆象、豌豆抗豌豆象育種及豌豆象綜合防治方面的研究，非常緊迫，勢在必行?；诖?，我們應(yīng)加大人力、物力和財力的投入力度，提高研究水平，從基礎(chǔ)理論和應(yīng)用實踐兩個層面做好豌豆象及其綜合防治研究工作，力爭解決好我國豌豆產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸問題。

綜上所述，豌豆作為一種重要的豆科作物，在農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用。豌豆象作為危害豌豆最嚴重的害蟲，其防治刻不容緩。為了今后的研究更有靶向性，在分析國內(nèi)外研究現(xiàn)狀的基礎(chǔ)上，我們提出今后研究工作的重點： 1)我國地緣遼闊，氣候類型多樣，豌豆種質(zhì)資源豐富，但對這些種質(zhì)資源的抗性鑒定鮮見，加強我國地方豌豆資源的豌豆象抗性鑒定，充分挖掘潛在的抗蟲基因，為抗蟲新種質(zhì)的創(chuàng)制創(chuàng)造條件；2) “Bruchins”物質(zhì)刺激和抑制紫外線導致Np基因型豌豆植株豆莢產(chǎn)生瘤狀突起的不同機理未能很好解釋，有待深入研究；3)α-淀粉酶的表達與pH值密切相關(guān)，目前未有豌豆象消化道pH值的報道，探明豌豆象消化道的pH值對解析α-淀粉酶對豌豆象的抑制機理與效應(yīng)至關(guān)重要；4)信息化學物質(zhì)，如利他素(kairomones)、性信息素(sex pheromones)[94]等可用來檢測和誘捕防治豌豆象，但鮮有信息化學物質(zhì)用于豌豆象防控方面的研究，加強研究會有現(xiàn)實意義；5)過去生物防治豆象被忽視，隨著人們環(huán)保和生態(tài)意識的提高，今后利用天敵防治豌豆象將成為研究者關(guān)注的焦點；6)化學殺蟲劑的應(yīng)用是目前防治豌豆象唯一有效的方法，但面臨環(huán)境污染、抗藥性產(chǎn)生和成本過高的問題，研制高效、環(huán)保、低廉的生物農(nóng)藥是今后豆象防治的發(fā)展趨勢；7)通過雜交或轉(zhuǎn)基因方法利用近緣野生種、Np突變體、α-淀粉酶抑制基因等創(chuàng)制抗豆象新種質(zhì)時，利用現(xiàn)代分子生物學手段盡量摒棄親本的不良性狀，創(chuàng)制品質(zhì)好、性狀優(yōu)、抗性強的種質(zhì)；8)加強轉(zhuǎn)基因豌豆的安全評估，提高消費者對轉(zhuǎn)基因的認知水平，使得含有α-淀粉酶抑制劑的轉(zhuǎn)基因豌豆早日商業(yè)化應(yīng)用。

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Advances in breeding of pea (Pisumsativum) with resistance to pea weevil (Bruchuspisorum) and its integrated management

WANG Chang1, HE Chun-Gui2, ZHANG Li-Juan1, YANG Xiao-Ming1*

1.InstituteofCropsResearch,GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China； 2.GansuAcademyofAgriculturalSciences,Lanzhou730070,China

Pea (Pisumsativum) is an important economic legume crop that is cultivated around the world for its high nutritional value. The pea weevil (Bruchuspisorum) is the most destructive pest of pea crops worldwide. The boring of pea weevil larvae can destroy more than 50% of the cotyledon parts in pea grains, leading to empty grains, poor seed germination, and poor seed quality. The pea weevil has become one of the most serious factors restricting the sustainable development of the pea industry. Genetic resources for pea weevil resistance have not been found in cultivated pea varieties, but have been detected in wild pea. Genetic studies have revealed that the inheritance of resistance to pea weevil is controlled by at least three recessive genes. In other studies, α-amylase inhibitor (α-AI) and neoplastic pod (Np) mutants of pea showed a degree of resistance to pea weevil. Although transgenic pea lines have been developed, their potential threats to human and animal health mean that chemical pesticides are still the most efficient methods to control pea weevil. In this paper, we review recent advances in pea weevil research, including breeding for resistance and integrated management systems. We discuss the current state of research on pea weevil in China and the problems remaining to be solved.

pea; pea weevil; α-amylase inhibitor;Npmutant; pea weevil resistance gene; management

10.11686/cyxb2016360

2016-09-22；改回日期：2017-02-23

國家食用豆產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)(CARS-09-G8)，國家自然科學基金項目(31460382)和蘭州市農(nóng)業(yè)科技攻關(guān)項目(2015-3-54)資助。

王昶(1979-)，男，甘肅隴南人，助理研究員，碩士。E-mail：chang288@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail：yangxm04@hotmail.com

http://cyxb.lzu.edu.cn

王昶, 賀春貴, 張麗娟, 楊曉明. 豌豆抗豌豆象育種及其綜合防治研究進展. 草業(yè)學報, 2017, 26(7): 213-224.

WANG Chang, HE Chun-Gui, ZHANG Li-Juan, YANG Xiao-Ming. Advances in breeding of pea (Pisumsativum) with resistance to pea weevil (Bruchuspisorum) and its integrated management. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 213-224.