包愛科，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室, 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州730020)

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CRISPR/Cas9系統(tǒng)：基因組定點編輯技術(shù)及其在植物基因功能研究中的應(yīng)用

包愛科*，白天惠，趙天璇，蘇家豪

(草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室, 蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院, 甘肅 蘭州730020)

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在長期演化過程中形成的一種適應(yīng)性免疫防御系統(tǒng)，可用來對抗入侵的病毒及外源DNA。相比鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)，基于RNA指導(dǎo)的Ⅱ型CRISPR/Cas9系統(tǒng)為基因組定點編輯開辟了一條新的道路，在基因功能研究中具有效率高、成本低、易于操作等顯著優(yōu)點。本文從CRISPR/Cas9系統(tǒng)的基本結(jié)構(gòu)、作用機制及其在植物基因功能研究和作物遺傳育種中的應(yīng)用等方面進行了簡述，最后對該系統(tǒng)的發(fā)展前景進行了展望。

基因編輯；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；基因功能；分子育種

隨著越來越多物種全基因組測序的完成，進一步研究基因的功能及其應(yīng)用是當(dāng)前面臨的一個新的挑戰(zhàn)。20世紀(jì)80年代發(fā)展起來的基因編輯技術(shù)可以對基因組完成精確修飾，通過在基因組水平上進行基因的定點突變、插入、多位點突變及小片段的刪失等手段，進行基因功能的研究。真核生物基因組包含成千上萬的DNA堿基，直接對其進行遺傳操作難度很大。同源重組(homologous recombination，HR)介導(dǎo)的打靶技術(shù)在基因編輯技術(shù)方面是一個很大的突破，大大推進了生命科學(xué)領(lǐng)域的諸多研究進程[1-2]。然而，盡管HR介導(dǎo)的基因打靶產(chǎn)生了許多精確的突變，但是其發(fā)生頻率很低，因此大規(guī)模應(yīng)用面臨巨大挑戰(zhàn)[3]。近年來出現(xiàn)的人工核酸酶技術(shù)很好地克服了這一缺點。人工核酸酶可以在基因組特定位點產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂(double strand broken，DSB)，隨后啟動細(xì)胞內(nèi)的自我修復(fù)機制，通過非同源末端連接(non-homologous end joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)實現(xiàn)修復(fù)[4-5]。目前，人工核酸酶主要包括4類：大范圍核酸酶(meganuclease，MGN)、鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease，ZFNs)、TALE核酸酶(transcription activator-like effector nuclease，TALENs)以及CRISPR/Cas系統(tǒng)。

MGN核酸酶是在酵母中發(fā)現(xiàn)，能夠識別14～40堿基長度的核酸序列的歸巢核酸內(nèi)切酶，可構(gòu)建雙鏈斷裂，通過激活同源重組進行修復(fù)[6]。歸巢核酸內(nèi)切酶識別并切割不含內(nèi)含子的同源等位基因，啟動歸巢作用，插入序列就轉(zhuǎn)移到缺少該序列的同源等位基因上了。當(dāng)一個DNA序列被歸巢核酸內(nèi)切酶切割后，可以通過同源重組對其進行修復(fù)，從而實現(xiàn)歸巢核酸內(nèi)切酶的轉(zhuǎn)移，以及內(nèi)含子和歸巢位點序列的阻斷[7]。但是，目前已知的大范圍核酸酶較少，不能覆蓋所有的靶位點，所以其應(yīng)用受到很大限制[8]。

ZFNs核酸酶包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域鋅指蛋白和切割結(jié)構(gòu)域ForkⅠ兩部分，每個鋅指蛋白能夠特異性識別3個堿基，而鋅指核酸酶是多個鋅指蛋白模塊的串聯(lián)，可以識別更多的核苷酸序列[9]。ForkⅠ通過二聚化才能產(chǎn)生核酸內(nèi)切酶活性。因此，需要兩個ZFN分別識別靶位點的上下游，當(dāng)兩個ZFN同各自的識別位點特異性結(jié)合并且中間間隔精確時，F(xiàn)orkⅠ將會行使切割功能，從而使DNA雙鏈斷裂(DSB)[9-10]?？梢?，ZFNs的出現(xiàn)給基因編輯開辟了一條新的道路，它有明顯的技術(shù)優(yōu)勢。然而，ZFNs依然存在著諸多如不能靶向所有的序列、使用前需要大量的篩選和鑒定、脫靶切割率較高等問題[11-12]。

TALE核酸酶和ZFNs結(jié)構(gòu)類似，也由DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域TALE蛋白和切割結(jié)構(gòu)域ForkⅠ兩部分組成。在TALE蛋白的N-端是typeⅢ傳送系統(tǒng)的信號位點(translocation)，而其C-端則有核定位信號位點(nuclear locatization，NLS)和轉(zhuǎn)錄激活信號位點(transcriptional activation，AD)，中游是DNA特異結(jié)合域(DNA-binding domain)[13]。DNA特異結(jié)合域由33～35個氨基酸組成的重復(fù)片段串聯(lián)而成，每個片段靶向一個DNA堿基，串聯(lián)的重復(fù)片段可靶向識別多個堿基。TALE的C-端與ForkⅠ融合后形成TALEN單體，當(dāng)兩個TALEN單體分別特異性識別各自的位點后，兩個ForkⅠ的切割結(jié)構(gòu)域即可形成二聚體，從而切割DNA產(chǎn)生DSB[14]。與ZFNs相比，TALENs在設(shè)計和構(gòu)建上更為簡便，但由于TALENs的重復(fù)片段很多，增大了與靶基因結(jié)合的難度，限制了其廣泛應(yīng)用[11]。

近年來，一項新的基因編輯技術(shù)——CRISPR/Cas技術(shù)被越來越多的實驗室廣泛接受，該項技術(shù)不僅克服了前述3種基因編輯技術(shù)中出現(xiàn)的大多數(shù)問題，且具有便于操作、成本低等優(yōu)點[15]，在動植物基因功能鑒定、分子設(shè)計育種等研究領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力。因此，本文著重從CRISPR/Cas的基因座結(jié)構(gòu)、作用機制以及在植物基因功能研究中的應(yīng)用進行詳細(xì)的介紹，以期為相關(guān)的研究提供參考。

1 CRISPR/Cas系統(tǒng)概述

1.1 CRISPR/Cas系統(tǒng)

早在1987年，Ishino等[16]在研究iap酶在大腸桿菌中參與堿性磷酸酶同工酶轉(zhuǎn)化時發(fā)現(xiàn)，iap基因的下游存在一種成簇的規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列，和大多數(shù)重復(fù)序列不同的是，這些重復(fù)序列被5個非重復(fù)序列間隔開。但這一發(fā)現(xiàn)在當(dāng)時并沒有引起足夠的注意。在接下來的10年中，隨著更多的微生物基因組被測序，人們發(fā)現(xiàn)在40%的細(xì)菌和90%的古細(xì)菌中都存在這種成簇的重復(fù)序列[17]。直到2002年，這類重復(fù)序列才被正式命名為Clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)[18]。同時，在CRISPR位點的附近發(fā)現(xiàn)存在一組保守的與CRISPR相關(guān)的蛋白編碼基因，被命名為Cas基因。根據(jù)不同的Cas基因，可以將CRISPR系統(tǒng)分為3種類型：TypeⅠ、TypeⅡ以及TypeⅢ[19-20]。Ⅰ型和Ⅲ型的CRISPR位點包含多個Cas蛋白，而Ⅱ型CRISPR位點只包含Cas9一種蛋白，便于構(gòu)建載體，因此，在目前的研究中，Ⅱ型的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的使用比較廣泛。

2005年，多個研究小組均發(fā)現(xiàn)從CRISPR重復(fù)序列中分離出來的間隔序列與宿主菌染色體外的遺傳物質(zhì)有很高的同源性[21-23]。這被認(rèn)為是CRISPR系統(tǒng)研究的一個關(guān)鍵轉(zhuǎn)折點。很快， Barrangou等[24]首次為Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)作為適應(yīng)性免疫系統(tǒng)提供了實驗依據(jù)，證明了在基于核酸的免疫系統(tǒng)中，CRISPR的間隔區(qū)負(fù)責(zé)指導(dǎo)外源DNA的識別，而Cas酶則主要控制間隔區(qū)的采集和噬菌體的防御。在此之后，CRISPR/Cas系統(tǒng)的研究步伐明顯加快。2012年，Jinek等[25]通過對Ⅱ型CRISPR系統(tǒng)的改造和優(yōu)化，將CRISPR RNA(crRNA)和trans-activing crRNA(tracrRNA)構(gòu)建成一條單鏈引導(dǎo)RNA (single-guide RNA，sgRNA)，同樣可以與Cas9共同作用特異性切割目的基因。這為后來CRISPR/Cas系統(tǒng)在基因功能研究中的成功應(yīng)用打開了一扇大門，如Mandal等[26]采用CRISPR/Cas系統(tǒng)在人類的造血干細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞中實現(xiàn)了有效的基因剔除；Chen等[27]通過該系統(tǒng)實現(xiàn)了對秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)的雙重sgRNA定向基因敲除；Auer等[28]在斑馬魚中介導(dǎo)eGFP向Gal4轉(zhuǎn)基因株系的轉(zhuǎn)化；最近，Zhu等[29]也利用該系統(tǒng)在猴子胚胎干細(xì)胞中通過同源重組成功實現(xiàn)了基因的打靶。此外，CRISPR/Cas系統(tǒng)還為某些疾病的治療提供了新的手段，目前已成功利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對乙肝病毒[30]、EB病毒[31]以及范可尼貧血[32]等的基因編輯。因此，CRISPR/Cas系統(tǒng)已經(jīng)得到全世界從事生物學(xué)研究科學(xué)家的高度重視。

1.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用原理

Ⅱ型CRISPR/Cas系統(tǒng)的基因結(jié)構(gòu)簡單穩(wěn)定，由眾多短的高度保守的重復(fù)序列和長度相似的間隔序列(spacers)間隔排列組成[33-37]，從5′端到3′端依次為tracrRNA、Cas9基因、前導(dǎo)序列(leader sequence)和CRISPR序列。前導(dǎo)序列可作為啟動子，啟動CRISPR序列的轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生crRNA前體(pre-crRNA)[38-39]。tracrRNA可與Cas9蛋白一起參與RNA酶Ⅲ對CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的選擇性酶切，從而產(chǎn)生成熟的crRNA；隨后，由Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA形成的復(fù)合體可對crRNA配對的外源DNA實施剪切[40]。值得注意的是，Cas9蛋白有兩個標(biāo)志性的核酸酶區(qū)域，RuvC和HNH，RuvC位于Cas9的氨基端，HNH是一個單一的核酸酶結(jié)構(gòu)域，位于蛋白的中間位置[41]。在Cas9蛋白行使剪切功能時，HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域剪切與crRNA互補的序列，而RuvC結(jié)構(gòu)域則負(fù)責(zé)剪切非互補的序列[24]。CRISPR/Cas9系統(tǒng)的另一個重要特征就是原型間隔序列毗鄰基序(protospacer adjacent motif, PAM)。DNA靶位點上與間隔序列對應(yīng)的序列被稱為原間隔序列(protospacer)，PAM通常位于protospacer的3′端，其序列很保守，長度一般為2～5個堿基，與protospacer距離1～4個堿基[42]。當(dāng)外源核酸入侵時，宿主掃描到入侵核酸DNA序列中的多個PAM結(jié)構(gòu)，將PAM的5′端的序列定義為protospacer，從而獲得新的間隔區(qū)[42]。另外，由于CRISPR本身的重復(fù)序列中不存在PAM位點，因此，PAM的存在也是CRISPR系統(tǒng)區(qū)分自身DNA和外源DNA，從而避免發(fā)生自身免疫的原因之一[43]。釀膿鏈球菌(Streptococcuspyogenes) Cas9的生物化學(xué)和結(jié)構(gòu)特征表明，PAM的識別可以啟動Cas9靶向結(jié)合和切割之間的構(gòu)造轉(zhuǎn)換[43-45]。

目前已發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas系統(tǒng)的防御過程可分為3個階段：第一階段，CRISPR間隔區(qū)的獲得，包括識別和CRISPR位點上相鄰兩個重復(fù)序列間間隔區(qū)序列的整合。來自噬菌體或質(zhì)粒的雙鏈DNA的一小段特殊區(qū)域(即原型間隔序列)被整合到宿主細(xì)胞DNA的CRISPR前導(dǎo)序列末端，因此，spacer的位置代表了外源遺傳物質(zhì)入侵的時間順序[46]。在此過程中，Cas1和Cas2蛋白參與了新間隔序列的獲得[24,47]。第二階段，CRISPR基因座的表達。CRISPR基因座首先在RNA聚合酶的作用下被轉(zhuǎn)錄成前體CRISPR RNA (pre-CRISPR RNA)，然后被Cas蛋白或核酸內(nèi)切酶剪切成包含單個間隔區(qū)和部分重復(fù)區(qū)的更小的crRNA[48]。第三階段，CRISPR/Cas系統(tǒng)的干擾或免疫。該階段是CRISPR/Cas免疫反應(yīng)最關(guān)鍵的一步，crRNAs與Cas蛋白復(fù)合體共同作用，識別外來DNA上的靶序列并進行堿基配對，形成的核糖核蛋白復(fù)合物在外源DNA的原型間隔序列處進行切割[49-50]。已有研究發(fā)現(xiàn)，crRNA的間隔序列(spacer)與外源DNA的靶位點完全或部分互補都可以實現(xiàn)對特定位點的切割[49]。

2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種全新的基因編輯技術(shù)，除了在動物育種和疾病治療中發(fā)揮其優(yōu)勢外，在植物基因功能的研究中也體現(xiàn)出其簡便、高效的特點。

2.1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)的構(gòu)建

CRISPR/Cas9系統(tǒng)對基因組進行定點修飾時，只需要表達Cas9蛋白、crRNA和tracrRNA三個組分[51]。目前已對天然CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了成功改造，將crRNA和tracrRNA雙組分利用基因工程整合成一條雙鏈RNA分子，成為sgRNA，從而將CRISPR/Cas9系統(tǒng)簡化成了sgRNA和Cas9蛋白兩部分[25,52]。

Cas9核酸酶是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中的核心部分。遺傳密碼有64種，但通常情況下，不同的物種在長期的進化過程中，絕大多數(shù)生物傾向于利用其中的一部分密碼子，即對于編碼同一種氨基酸的同義密碼子的使用具有很大的偏好性。而這種密碼子的偏好性阻礙了細(xì)菌基因在植物細(xì)胞中的表達，因此，在轉(zhuǎn)入植物之前需要根據(jù)宿主植物基因?qū)碓从诩?xì)菌的基因進行改造和密碼子優(yōu)化。有研究表明，在植物中對Cas9基因的密碼子進行優(yōu)化可以顯著提高基因組的編輯效率[53]。另外，Cas9蛋白只有被轉(zhuǎn)運到細(xì)胞核中才能發(fā)揮作用，因此，需要在Cas9蛋白引入1個或2個入核的信號肽或標(biāo)簽蛋白[51]。sgRNA引導(dǎo)Cas9蛋白在靶位點進行切割，是CRISPR/Cas9系統(tǒng)中另一個重要的組成部分。研究表明，選擇不同的啟動子驅(qū)動sgRNA表達的效率不同。在雙子葉植物中，植物內(nèi)源的Ⅲ型啟動子U6或組成型啟動子CaMV35S均可高效地驅(qū)動sgRNA的表達，而在單子葉植物中，除了這兩種啟動子外，Ⅲ型啟動子U3也可以高效的啟動其表達[54-59]。另外，利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中進行基因組編輯時，sgRNA中與PAM相距12～13個堿基的序列主要決定CRISPR/Cas9系統(tǒng)的特異性，前導(dǎo)序列中GC含量較高以及將sgRNA和Cas9核酸酶構(gòu)建在同一載體中可在一定程度上增加CRISPR/Cas9系統(tǒng)的靶向效率[58-59]。

綜合目前已有的報道，在體外構(gòu)建植物sgRNA-Cas9系統(tǒng)的流程大致可總結(jié)為以下幾個步驟：(1) 合成sgRNA。首先在已知序列中找到PAM位點，然后通過PAM定位尋找合適的靶位點，設(shè)計的靶位點最好在目標(biāo)基因序列的第一外顯子附近，這樣可以獲得較高活性的sgRNA(圖1A)。(2) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒的構(gòu)建。將合成的sgRNA和經(jīng)過密碼子優(yōu)化的Cas9序列構(gòu)建重組質(zhì)粒。該過程可以構(gòu)建一個載體將sgRNA和Cas9同時載入，也可以分別構(gòu)建載體，構(gòu)建載體時需要攜帶報告基因或抗性基因(圖1B)。(3) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒載體活性檢測。Kabin等[60]在水稻(Oryzasativa)中將密碼子優(yōu)化過的Cas9和sgRNA克隆到水稻瞬時表達載體中，以水稻35s:GFP的表達作為質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率的參考來檢測重組質(zhì)粒載體的活性。如果沒有活性或活性較低，需要重新設(shè)計合成sgRNA。(4) 遺傳轉(zhuǎn)化。采用農(nóng)桿菌侵染或者基因槍法將構(gòu)建好的工程載體導(dǎo)入目標(biāo)植物，進行基因組定點修飾。(5) 檢測定點修飾結(jié)果。一般會采用RE-PCR分析法、PCR+TA克隆測序法、基于可以識別錯配雙鏈的錯配內(nèi)切酶檢測法(Surveyor 法)和T7E1核酸內(nèi)切酶法以及結(jié)合二代測序(next generation sequencing，NGS)的高通量檢測法檢測定點修飾的結(jié)果[61]。

圖1 植物中使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行RNA指導(dǎo)的基因編輯原理圖Fig.1 Schematic description of RNA-guided genome editing in plants using the CRISPR/Cas9 system (A) sgRNA通過PAM定位尋找合適的靶位點，介導(dǎo)Cas9對靶序列進行特異性切割。(B) sgRNA-Cas9重組質(zhì)粒的構(gòu)建示意圖。PolⅢ啟動子和終止子控制sgRNA的轉(zhuǎn)錄；MCS為多克隆位點；PolⅡ啟動子和終止子控制Cas9核酸酶的表達；NLS為核定位信號；Ampr代表抗性基因。(A) sgRNA find the right target site through the PAM and mediate the specific cleavage by Cas9. (B) Diagram of vectors for transient expression. A DNA-dependent RNA polymerase Ⅲ (Pol Ⅲ) promoter and terminator are used to control the transcription of engineered sgRNA. MCS represents the multiple cloning sites. Plant DNA-dependent RNA polymerase Ⅱ (Pol Ⅱ) promoter and terminator are used to control the expression of a chimeric Cas9 nuclease. NLS is a nuclear localization signal and Ampr represents a resistance gene.

2.2 CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的應(yīng)用

CRISPR/Cas系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以后，很快就被應(yīng)用到了高等植物基因功能研究中。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功介導(dǎo)了擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麥(Triticumaestivum)、煙草(Nicotianatabacum)、番茄(Lycopersiconesculintum)、大豆(Glycinemax)、甜橙(Citrussinensis)、毛白楊(Populustomentosa)以及豆科牧草蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)等基因組中單個位點甚至多個位點的修飾(表1)。Xu等[53]在水稻中通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)對水稻BEL基因?qū)崿F(xiàn)了基因的靶向編輯。他們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)化方法是影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物中作用效率的重要因素，總體上使用基因槍會得到更高的轉(zhuǎn)化效率，且可以導(dǎo)致多個插入，從而有助于提高sgRNA和Cas9蛋白的表達水平。然而，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化通常能夠得到高效的單位點插入，因此，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的sgRNA-Cas9系統(tǒng)靶向的基因組更容易確定。不過最近Yin等[62]發(fā)現(xiàn)雙生病毒DNA復(fù)制可以提高基因打靶頻率。煙草花葉病毒是一種在細(xì)胞質(zhì)中復(fù)制的RNA病毒，可以將gRNAs傳遞到轉(zhuǎn)基因的Cas9表達煙草中，以實現(xiàn)系統(tǒng)的基因組編輯，甚至可以在兩個后代植株中被檢測到。而目前在植物中，基于DNA病毒的基因組編輯傳遞系統(tǒng)還未被發(fā)現(xiàn)。除此之外，其他學(xué)者也在雙子葉植物如擬南芥、煙草，以及單子葉植物高粱(Sorghumvulgare)中成功地表達了CRISPR/Cas9系統(tǒng)[63]。目前，CRISPR/Cas9系統(tǒng)不僅能夠在草本植物中進行精確的基因編輯，同時也在木本植物中實現(xiàn)了基因組的編輯和靶位點的突變。Jia等[64]在木本植物甜橙中通過農(nóng)桿菌向甜橙中導(dǎo)入Cas9以及合成的sgRNA靶向CsPDS基因，成功使目標(biāo)位點CsPDS基因發(fā)生了突變。Fan等[65]在木本植物毛白楊中設(shè)計了4個引導(dǎo)RNA(gRNA)靶定毛白楊八氫番茄紅素脫氫酶基因8 (PtoPDS)的不同基因組位點。在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化之后，他們在轉(zhuǎn)基因楊樹中觀察到了明顯的白化表型。通過分析RNA引導(dǎo)的基因組編輯事件，59個PCR克隆中有30個是純合子突變體，有2個是雜合子突變體，這些目標(biāo)位點的突變效率估計是51.7%。這就表明，利用Cas9/sgRNA系統(tǒng)，也可以在木本植物中精確地編輯基因組序列，并有效地建立基因敲除突變體。

為了進一步研究CRISPR/Cas9系統(tǒng)在植物基因功能研究中的穩(wěn)定性，Zhang等[59]通過2個水稻亞種(粳稻日本晴和秈稻Kasalath)測試CRISPR/Cas9系統(tǒng)誘導(dǎo)11個靶基因產(chǎn)生突變的效率、特點、遺傳性及特異性等。通過檢測T0代轉(zhuǎn)基因植株，發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9系統(tǒng)在所有11個靶基因位點都誘導(dǎo)產(chǎn)生了突變，突變效率高達66.7%，且超過一半(6/11)的靶基因位點在T0代獲得純合突變體；同時，CRISPR/Cas9誘導(dǎo)產(chǎn)生的基因突變通過經(jīng)典的孟德爾定律遺傳到下一代，通過全基因組重測序并檢測與靶序列高度同源的序列，他們僅在只有一個堿基不同的潛在脫靶位點檢測到突變，這表明CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中有很高的特異性。該項研究為CRISPR/Cas9系統(tǒng)在水稻中的穩(wěn)定應(yīng)用及進一步應(yīng)用該技術(shù)提高水稻的產(chǎn)量、抗性及品質(zhì)等提供了理論基礎(chǔ)。

最近幾年，許多研究者還對CRISPR/Cas9系統(tǒng)進行了升級改造，如：Lozano-Juste等[67]發(fā)現(xiàn)Cas9蛋白的D10A突變體CasNickase可切割DNA單鏈，其在成對的gRNAs輔助下可以實現(xiàn)DNA雙鏈斷裂，從而在保證原有系統(tǒng)靶向率的基礎(chǔ)上，顯著降低了脫靶率。此外，Qi等[68]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)缺失核酸內(nèi)切酶的Cas9與sgRNA共表達時，會產(chǎn)生一種新的DNA識別復(fù)合體，能特異性地干擾轉(zhuǎn)錄的延伸、RNA聚合酶的結(jié)合或轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，被稱為CRISPR干擾(CRISPRi)系統(tǒng)。這一系統(tǒng)能有效抑制大腸桿菌中靶向基因的表達，并且不會出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。而且利用CRISPRi還可以同時抑制多個靶基因。另外，不同于原有的基因敲除技術(shù)，CRISPRi技術(shù)的效應(yīng)是可逆的。因此，CRISPRi的序列特殊靶向平臺在大范圍的宿主細(xì)胞中作為一種綜合調(diào)控基因表達的方法有很好的應(yīng)用前景。

隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)在基因組編輯技術(shù)上的開發(fā)和完善，該系統(tǒng)正在被逐步應(yīng)用到對植物病毒基因組進行高效靶向修飾的研究中。目前已有研究證明CRISPR/Cas9系統(tǒng)對植物DNA病毒存在抑制作用[69]。Ji等[70]通過在擬南芥和煙草中表達Cas9/sgRNA，驗證了其對甜菜曲頂病毒(單鏈DNA病毒)的抑制作用，并發(fā)現(xiàn)在sgRNA的引導(dǎo)下，Cas9能夠引起植物病毒多個關(guān)鍵功能區(qū)(如IR區(qū))核苷酸序列的刪減或突變，而這種作用對菜豆黃矮病毒(單鏈DNA病毒)同樣有效[71]，體現(xiàn)了該系統(tǒng)對植物DNA病毒的作用能力具有普遍適用性。

雖然近幾年來CRISPR/Cas9系統(tǒng)作為一種精確改寫基因組的便捷工具受到了很多學(xué)者的青睞(表1)，但是， 對于難以轉(zhuǎn)化的植物而言， 有效利用CRISPR/Cas9技術(shù)進行基因組編輯時存在著巨大挑戰(zhàn)。 最近，Zhang等[72]報道了一種無轉(zhuǎn)基因的CRISPR/Cas9基因組編輯方法，在小麥愈傷組織細(xì)胞中瞬時表達CRISPR/Cas9的DNA或RNA，再用這些細(xì)胞再生出整個植株。結(jié)果顯示，以瞬時表達為基礎(chǔ)的基因組編輯系統(tǒng)高度有效，能夠產(chǎn)生無轉(zhuǎn)基因的、純合的小麥突變體。隨后，他們將該方法用于六倍體面包小麥和四倍體硬粒小麥中，產(chǎn)生的突變體沒有檢出任何轉(zhuǎn)基因成分。研究指出，這種方法可以應(yīng)用到其他植物中去，加快植物基因組工程研究的速度。

3 CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展前景

CRISPR/Cas9技術(shù)作為一種新興的基因編輯技術(shù)，與前期的鋅指核酸酶(ZFNs)和TALE核酸酶(TALENs)系統(tǒng)相比，有以下優(yōu)點：(1) 只要靶序列上含有NGG(PAM)，就可以對其前面的20 bp的序列進行基因編輯，作用效率高；(2) 能夠同時作用于不同靶位點，成本低；(3) 由于Cas9的基因是相同的，不同的靶位點只需設(shè)計不同的sgRNA，所以載體構(gòu)建流程簡便；(4) CRISPR/Cas系統(tǒng)還可以完成不能利用TALENs等技術(shù)編輯的基因的定點修飾。

當(dāng)然，CRISPR/Cas9技術(shù)在發(fā)展過程中也存在一些問題，比如脫靶效應(yīng)和編輯位置的限制等。為了減少CRISPR/Cas9系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)，科學(xué)家們提出了以下一些策略[73]。(1) 通過全基因組同源性檢索選擇出具有最少潛在脫靶位點的導(dǎo)向序列，在這些選出的導(dǎo)向序列中，選擇脫靶錯配集中在導(dǎo)向序列PAM近端的sgRNAs[74-75]。(2) 使用長度較短的導(dǎo)向序列(17-19 nt)[76]。(3) 采用雙切口酶策略。使用一對位置靠近的sgRNAs，Cas9切割酶可以引入兩個靠近的單鏈切口，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂。這種方法已在細(xì)胞系中被證實可以將脫靶活性降低50～1500倍，并在小鼠受精卵中實現(xiàn)基因敲除而不影響靶向切割效率[77-78]。(4) 采用dCas9-FokI策略。利用一對間距優(yōu)化和定位的sgRNAs，與Fok1核酸酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合的dCas9可以形成二聚體，導(dǎo)致DNA雙鏈斷裂，這與ZFN和TALEN的設(shè)計相似。利用這種策略可以大大提高基因編輯的特異性[79-80]。

總之，CRISPR/Cas9技術(shù)由于其諸多優(yōu)點，在短時間內(nèi)受到了全球眾多科學(xué)家的青睞，成為生物學(xué)領(lǐng)域重要的研究熱點之一，為基因的定點修飾和編輯開辟了一條新的道路。我國是世界上旱、寒和鹽堿等災(zāi)害最為嚴(yán)重的國家之一，草類植物資源十分豐富。長期生存于干旱、低溫、土壤貧瘠和鹽堿化等嚴(yán)酷環(huán)境下的野生植物在漫長的進化過程中，形成了獨特的逆境適應(yīng)機制，蘊涵著豐富的抗逆基因資源，在優(yōu)良牧草和農(nóng)作物抗性遺傳改良方面具有潛在的應(yīng)用價值。然而，由于這些野生植物生活周期長、遺傳背景和生物學(xué)性狀十分復(fù)雜，很難利用傳統(tǒng)的基因突變技術(shù)對其功能基因展開系統(tǒng)研究。因此，CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展無疑為研究野生草類植物抗逆基因的功能提供了強有力的技術(shù)支持，從而為系統(tǒng)闡明這些植物的逆境響應(yīng)機制、并將其用于栽培作物的遺傳改良帶來了曙光。值得一提的是，目前在豆科牧草蒺藜苜蓿中利用CRISPR/Cas9技術(shù)已經(jīng)實現(xiàn)了基因功能的研究，這為其他牧草功能基因的研究奠定了良好的基礎(chǔ)[66]?？梢灶A(yù)見，隨著技術(shù)的不斷發(fā)展完善，CRISPR/Cas9系統(tǒng)及其相關(guān)的衍生技術(shù)將在植物關(guān)鍵功能基因的鑒定以及作物和優(yōu)良牧草分子設(shè)計育種等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，從而造福于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展和生態(tài)環(huán)境安全。

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CRISPR/Cas9: A gene targeting technology and its application in the study of plant genetic function

BAO Ai-Ke*, BAI Tian-Hui, ZHAO Tian-Xuan, SU Jia-Hao

StateKeyLaboratoryofGrasslandAgro-ecosystems,CollegeofPastoralAgricultureScienceandTechnology,LanzhouUniversity,Lanzhou730020,China

CRISPR/Cas (clustered regularly interspaced short palindromic repeats) was derived from the adaptive immune system of bacteria and archaea to resist attacks from invasive viruses and exogenous DNA. Comparing zinc finger nuclease (ZFN) and transcription activator-like effector nuclease (TALENs), the type II CRISPR/Cas9 system mediated by RNA breaks new ground for gene editing due to its efficiency, low cost and ease of operation for the study of genetic function. This review summarizes recent research and progress of the structure, mechanisms and application of CRISPR/Cas9 for the study of genetic function and crop breeding. We also investigate the potential future development of CRISPR/Cas9.

gene editing； CRISPR/Cas9 system； gene function； molecular breeding

10.11686/cyxb2016430

2016-11-14；改回日期：2017-02-14

國家自然科學(xué)基金(31670405，31372360)， 甘肅省科技支撐計劃項目(144FKCA058)和蘭州大學(xué)中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費專項資金(lzujbky-2016-4)資助。

包愛科(1980-)，男，甘肅岷縣人，副教授。E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author. E-mail: baoaik@lzu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

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