占今舜，鄔彩霞，劉明美,3，蘇效雙，詹康，趙國琦*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；3.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院,江蘇 淮安 223200)

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飼糧添加苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃菌群的影響

占今舜1,2，鄔彩霞1，劉明美1,3，蘇效雙1，詹康1，趙國琦1*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225009；2.江西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，江西 南昌 330200；3.江蘇聯(lián)合職業(yè)技術(shù)學(xué)院淮安生物工程分院,江蘇 淮安 223200)

本試驗(yàn)旨在研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)和組成的影響。選取4頭裝有瘺管的頭胎荷斯坦奶牛，試驗(yàn)采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，每頭奶牛每天飼喂全混合飼糧(TMR)，其中分別添加0 g(A組)、20 g(B組)、60 g(C組) 和 100 g(D組)苜蓿黃酮。試驗(yàn)分為4期，每期24 d。每期采集瘤胃液，提取總DNA后在Illumina MiSeq 平臺(tái)上進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果為：1)4個(gè)處理組共產(chǎn)生52747個(gè)OTU，共享16142個(gè)OTU，占總OTU數(shù)量的30.60%，其中試驗(yàn)A組的OTU數(shù)量最高。2)Shannon指數(shù)隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，試驗(yàn)C組的Simpson指數(shù)顯著高于試驗(yàn)D組和A組(P<0.05)，但各處理組間的ACE和Chao 1指數(shù)無顯著性差異。3)各試驗(yàn)組間的細(xì)菌門的數(shù)量沒有顯著性差異，但試驗(yàn)C組的細(xì)菌屬的數(shù)量顯著高于試驗(yàn)B組和試驗(yàn)A組(P<0.05)。在門水平上，SR1門相對(duì)豐度隨著苜蓿黃酮添加水平的升高呈線性升高的趨勢(shì)(0.05

苜蓿；黃酮類化合物；微生物；瘤胃；奶牛

反芻動(dòng)物瘤胃是一個(gè)厭氧的生態(tài)系統(tǒng)，里面存在大量的細(xì)菌、原蟲、真菌和古生菌等微生物，它是一個(gè)自然纖維素降解系統(tǒng)[1]。因此，研究瘤胃中的微生物種類和數(shù)量的改變有助于了解反芻動(dòng)物消化代謝的作用機(jī)理。黃酮類化合物是植物次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于植物中[2]。苜蓿(Medicagosativa)中含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用在奶牛生產(chǎn)中。黃酮類物質(zhì)是苜蓿草中含量比較豐富的次生代謝產(chǎn)物，其在提高奶牛生產(chǎn)中可能發(fā)揮著重要的作用。Orhana 等[3]發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能夠抑制綠農(nóng)假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌等細(xì)菌和克魯斯假絲酵母等真菌以及病毒。研究發(fā)現(xiàn)，富含黃酮化合物的印度苦楝樹(Azadirachtaindica)種子提取物和意大利薊(Carduuspycnocephalus)葉子提取物能夠降低瘤胃原蟲的數(shù)量，而含黃酮化合物的問荊草(Equisetumarvense)提取物、貫葉金絲桃(Hypericumperforatum)花提取物和鼠尾草(Salviajaponica)葉提取物對(duì)原蟲的數(shù)量沒有影響[4-6]。另外，據(jù)Oskoueian等[7]研究報(bào)道，黃酮、楊梅酮、兒茶素、蘆丁和山奈酚能夠降低瘤胃微生物數(shù)量，柚皮苷和槲皮素能夠抑制產(chǎn)甲烷菌和原蟲。以上結(jié)果表明，黃酮類化合物能夠調(diào)節(jié)瘤胃微生物菌群，而且不同來源和結(jié)構(gòu)的黃酮類化合物對(duì)瘤胃微生物的影響結(jié)果不同。目前，苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃微生物的影響研究尚未見報(bào)道。研究微生物生態(tài)學(xué)的方法有很多，高通量測(cè)序技術(shù)由于其能全面地反映樣品微生物結(jié)構(gòu)的優(yōu)點(diǎn)，而被廣泛應(yīng)用于研究反芻動(dòng)物瘤胃微生物[8]。因此，本試驗(yàn)通過16s DNA高通量測(cè)序方法研究苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃微生物區(qū)系的影響，探討苜蓿黃酮是如何改變微生物區(qū)系來影響瘤胃的消化代謝，為苜蓿黃酮的應(yīng)用提供一些參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)和飼養(yǎng)管理

試驗(yàn)于2015年4月在上海光明荷斯坦牧業(yè)有限公司星火奶牛二場(chǎng)進(jìn)行。選取4頭裝有瘤胃、小腸和回腸瘺管的頭胎荷斯坦奶牛[平均體重為(500±25) kg，泌乳天數(shù)為(79±6) d]，試驗(yàn)采用4×4拉丁方設(shè)計(jì)，每頭奶牛每天飼喂全混合飼糧(total mixed ration,TMR)中分別添加0 g(A組)、20 g(B組)、60 g(C組) 和 100 g(D組)的苜蓿黃酮(含量為50%，由陜西綠清生物工程有限公司提供)作為試驗(yàn)處理。進(jìn)行4期動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)，每期為24 d，其中預(yù)飼期為10 d。奶牛采用拴式飼養(yǎng)方式，自由飲水，每天飼喂3次，分別為06:30、13:30 和19:30，每日擠奶3次，時(shí)間分別為10:00、16:00和22:00。飼糧配方及營養(yǎng)水平見表1。粗蛋白、纖維和鈣、磷等參照張麗英[9]的方法進(jìn)行檢測(cè)，產(chǎn)奶凈能參照楊鳳[10]的方法進(jìn)行計(jì)算。

1.2 樣品采集

每個(gè)試驗(yàn)期的第18天，在晨飼前半個(gè)小時(shí)打開牛瘤胃瘺管采集瘤胃液。在瘤胃的前后、左右采集瘤胃內(nèi)容物，然后將內(nèi)容物經(jīng)過4層紗布過濾獲得瘤胃液。將瘤胃液裝入凍存管中，放在液氮中凍存，后轉(zhuǎn)移到-80 ℃進(jìn)行保存。

1.3 瘤胃微生物DNA提取

將瘤胃液放在超純水中進(jìn)行解凍，吸取300 μL的瘤胃液進(jìn)行微生物DNA的提取。提取方法參照試劑盒(TIANamo Stool DNA Kit，天根)上的說明書進(jìn)行，將提取的DNA 樣品在Qubit 2.0 熒光光度計(jì)(Invitrogen，美國)上進(jìn)行濃度的測(cè)定，并用0.8%瓊脂糖凝膠進(jìn)行純度的檢測(cè)。取5～50 ng瘤胃微生物總DNA，用MetaVxTM文庫的制備試劑盒進(jìn)行文庫的制備(GENEWIZ，美國)。根據(jù)金唯智公司自主合成的V3、V4和V5區(qū)引物進(jìn)行測(cè)序。設(shè)計(jì)通用引物如表2 所示。

第一次PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系，體系組成為：TransStart Buffer (10×)，2.5 μL；TransStart Taq (2.5 U/μL)，0.5 μL；dNTPs (2.5 mmol/L)，2.0 μL；(3+8) primer mix (1×)，2.5 μL；DNA(30～50 ng)，3.0 μL；Molecular water，14.5 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，57 ℃退火90 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行14個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 5 min，10 ℃ 保存。第二次PCR擴(kuò)增采用50 μL反應(yīng)體系，體系組成為：TransStart Buffer (10×)，2.5 μL；TransStart Taq (2.5 U/μL)，0.5 μL；dNTPs (2.5 mmol/L)，2.0 μL；primer cocktail (1×)，4.0 μL；D50×/D70×，6.0 μL；Molecular water，10.0 μL；(3+8) amplification production，25.0 μL。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸10 s，進(jìn)行10個(gè)循環(huán)，最后72 ℃ 延伸 5 min，10 ℃ 保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)過質(zhì)量檢測(cè)后，根據(jù)說明書上所記載的步驟，在Illumina MiSeq儀器上進(jìn)行DNA文庫的構(gòu)建，然后使用2×250 或 2×300雙端進(jìn)行測(cè)序。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平(干物質(zhì)基礎(chǔ))Table 1 Nutrient level and composition of feed (dry matter basis)

1) 精料補(bǔ)充料包含Concentrate supplement contained：玉米Corn 158.30 g/kg，豆粕Soybean meal 35.30 g/kg，大豆皮Soybean hull 52.90 g/kg，酒糟Distillers dried grains with soluble 54.90 g/kg，啤酒糟Brewer’s grain 16.70 g/kg，食鹽Sodium chloride 2.20 g/kg，碳酸鈣Calcium carbonate 3.50 g/kg，碳酸氫鈣Calcium hydrophosphate 4.40 g/kg，碳酸氫鈉Sodium bicarbonate 3.30 g/kg.

2) 預(yù)混料每kg含The premix contained the following per kg of diets：維生素A Vitamin A 3000 IU，維生素D Vitamin D 31400 IU，維生素E Vitamin E 30 IU，鐵Iron 100 mg，銅Copper 10 mg，鋅Zinc 35 mg，錳Manganese 20 mg，碘Iodine 0.30 mg，硒Selenium 0.10 mg，鈷Cobalt 0.08 mg.

3) 產(chǎn)奶凈能為計(jì)算值，其他為實(shí)測(cè)值。 Net energy for lactation was calculated and the others were measured.

表2 V3、V4和V5區(qū)引物序列Table 2 Sequence of primer for V3, V4 and V5

1.4 數(shù)據(jù)分析

通過軟件CASAVA(V1.8.2)，對(duì)測(cè)序結(jié)果原始圖像數(shù)據(jù)進(jìn)行圖像堿基識(shí)別，經(jīng)過質(zhì)量分析，得到測(cè)序數(shù)據(jù)。通過軟件Qiime(v1.7)，使用 UCLUST方法進(jìn)行operational taxonomic unit(OTU)聚類，對(duì)在97%的相似水平下所有序列進(jìn)行OTU劃分并進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。然后根據(jù)ACE(http://www.mothur.org/wiki/Ace)和Chao(http://www.mothur.org/wiki/Chao)指數(shù)來分析環(huán)境群落的物種豐度，根據(jù)Simpson(http://www.mothur.org/wiki/Simpson)和Shannon(http://www.mothur.org/wiki/Shannon)指數(shù)分析群落的多樣性。通過weighted uniFrac距離矩陣進(jìn)行 PCoA 作圖分析，使用 UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類方法，基于 weighted unifrac距離矩陣，將樣品進(jìn)行聚類。

α多樣性等數(shù)據(jù)采用SAS 9.2軟件的 PROC GLM 程序進(jìn)行方差分析。分析模型為Yijkl=μ+Pi+Cj(l)+Tk+Eijk，其中Yijkl為因變量值，μ為總體均值，Pi為試驗(yàn)期效應(yīng)(i=1～4)，Cj(l)為第l拉丁方內(nèi)第j試驗(yàn)?zāi)膛５碾S機(jī)效應(yīng)(j=1～4)，Tk為飼糧處理效應(yīng)(k=1～4)，Eijk為隨機(jī)誤差。數(shù)據(jù)采用線性和二次線性回歸分析以及Duncan法進(jìn)行多重比較，P≤0.05 表示差異顯著，而0.05

2 結(jié)果與分析

2.1 苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌豐富度和多樣性的影響

試驗(yàn)4期16個(gè)樣品共產(chǎn)生2771189條有效序列，經(jīng)過優(yōu)化后得到2487653條優(yōu)質(zhì)序列，平均序列長(zhǎng)度為437 nt。試驗(yàn)A組的有效序列和優(yōu)質(zhì)序列均最高，隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，有效序列和優(yōu)質(zhì)序列呈先降低后升高趨勢(shì)(表3)。從圖1可知，各試驗(yàn)組的樣品稀釋曲線趨于平緩，隨著測(cè)序深度的增加，OTU數(shù)量將不再增加，說明測(cè)序數(shù)量比較合理?；?7%相似性的原則進(jìn)行OTU分析(圖2)，4個(gè)處理組共產(chǎn)生52747個(gè)OTU，各組分別產(chǎn)生OTU數(shù)量為36421(A)、34185(B)、34756(C)和36310(D)，其中共享16142個(gè)OTU，占總OTU數(shù)量的30.60%。從表3中可知，各組的ACE和Chao1指數(shù)無顯著性差異，說明苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌豐度無顯著影響。隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高，Shannon指數(shù)呈先上升后下降的趨勢(shì)；試驗(yàn)C組的Simpson指數(shù)顯著高于試驗(yàn)D組和A組(P<0.05)，且隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后降低趨勢(shì)；試驗(yàn)C組細(xì)菌屬的數(shù)量顯著高于試驗(yàn)B組和A組(P<0.05)。說明苜蓿黃酮能夠影響細(xì)菌的多樣性。

表3 苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌豐富度和多樣性的影響Table 3 Effect of flavonoids from alfalfa on the richness and diversity of microbe

注：ACE和Chao1指數(shù)表示細(xì)菌豐富度，香濃和辛普森指數(shù)表示細(xì)菌的多樣性。A、B、C和D表示試驗(yàn)組分別為0,20,60和100 g苜蓿黃酮組。不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Note: ACE and Chao1 indexes show the richness of microbe; Shannon and Simpson indexes show the diversity of microbe. A, B, C and D show the experimental groups with 0, 20, 60 and 100 g alfalfa flavonoids, respectively. In the same row, values with different lowercase letters mean significant differences (P<0.05), the same letter or no letter mean no significant differences (P>0.05).The same below.

圖1 各個(gè)樣品的稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves of all samples

圖2 OTU 維恩圖Fig.2 OTU venn

表4 苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)的影響(門水平)Table 4 Effect of flavonoids from alfalfa on composition and structure of microbe (at the phyla level) %

表5 苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)的影響(屬水平)Table 5 Effect of flavonoids from alfalfa on composition and structure of microbe (at the genus level) %

2.2 苜蓿黃酮對(duì)細(xì)菌組成和結(jié)構(gòu)的影響

在門水平上(表4)，隨著苜蓿黃酮的添加水平的升高，SR1門相對(duì)豐度呈線性升高趨勢(shì)(0.05

2.3 聚類分析

通過主坐標(biāo)分析可知(圖3)，各試驗(yàn)組的樣品均能很好地分開，對(duì)各試驗(yàn)組進(jìn)行聚類分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)A和B組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似，試驗(yàn)C和D組細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)比較相似。結(jié)果說明，苜蓿黃酮對(duì)瘤胃菌群結(jié)構(gòu)具有影響作用。

圖3 PcoA分析Fig.3 Analysis by principal co-ordinate analysis

圖4 UPGMA 聚類樹分析Fig.4 Analysis by UPGMA tree

3 討論

高通量測(cè)序技術(shù)可以快速、高效地了解瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)和種類，已廣泛應(yīng)用于研究反芻動(dòng)物瘤胃微生物菌群[11-12]。黃酮類化合物具有抑制細(xì)菌生長(zhǎng)的作用，而瘤胃微生物生態(tài)群落比較復(fù)雜，因此，通過高通量測(cè)序技術(shù)可以更全面地了解苜蓿黃酮對(duì)瘤胃微生物區(qū)系的影響。

Shannon和Simpson指數(shù)是用來估算微生物多樣性的指標(biāo)。Simpson指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高；Shannon指數(shù)越大，說明群落多樣性越高。在本試驗(yàn)中，Shannon和Simpson指數(shù)隨苜蓿黃酮添加劑量的升高呈先上升后降低的趨勢(shì)。另外，細(xì)菌屬的數(shù)量隨苜蓿黃酮添加水平的升高而呈先升高后降低的趨勢(shì)。結(jié)果說明，瘤胃細(xì)菌的多樣性隨苜蓿黃酮添加水平(20～60 g)的升高而升高，但添加100 g時(shí)，瘤胃細(xì)菌的多樣性下降。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物能夠通過抑制細(xì)菌核酸的合成和破壞細(xì)菌細(xì)胞膜，進(jìn)而產(chǎn)生抗菌作用[13]。而且，黃酮的抑菌作用隨著濃度增加而增強(qiáng)[14]。因此，苜蓿黃酮添加劑量超過60 g，降低瘤胃細(xì)菌多樣性的原因可能是黃酮濃度高，發(fā)揮強(qiáng)抑菌和殺菌作用，進(jìn)而降低瘤胃中細(xì)菌的種類和多樣性。0 g組和20 g組細(xì)菌門的數(shù)量和屬的數(shù)量比較接近，60 g組和100 g組細(xì)菌門的數(shù)量和屬的數(shù)量比較接近。因此，0 g組和20 g組細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)相似度比較高，60 g組和100 g組的細(xì)菌群落的結(jié)構(gòu)相似度比較高。

Kim等[15]研究發(fā)現(xiàn)，反芻動(dòng)物瘤胃微生物的厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)和變形菌門(Proteobacteria)數(shù)量最多，占細(xì)菌總門數(shù)量的91%。另外，對(duì)安格斯西口塔爾公牛和水牛瘤胃微生物宏基因組研究結(jié)果與其相似[16-17]。本試驗(yàn)得出相似的結(jié)果。互養(yǎng)菌門是一類革蘭氏陰性厭氧細(xì)菌，廣泛存在于動(dòng)物腸道、土壤等厭氧環(huán)境中[18]。在本試驗(yàn)中，低濃度的苜蓿黃酮互養(yǎng)菌門相對(duì)豐度低，且隨著苜蓿黃酮添加劑量的升高其相對(duì)豐度呈升高趨勢(shì)。出現(xiàn)這種情況可能是高濃度苜蓿黃酮能夠抑制與其發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)、拮抗細(xì)菌的生長(zhǎng)，進(jìn)而促進(jìn)互養(yǎng)菌門細(xì)菌的生長(zhǎng)，而低劑量發(fā)揮抑制的效果較弱所致。在本試驗(yàn)中，SR1門相對(duì)豐度隨苜蓿黃酮添加劑量的升高呈線性升高趨勢(shì)?？赡苁屈S酮類化合物抑制了與其競(jìng)爭(zhēng)、拮抗的細(xì)菌，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)。

在屬水平上，普雷沃菌屬為反芻動(dòng)物瘤胃微生物的優(yōu)勢(shì)菌屬，其幾乎可以單獨(dú)完成或參與瘤胃內(nèi)所有飼糧成分的降解[9]。從試驗(yàn)結(jié)果來看，苜蓿黃酮在一定程度上可能會(huì)有提高瘤胃普雷沃菌屬數(shù)量的作用。從本試驗(yàn)中可知，飼糧中添加苜蓿黃酮能夠提高厚壁菌門，毛螺菌科的毛螺菌屬、假丁酸弧菌屬和Shuttleworthia屬的相對(duì)豐度，而這些屬的細(xì)菌能夠發(fā)酵碳水化合物。但是苜蓿黃酮可能會(huì)對(duì)該科下的Blautia屬和Marvinbryantia屬產(chǎn)生抑制作用。結(jié)果說明苜蓿黃酮可能會(huì)影響飼料中的碳水化合物的消化和代謝。厭氧弧菌屬能夠水解甘油三酯產(chǎn)生甘油和脂肪酸，并將甘油轉(zhuǎn)化成丙酸和琥珀酸。從本試驗(yàn)的結(jié)果來看，苜蓿黃酮可能會(huì)對(duì)飼料中脂肪的消化和代謝具有影響作用，但添加劑量升高，作用會(huì)降低?；ヰB(yǎng)菌屬(Synergistes)是一種新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌屬，從反芻動(dòng)物中分離出的能夠以精氨酸和組氨酸作為底物，降解動(dòng)物飼料中的毒素，幫助動(dòng)物生存[19]。從本試驗(yàn)中可知，瘤胃互養(yǎng)菌屬相對(duì)豐度隨飼糧中添加苜蓿黃酮?jiǎng)┝康纳叱噬呲厔?shì)，說明苜蓿黃酮可能有助于降低飼料中的毒素進(jìn)而可能影響奶牛的生產(chǎn)性能。錐形桿菌屬(Pyramidobacter)是最近幾年剛發(fā)現(xiàn)的新菌屬，通過培養(yǎng)其主要終末代謝產(chǎn)物是乙酸、少量的異戊酸和痕跡量到少量的丙酸、異丁酸、琥珀酸、苯乙酸[20]。從本試驗(yàn)中可知，苜蓿黃酮可能具有抑制該菌屬的作用，從而會(huì)影響瘤胃乙酸的生成。

4 結(jié)論

1)飼糧中添加苜蓿黃酮能夠影響瘤胃細(xì)菌屬的數(shù)量和細(xì)菌的多樣性，但對(duì)細(xì)菌豐富度沒有影響。

2)在門水平上，隨著苜蓿黃酮添加量的升高能夠提高SR1門和互養(yǎng)菌門細(xì)菌相對(duì)豐度的趨勢(shì)。在屬水平上，苜蓿黃酮能提高SP3-e08屬、U29-B03屬、互養(yǎng)菌屬、厭氧弧菌屬和Shuttleworthia屬細(xì)菌的相對(duì)豐度，而能夠降低錐形桿菌屬、Marvinbryantia屬和Blautia屬細(xì)菌的相對(duì)豐度。

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Effects of alfalfa flavonoids as dietary additives on bacterial flora in the rumen of dairy cows

ZHAN Jin-Shun1,2, WU Cai-Xia1, LIU Ming-Mei1,3, SU Xiao-Shuang1, ZHAN Kang1, ZHAO Guo-Qi1*

1.CollegeofAnimalScienceandTechnology,YangzhouUniversity，Yangzhou225009,China；2.InstituteofAnimalHusbandryandVeterinary,JiangxiAcademyofAgriculturalSciences,Nanchang330200,China；3.JiangsuJointInstituteofTechnologyofProfessionofHuai’anBio-engineeringBranch,Huai’an223200,China

The objective of this study was to examine the effects of alfalfa flavonoids on the bacterial flora in the rumen of dairy cows. Four primiparous Holstein cows fitted with ruminal cannulas were used in a 4×4 Latin square design and were fed a total mixed ration containing 0, 20, 60, or 100 g alfalfa flavonoids per day (group A-D, respectively). The experiment had four periods and each period lasted 24 days. The ruminal fluid was collected during each period. Total bacterial DNA was extracted from the ruminal fluid, and 16S RNA sequences were obtained using the Illumina MiSeq platform. In total, 52747 operational taxonomic units (OTUs) were generated, and 16142 OTUs were shared by four groups, accounting for 30.60% of the total OTUs. The largest amount of OTUs was in group A. As the amount of alfalfa flavonoids in the diet increased, the Shannon index first increased and then decreased, but the abundance-based coverage estimator and Chao 1 indexes were unaffected. Simpson’s index was significantly higher for group C than for groups A and D (P<0.05). There were more bacterial genera in group C than in groups B and A, but the number of phyla in each group was not affected by the amount of alfalfa flavonoids in the diet. At the phylum level, the relative abundance of SR1 tended to increase linearly (0.05

alfalfa; flavonoids; microorganism; rumen; dairy cow

10.11686/cyxb2016358

2016-09-21；改回日期：2016-11-17

江蘇省高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目(PAPD)，江蘇省農(nóng)業(yè)三新工程項(xiàng)目(SXGC[2016]326)和江蘇省高校研究生科研創(chuàng)新計(jì)劃項(xiàng)目(KYZZ_0367)資助。

占今舜(1985-)，男，江西玉山人，博士。E-mail:zhanjinshun1985@163.com

*通信作者Corresponding author. E-mail: gqzhao@yzu.edu.cn

http://cyxb.lzu.edu.cn

占今舜, 鄔彩霞, 劉明美, 蘇效雙, 詹康, 趙國琦. 飼糧添加苜蓿黃酮對(duì)奶牛瘤胃菌群的影響. 草業(yè)學(xué)報(bào), 2017, 26(7): 82-89.

ZHAN Jin-Shun, WU Cai-Xia, LIU Ming-Mei, SU Xiao-Shuang, ZHAN Kang, ZHAO Guo-Qi. Effects of alfalfa flavonoids as dietary additives on bacterial flora in the rumen of dairy cows. Acta Prataculturae Sinica, 2017, 26(7): 82-89.