王瀚 叢文銘

·國家基金研究進展綜述·

雙表型肝細胞癌新亞型的臨床病理學研究進展*

王瀚 叢文銘

雙表型肝細胞癌（dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC）是近年報道的肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）的一種新亞型，以組織學上為典型的肝細胞癌但同時表達肝細胞癌和肝內(nèi)膽管癌（intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC）的基因標志物為特征，因其具有HCC和ICC的雙重生物學行為，惡性程度更高，臨床預后差，因而正確診斷十分重要。CK19是DPHCC診斷的重要標志物之一，可以通過多種途徑參與DPHCC的發(fā)生和惡性生物學行為的調(diào)控。本文擬從DPHCC的臨床病理特點、免疫組織化學標記、組織起源發(fā)生等方面對DPHCC的研究進展進行綜述。

雙表型肝細胞癌 診斷 CK19 組織發(fā)生 腫瘤異質(zhì)性

雙表型肝細胞癌（dual-phenotype hepatocellular carcinoma，DPHCC）是2011年報道的肝細胞癌（hepa?tocellular carcinoma，HCC）的一種新亞型，發(fā)生率約占HCC的10%［1］。DPHCC是指在組織病理學上表現(xiàn)為典型的HCC，但以同時表達任意HCC標志物（如Hep Par-1、pCEA、GPC-3等）和任意肝內(nèi)膽管癌（intrahe?patic cholangiocarcinoma，ICC）標志物（如CK19/CK7、MUC-1、CA19-9等）為基本特征，因具有HCC和ICC的雙重生物學行為，微血管侵犯和肝內(nèi)外轉(zhuǎn)移的發(fā)生率更高，臨床預后更差，因此正確診斷十分重要。本文擬從DPHCC的診斷、免疫組織化學特點、組織起源等方面對DPHCC的研究進展進行綜述。

1 DPHCC的臨床病理特點

與普通型HCC患者的一般臨床表現(xiàn)相比，DPHCC患者在發(fā)病年齡、HBV感染病史、血清AFP含量升高等方面無顯著差異。但由于DPHCC細胞同時開放HCC看家基因AFP和ICC看家基因CA19-9，因而部分DPHCC患者可出現(xiàn)血清AFP和CA19-9含量同時升高的獨特現(xiàn)象，提示DPHCC的可能，而DPHCC患者的轉(zhuǎn)移風險和復發(fā)風險更高，臨床預后更差。在病理學上，DPHCC在組織學及細胞學上呈現(xiàn)出典型的HCC特征，如癌細胞呈多邊形，胞漿豐富嗜酸性，排列成肝板樣梁索狀結構，梁索間有血竇相隔。因而，DPHCC的診斷主要依賴于免疫組織化學檢查，當腫瘤具有單一的HCC成分，同時強表達任意一種HCC和ICC蛋白標志物的癌細胞數(shù)量＞15%時，可診斷為DPHCC［1］。從理論上講，術前肝穿刺組織做免疫組織化學檢查有可能會發(fā)現(xiàn)DPHCC，但由于HCC具有高度的腫瘤異質(zhì)性，因此穿刺小組織標本診斷DPHCC可能會有較高的假陰性。

需要提出的是，DPHCC在一個腫瘤結節(jié)內(nèi)僅表現(xiàn)出單一的HCC組織學成分，但DPHCC細胞呈雙向分化和雙向基因開放的特點，因此可同時表達HCC和ICC的蛋白標志物［1-4］。這不同于經(jīng)典的肝細胞癌-膽管癌混合型肝癌（combined hepatocellular chol?angiocarcinoma，CHC），后者是指在一個腫瘤結節(jié)內(nèi)含有明確的HCC和ICC兩種組織學成分，并分別表達HCC和ICC的免疫組織化學標志物［5］。DPHCC的診斷和鑒別診斷要點見表1。

2 CK19在DPHCC發(fā)生中的意義

免疫組織化學標記是診斷DPHCC的主要方法，相比較于CK7和MUC-1等膽管細胞標志物，CK19顯示出較高的敏感性和特異性，是病理學診斷膽管癌和DPHCC的最常用標志物之一。從對DPHCC的檢測結果看，Hep Par-1和pCEA的陽性率分別為89.7%和91.0%；CK19、MUC-1和CA19-9的陽性率分別為80.6%、38.7%和20.7%，可以酌情組合使用上述標志物以提高 DPHCC 的檢出率［1，6］。Kim 等［6］對 137 例HCC組織微陣列檢測發(fā)現(xiàn)，92%的CK19陽性HCC細胞共表達至少1種肝臟祖細胞（hepatic progenitor cells，HPC）標志物，而其他HPC標志物如EpCAM、ckit、CD133等蛋白單獨表達更為常見，提示CK19較其他HPC標志物的特異性更高。目前也有研究試圖探索 DPHCC 的術前診斷，Kawai等［7］發(fā)現(xiàn)CK19陽性HCC細胞與葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter-1，GLUT1）的表達和脫氧葡萄糖（fluorodeoxyglucose，F(xiàn)DG）的蓄積呈正相關，CK19可以通過TGFβ/Smad通路及其下游的靶基因GLUT1來調(diào)控HCC細胞對18FFDG的攝取。因此，設想可采用18F-FDG-PET影像學檢測方法來評估HCC組織中CK19的表達狀況，進而為建立CK19陽性HCC的新型靶向治療策略提供依據(jù)。

表1 DPHCC、HCC、ICC和CHC的診斷和鑒別診斷要點Table 1 Diagnostic and differential diagnosis of DPHCC,HCC,ICC,and CHC

CK19不僅是診斷DPHCC的重要標志物，同時也是提示DPHCC惡性生物學行為和不良預后的重要指標。本研究組對1 530例手術切除HCC樣本的觀察發(fā)現(xiàn)，DPHCC占HCC的10.1%，且DPHCC相比于普通型HCC的分化程度更差，包膜侵犯（61.3%vs.34.0%）、衛(wèi)星灶（65.2%vs.29.9%）和癌栓（54.2%vs.30.2%）發(fā)生率更高。DPHCC患者的總生存期（over?all survival，OS）為（30.4±3.7）個月，無瘤生存期（recur?rence-free survival，RFS）為（13.2±2.0）個月，均分別顯著低于普通型HCC的（43.6±3.9）個月和（23.4±2.5）個月。相比于其他ICC標志物，CK19的表達是OS和RFS的獨立危險因素［1］。Feng等［8］對一組多中心346例HCC標本的分析發(fā)現(xiàn)，CK19陽性HCC占19.94%，具有更加惡性的生物學行為，肝內(nèi)轉(zhuǎn)移（44.92%vs.23.1%）、微血管侵犯（62.32%vs.41.16%）、淋巴結轉(zhuǎn)移（10.14%vs.2.53%）和遠處轉(zhuǎn)移（11.59%vs.1.08%）更為常見，OS和累積RFS更短。Fatourou等［9］對89例HCC樣本的研究發(fā)現(xiàn)，CK19陽性HCC占10.11%，CK19表達與否與微血管侵犯的發(fā)生（87.5%vs.51.6%）呈正相關，同時也是OS（OR=3.845）和RFS（OR=7.84）的獨立危險因素。此外，Miltiadous等［10］對132例超米蘭標準接受肝移植患者的研究顯示，CK19陰性的HCC肝移植患者與符合米蘭標準的HCC肝移植患者的術后5年生存率無顯著差異，但CK19陽性患者相比于CK19陰性患者的5年生存率要更低（19.4%vs.53.1%），這一研究結果也為HCC患者肝移植適應證和受體的科學選擇提供了新指標。

CK19可以通過多條途徑參與DPHCC惡性生物學行為的調(diào)控。Kim等［5］通過對43例HCC的實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR的研究發(fā)現(xiàn)，過表達CK19 mRNA的HCC的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transi?tion，EMT）相關基因（如Snail、Twist）和侵襲相關基因（如uPAR、MMP2）的mRNA表達量更高，并與CK19 mRNA表達水平呈正相關。Govaere等［11］報道，CK19陽性的HCC過表達侵襲/轉(zhuǎn)移相關標志物（如VASP、TACSTD2、LAMB1）、膽管上皮細胞/HPC相關標志物（如CD133、GSTP1、NOTCH2）以及miRNA 200家族成員（如miR-141、miR-200c），而且CK19陽性HCC細胞的侵襲性和化療藥物抵抗性更強，敲除CK19基因的HCC細胞株的侵襲性則會明顯降低，對5-氟尿嘧啶、多柔比星和索拉非尼的耐藥性也會隨之顯著下降。Kawai等［12］通過對外源增強CK19基因表達的人HCC細胞系的研究發(fā)現(xiàn)，這類HCC細胞表現(xiàn)出高增殖活性和對5-氟尿嘧啶耐藥性，將這類HCC細胞移植到免疫抑制小鼠體內(nèi)，能促進EMT和TGFβ/Smad通路的激活，也可通過CK19基因敲除或TGFβR1抑制劑治療而抑制該通路的活性，因而CK19可能是一個有潛在治療價值的分子靶點。Takano等［13］通過3種人HCC細胞系（HepG2、Huh-7和PLC/PRF5）的研究發(fā)現(xiàn)，人HCC細胞系在CK19基因沉默后可上調(diào)E-cadherin基因的表達、下調(diào)血管生成相關基因（如VASH1、VASH2、FGFR1）的表達，提示EMT和血管生成相關基因可能是CK19陽性HCC的重要治療靶點。

3 DPHCC的起源

從目前研究結果看，DPHCC的起源可能主要涉及兩種起源方式：HPC起源模式和HCC去分化模式。

3.1 HPC起源模式

鑒于DPHCC同時表達肝細胞標志物和膽管上皮細胞標志物，因此DPHCC可能來源于具有雙向分化潛能的 HPC［1，3］。HPC（在嚙齒類動物中稱為卵圓細胞）是肝臟的儲備細胞，具有肝細胞與膽管上皮細胞雙向分化潛能，主要在肝臟損傷時發(fā)揮修復作用［14-16］，已有許多研究顯示，HPC與HCC的發(fā)生密切相關［17-19］。

Lee等［20］通過對小鼠HPC、成熟肝細胞與人HCC細胞系的基因表達數(shù)據(jù)的交叉對比研究發(fā)現(xiàn)，部分過表達HPC標志物CK7和CK19的HCC細胞與小鼠在13～16天胚胎發(fā)育期的HPC基因表達相同，提示表達CK19的HCC細胞可能來源于具有雙向分化潛能的HPC。HCC組織中肝細胞核因子-1β（hepato?cyte nuclear factor-1beta，HNF-1β）的表達程度與CK7和CK19的表達程度呈正相關，而HNF-1β是骨橋蛋白（osteopontin，OPN）基因表達的調(diào)控因子，OPN則是HPC增殖、遷移、分化與癌變的重要調(diào)節(jié)因子［21，22］。因此，推測HPC有可能在HNF-1β和OPN的調(diào)控下形成CK19陽性HCC。Govaere等［23］對18例HCC的分析發(fā)現(xiàn)，層粘蛋白laminin-332存在于形態(tài)學上類似HPC的HCC細胞周圍，能夠提高HCC細胞CK19的表達。鑒于laminin是構成HPC細胞外微環(huán)境的重要細胞外基質(zhì)蛋白并對HPC表型的維持起到重要作用，也提示CK19陽性HCC可能起源于HPC。

3.2 HCC去分化模型

腫瘤異質(zhì)性是腫瘤在生長過程中，子代腫瘤細胞出現(xiàn)了基因或者表觀遺傳學等發(fā)面的變異，從而使腫瘤的生長速度、侵襲能力、藥物抗性等方面發(fā)生顯著差異［24］。腫瘤異質(zhì)性也普遍存在于HCC中［25］，DPHCC組織中并非所有癌細胞均表達CK19等ICC標志物，也說明DPHCC同樣存在顯著的腫瘤異質(zhì)性。

Kowalik等［26］對肝細胞抵抗型（resistant-hepato?cyte，R-H）和膽堿-甲硫氨酸缺乏型（choline-methio?nine deficient，CMD）兩種大鼠HCC模型的研究發(fā)現(xiàn)，CK19陽性HCC中表達CK19的細胞并非HPC（卵圓細胞）克隆擴增的結果，而是癌前病變中的成熟肝細胞在惡性轉(zhuǎn)化和生物侵襲性增強的過程中逐漸表達CK19。他們觀察到，盡管HCC表達CK19，但是其癌前病灶的CK19是陰性的，只是在HCC發(fā)展的過程中，部分HCC細胞開始表達CK19，提示CK19的表達是HCC去分化的結果而不是HPC的標志物。另外，CK19陰性的HCC癌前病灶與HPC的基因表達譜不同。Lai等［27］對57例HCC經(jīng)肝動脈化療栓塞（trans?catheter arterial chemoembolization，TACE）后手術切除樣本的研究發(fā)現(xiàn)，TACE治療部位的HCC細胞過表達低氧標志物CAIX，同時也表達CK19，但未治療腫瘤區(qū)域的癌細胞則不表達CAIX和CK19，提示TACE造成的低氧環(huán)境，能夠誘導CK19陰性HCC細胞轉(zhuǎn)化為CK19陽性HCC細胞，提示CK19陽性HCC是因HCC在經(jīng)歷了低氧打擊后經(jīng)去分化途徑轉(zhuǎn)變而來。因此，DPHCC的發(fā)生也有可能是在HCC內(nèi)部存在高度異質(zhì)性的背景下，部分HCC細胞發(fā)生去分化的結果，對此還需要進一步開展深入研究。

4 結論

DPHCC作為HCC的一種新亞型，因其高度惡性的生物學特性與不良的預后而具有重要的臨床診治意義。DPHCC的精細分型可為臨床提高對HCC亞型的認識和治療水平提供重要的病理學依據(jù)。ICC標志物CK19基因的開放和表達是DPHCC的重要分子特征，CK19參與了DPHCC相關信號通路的激活與抑制，增強了DPHCC的增殖活性和侵襲與轉(zhuǎn)移能力，是判斷HCC惡性程度、預測復發(fā)風險和評估臨床預后的重要生物標志物。由于CK19與藥物的耐藥性和敏感性相關，CK19有可能成為DPHCC分子靶向治療的重要靶點。

綜上所述，DPHCC是研究HCC異質(zhì)性、克隆起源、組織發(fā)生、分子分型和靶向治療的重要病理模型，值得關注。今后應在DPHCC的生物學行為特點、起源發(fā)生機制和臨床治療策略等方面開展深入研究，以進一步豐富DPHCC的理論認識和提高臨床HCC亞型的診治水平。

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（2017-01-18收稿）（2017-04-23修回）

（編輯：鄭莉 校對：武斌）

Research progress on clinicopathology in dual-phenotype hepatocellular carcinoma

Han WANG,Wenming CONG

Wenming CONG;E-mail:wmcong@smmu.edu.cn
Department of Pathology,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Second Military Medical University;Key Laboratory of Signaling Regulation and Targeting Therapy of Liver Cancer,Second Military Medical University,Ministry of Education;Shanghai Key Laboratory of Hepatobiliary Tumor Biology,Eastern Hepatobiliary Surgery Hospital,Shanghai 200438,China
This work was supported by the National Natural Science Foundation of China(No.81472278)and Funds for Creative Research Groups of National Natural Science Foundation of China(No.81521091)

Dual-phenotype hepatocellular carcinoma(DPHCC)is a novel subtype of hepatocellular carcinoma(HCC).DPHCC presents the classical morphology of HCC but simultaneously expresses the biomarkers of HCC and intrahepatic cholangiocarcinoma(ICC).Accurate diagnosis of DPHCC is necessary because of its combined biological behaviors of HCC and ICC,highly malignant degree,and infaust clinical prognosis.CK19 is an important marker of DPHCC and regulates the clonal origin and biological behavior of DPHCC in various pathways.In this paper,we reviewed the research progress of DPHCC focusing mainly on its clinicopathological features,immunohistochemical biomarkers,and histogenesis.

DPHCC,diagnosis,CK19,histogenesis,tumor heterogeneity

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.071

第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院病理科，教育部重點實驗室（肝癌分子網(wǎng)絡調(diào)控與靶向干預），上海市肝膽腫瘤生物學重點實驗室（第二軍醫(yī)大學東方肝膽外科醫(yī)院）（上海市200438）

*本文課題受國家自然科學基金（編號：81472278）和國家自然科學基金委創(chuàng)新群體基金（編號：81521091）資助

叢文銘 wmcong@smmu.edu.cn

王瀚 專業(yè)方向為肝膽腫瘤病理學。

E-mail：ehbhwanghan@126.com