張慧 劉模榮 董輝 徐靖宇 謝睿 文國榮 劉蓮花

·基礎(chǔ)研究·

TRPV5 TRPV6對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生物學(xué)行為的影響*

張慧①劉模榮①董輝②徐靖宇①謝睿①文國榮①劉蓮花①

目的：觀察TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平及細(xì)胞增殖、凋亡、遷移等生物學(xué)行為的影響。方法：給予TRPV5、TRPV6通道激動劑1-25（OH）2D3及抑制劑CuCl2作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后，采用免疫組織化學(xué)法、Western blot及實時熒光定量PCR技術(shù)檢測TRPV5、TRPV6蛋白及TRPV5、TRPV6 mRNA表達(dá)的變化。使用高速離子成像系統(tǒng)觀察結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的變化；通過MTT法、TUNEL法及劃痕修復(fù)法觀察結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、凋亡及遷移的變化。結(jié)果：1-25（OH）2D3明顯上調(diào)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5、TRPV6 mRNA及蛋白表達(dá)水平，使結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平增加，促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移及抑制其凋亡（P＜0.05）。CuCl2明顯下調(diào)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中TRPV5、TRPV6蛋白及mRNA表達(dá)，使結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平降低（P＜0.05），抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、遷移及促進(jìn)細(xì)胞的凋亡（P＜0.05）。結(jié)論：結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)水平的變化，能通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平影響細(xì)胞的增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)行為。

結(jié)腸癌 鈣離子通道 TRPV5 TRPV6 Ca2+

結(jié)腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病機(jī)制目前尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)在肝癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中均伴隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的改變［1-2］，TRPV5和TRPV6是瞬時性受體電位通道（TRP）超家族中的成員，是一種與Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的存在于細(xì)胞膜上的特定蛋白質(zhì)，其功能受1-25（OH）2D3、甲狀旁腺激素（PTH）、飲食鈣、雌激素和藥物等影響的調(diào)節(jié)［3］，與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、分化及侵襲密切相關(guān)［4］。通過調(diào)控細(xì)胞內(nèi)的鈣信號及其相關(guān)的信號通路能夠影響腫瘤的增殖、遷移、凋亡等多種生物學(xué)行為。本研究擬應(yīng)用TRPV5和TRPV6通道激動劑1-25（OH）2D3和抑制劑CuCl2作用于結(jié)腸癌SW480細(xì)胞，觀察藥物作用前后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平變化，以及對細(xì)胞的增殖、遷移及凋亡的影響。希望通過對鈣信號及其調(diào)控的通道的研究，為結(jié)腸癌的治療尋找新的機(jī)制及治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

人結(jié)腸癌細(xì)胞株SW480細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所，并常規(guī)消化傳代保存。TRPV5、TRPV6多克隆抗體購自美國Abcam公司，GTVisionT?MIII抗鼠/兔通用型免疫組織化學(xué)檢測試劑盒購自上?；蚩萍加邢薰?，引物合成于上海生工公司。Fura-2鈣熒光染料購自美國Invitrogen公司。1-25（OH）2D3購自美國SIGMA公司，CuCl2購自上海國產(chǎn)分析純試劑。改良型RPMT 1640培養(yǎng)基和Hyclone胎牛血清購自美國Hyclone公司。凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒和MTT試劑盒購自南京凱基生物公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和RT-PCR擴(kuò)增試劑盒購自大連TakaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的改良型RPMT 1640培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為5%CO2、飽和濕度、恒溫37℃，靜置培養(yǎng)。對細(xì)胞常規(guī)進(jìn)行換液、消化、傳代。

1.2.2 觀察不同藥物對SW480細(xì)胞形態(tài)變化的影響 將對數(shù)期的結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)消化、傳代、計數(shù)，分別接種在3個培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)24 h后，其中兩組分別加10-8mol/L 1-25（OH）2D3和100 μmol/L Cu?Cl2，另一組不加藥物處理作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，傾去上層懸浮細(xì)胞后將培養(yǎng)皿置于倒置顯微鏡下，觀察不同藥物對SW480細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量變化的影響。

1.2.3 免疫組織化學(xué)法檢測結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中TRPV5、TRPV6的表達(dá) 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)消化傳代后接種、分組、加藥（分別加入10-8mol/L 1-25（OH）2D3和100 μmol/L CuCl2），培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，然后固定爬片、封閉，每張玻片滴加稀釋好的一抗（TRPV5：PBS=1:3 000/TRPV6：PBS=1:3 000）；以PBS代替一抗，其他步驟不變作為陰性對照，4℃孵育過夜，滴加即用型二抗、孵育、浸洗、滴加顯色劑DAB液約50 μL/片（1:50），并在光鏡下控制顯色，顯色完全后及時終止顯色；蘇木素復(fù)染5min；自來水沖洗10min，1%鹽酸酒精分化3 s；自來水水洗返藍(lán)；待玻片自然干后用中性樹膠封片。

1.2.4 RT-PCR實驗 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)消化傳代后接種、分組、加藥（同免疫組織化學(xué)法）、培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞，采用Trizol提取法抽提細(xì)胞總RNA，沉淀用100 μL二乙基焦碳酸酯處理水溶解，紫外分光光度計測定總RNA濃度（OD260/OD280比值為1.8～2.0）后，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將mRNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA（200 ng/μL）備用。使用Bio-Rad iQ5。TRPV5的上游引物為：5'-GACAAGGAGGATGACCAGGA-3'；下游引物為：5'-AGGGAGGSSGTTGGAAGAGC-3'。TRPV6的上游引物為：5'-CCTTTGCTGCCTGTGTGA AC-3'；下游引物為：5'-GCTGGAGGATGAGGATGTG T-3'。擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃ 30 s、95℃ 5 s、60℃ 30 s進(jìn)行40個循環(huán)。采用相對定量2-ΔΔCt法計算藥物處理SW480細(xì)胞前后TRPV5及TRPV6基因表達(dá)的倍數(shù)關(guān)系。

1.2.5 Western blot檢測 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)消化傳代后接種、分組、加藥（同免疫組織化學(xué)法），培養(yǎng)結(jié)束后收集細(xì)胞采用RIPA提取細(xì)胞蛋白，采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度。取蛋白液加入等量的上樣緩沖液后在100℃煮沸5 min，配置10%的分離膠10 mL和5%積層膠，上樣電泳結(jié)束后轉(zhuǎn)膜2 h、采用5%脫脂奶粉封閉、TBST溶液洗膜后加入一抗4℃孵育過夜（1:1 000稀釋，TRPV5/TRPV6的分子量均為83 kDa）、洗膜后再加入二抗孵育2 h，采用化學(xué)熒光法（ECL）顯色曝光、凝膠成像系統(tǒng)分析條帶灰度值后分析統(tǒng)計。

1.2.6 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+測定 將結(jié)腸癌SW480細(xì)胞常規(guī)消化、計數(shù)、接種，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，將實驗分為正常對照組（PBS）、刺激通道組（10-8mol/L 1-25（OH）2D3）、阻斷通道組（100 μmol/L CuCl2）。用PBS液漂洗細(xì)胞3次，每次2 min，然后加入鈣的發(fā)光劑Fura-2（Fura-2：PBS=1:1 000），室溫避光孵育負(fù)載60 min，孵育結(jié)束再用PBS液漂洗3次，以充分洗去胞外留的Fura-2，然后再用PBS浸泡30 min使Fura-2去酯化，待上機(jī)測定；將準(zhǔn)備好的細(xì)胞爬片和灌流槽放置于倒置熒光顯微鏡上，實驗開始時先用PBS液灌流結(jié)腸癌SW480細(xì)胞3 min，待條件穩(wěn)定細(xì)胞適應(yīng)后，開始進(jìn)行檢測，先找到細(xì)胞層面，用340 nm波長的激光激發(fā)Ca2+熒光探針Fura-2發(fā)射熒光，用CCD拍攝熒光的動態(tài)變化并通過鈣熒光成像系統(tǒng)進(jìn)行分析。

1.2.7 MTT比色法 對SW480細(xì)胞進(jìn)行常規(guī)消化、計數(shù)、種板，按2×104個細(xì)胞/孔接種于96孔板中，每孔加入細(xì)胞懸液200 μL；邊緣孔用無菌PBS填充；5%CO2、37℃孵育靜置培養(yǎng)；24 h后待細(xì)胞穩(wěn)定貼壁，同時設(shè)置對照組（加細(xì)胞及培養(yǎng)液）、空白孔（只加培養(yǎng)基）、溶劑對照組（加入乙醇使其終濃度為0.1%）及藥物實驗組，分別加入1-25（OH）2D3用0.1%乙醇溶解的相應(yīng)培養(yǎng)液，使其終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6mol/L；CuCl2的濃度為1.0、10、100、200 μmol/L，每組設(shè)5個平行孔，經(jīng)孵育后在酶聯(lián)免疫檢測儀上測定波長OD490nm對應(yīng)OD值，有效實驗重復(fù)3次。結(jié)果分析統(tǒng)計：細(xì)胞生長抑制率（%）=（對照組吸光值-實驗組吸光值）/對照組吸光值×100%；細(xì)胞生長增殖率（%）=（實驗組吸光值-對照組吸光值）/對照組吸光值×100%。

1.2.8 細(xì)胞遷移實驗 在12孔板背面用消毒的直尺和Marker筆間隔0.5 cm劃線，一般劃4～5條，用于標(biāo)記；制備單層細(xì)胞，待細(xì)胞長到80%～90%劃痕：用200 μL滅菌槍頭在貼壁的單層細(xì)胞上呈“一”字劃痕；于劃痕后0、24、48 h，在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度并照相，再次拍照前棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗3次后在倒置顯微鏡下尋找到原位置拍照對比。細(xì)胞遷移能力計算的公式：遷移指數(shù)（%）=（初始劃痕寬度-愈合后劃痕寬度）/初始劃痕寬度×100%。

1.2.9 TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡 將結(jié)腸癌SW480組織進(jìn)行常規(guī)消化、計數(shù)、爬片、分組、加藥（同免疫組織化學(xué)法），培養(yǎng)48 h后，固定、0.1%Triton X-100通透、滴加封閉液封閉，然后浸洗；制作陽性片（按凱基TUNEL細(xì)胞凋亡原位檢測試劑盒說明書），TUNEL染色中凋亡率的統(tǒng)計分析，陽性結(jié)果判定：以細(xì)胞核染成棕色或棕褐色者為陽性細(xì)胞，在高倍鏡下任意選5個視野，每個視野下計數(shù)200個細(xì)胞（細(xì)胞總數(shù)），并按公式計算出結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡指數(shù)（apopto?sis index，AI）=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 免疫組織化學(xué)法檢測1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白的表達(dá)變化

免疫組織化學(xué)法測定結(jié)果顯示TRPV5、TRPV6的表達(dá)定位主要在細(xì)胞膜及胞漿中（棕黃色區(qū)域），激動劑1-25（OH）2D3組TRPV5、TRPV6的陽性表達(dá)明顯增強(qiáng)，而抑制劑CuCl2組TRPV5、TRPV6陽性表達(dá)明顯減弱，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖1）。

圖1 免疫組織化學(xué)法測定各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白的表達(dá)Figure 1 Protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cells by immunocytochemistry

2.2 Western blot檢測1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白的表達(dá)變化

Western blot檢測結(jié)果顯示TRPV5、TRPV6均為單一目的條帶（分子量為83 kDa），1-25（OH）2D3刺激結(jié)腸癌SW480后TRPV5、TRPV6蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，相反CuCl2作用后TRPV5、TRPV6的蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖2）。

圖2 Western blot測定各組結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6蛋白的表達(dá)Figure 2 Protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cells by Western blot analysis

2.3 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6 mRNA水平的表達(dá)變化

RT-PCR的方法檢測顯示1-25（OH）2D3刺激結(jié)腸癌SW480后TRPV5、TRPV6的mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，相反CuCl2作用后TRPV5、TRPV6的mRNA表達(dá)水平卻明顯下調(diào)，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.4 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化

在Ca2+熒光探針（Fura-2）的標(biāo)記下，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+顯示為綠色熒光，隨著細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的上升，胞內(nèi)結(jié)合態(tài)染料濃度升高，其在340 nm左右的吸收峰增強(qiáng)。用1-25（OH）2D3（10-8mol/L）作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度較對照組表達(dá)增加。用 CuCl2（100 μmol/L）作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)Ca2+熒光強(qiáng)度較對照組表達(dá)降低，兩者比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖3）。腸癌SW480細(xì)胞形態(tài)變化的影響。未經(jīng)藥物作用的SW480細(xì)胞融合成單層，細(xì)胞為梭形、三角形或者多邊形，并可見處于分裂相的細(xì)胞（圖4A）。經(jīng)1-25（OH）2D3作用后，SW480細(xì)胞融合致密成單層，細(xì)胞間連接緊密，邊界清楚，胞漿豐富，并可見多個處于分裂相的細(xì)胞（圖4B）。經(jīng)CuCl2作用后，細(xì)胞逐漸皺縮變長、細(xì)胞間隙增大、分裂相細(xì)胞數(shù)目減少，有部分細(xì)胞失去原貼壁形態(tài)（圖4C）。

表1 TRPV5、TRPV6mRNA在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中的表達(dá) （x±s）Table 1 Expression levels of TRPV5 and TRPV6 mRNA in SW480 colon cancer cell in terms of mean±SD

圖3 1-25(OH)2D3、CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的影響（F340 nm×400）Figure 3 Intracellular Ca2+in SW480 colon cancer cells treated with 1-25(OH)2D3and CuCl2(F340nm×400)

2.5 1-25（OH）2D3和CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長的影響

2.5.1 1-25（OH）2D3和CuCl2作用前后細(xì)胞形態(tài)的變化 在倒置顯微鏡下觀察不同藥物作用48 h后對結(jié)

圖4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用48 h后結(jié)腸癌SW480細(xì)胞形態(tài)（×200）Figure 4 Effect of 48 h treatment of 1-25(OH)2D3and CuCl2on SW480 colon cancer cell morphology

2.5.2 1-25（OH）2D3和CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖的影響 MTT結(jié)果證實不同濃度的1-25（OH）2D3和CuCl2分別刺激結(jié)腸癌SW480細(xì)胞24、48和72 h后，1-25（OH）2D3對SW480細(xì)胞有促增殖作用，而Cu?Cl2則對SW480細(xì)胞的增殖具有抑制作用，且呈時間劑量依賴性，10-8mol/L的1-25（OH）2D3和100 μmol/L CuCl2在刺激SW480細(xì)胞72 h后對增殖的影響最明顯，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表2，3）。

表2 1-25(OH)2D3對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長增殖的影響（OD490/增殖率）（n≥3，x±s）Table 2 Effect of 1-25(OH)2D3on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/proliferation rate,n＞3)in terms of mean±SD

表3 CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長增殖的影響（OD490/抑制率）（n≥3±s）Table 3 Effect of CuCl2on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/inhibiting rate,n＞3)in terms of mean±SD

表3 CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生長增殖的影響（OD490/抑制率）（n≥3±s）Table 3 Effect of CuCl2on the proliferation of SW480 colon cancer cells(OD490/inhibiting rate,n＞3)in terms of mean±SD

*:Versus control group,P＜0.05

Group(mol/L)Control 1 10 100 200 24 h 48 h 72 h OD4900.455±0.019 0.429±0.021*0.412±0.002*0.358±0.018*0.325±0.042*Inhibiting rate(%)0 5.79 9.45 21.32 28.57 OD4900.627±0.021 0.573±0.017*0.548±0.007*0.372±0.024*0.349±0.006*Inhibiting rate(%)0 8.47 12.41 40.54 44.22 OD4900.731±0.016 0.684±0.022*0.624±0.021*0.426±0.021*0.398±0.002*Inhibiting rate(%)0 10.34 14.56 41.67 45.51

2.5.3 1-25（OH）2D3和CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞凋亡的影響 經(jīng)TUNEL法檢測凋亡細(xì)胞，在光學(xué)顯微鏡下觀察，凋亡細(xì)胞體積縮小，核固縮，邊界清楚，細(xì)胞質(zhì)淡染，染色質(zhì)呈特異的棕黃色著染。正常培養(yǎng)組可見少量凋亡細(xì)胞；1-25（OH）2D3作用組可見到極少量的凋亡細(xì)胞，CuCl2作用組可見到大量的凋亡細(xì)胞，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，表4）。

表4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）Table 4 Comparison of SW480 colon cancer cell apoptosis induced by 1-25(OH)2D3and CuCl2for 48 h in terms of mean±SD

表4 1-25(OH)2D3、CuCl2作用結(jié)腸癌SW480細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡率的比較 （±s）Table 4 Comparison of SW480 colon cancer cell apoptosis induced by 1-25(OH)2D3and CuCl2for 48 h in terms of mean±SD

*:Versus control group,P＜0.05;#:versus 1-25(OH)2D3group,P＜0.05

Group Control 1-25(OH)2D3CuCl2n10 10 10 Positive cells 6.333±1.528 2.667±0.577*50.667±2.512*#AI(%)3.16 1.33 25.33

2.6 1-25（OH）2D3和CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移能力的影響

劃痕實驗結(jié)果顯示，初始時所有組的劃痕寬度基本上相等。經(jīng)1-25（OH）2D3和CuCl2分別作用24、48 h后，1-25（OH）2D3對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移有明顯的促進(jìn)作用，而CuCl2對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞遷移有抑制作用，組間比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，圖5，6）。

圖5 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞劃痕實驗Figure 5 Migration of SW480 colon cancer cell during scratch test

圖6 結(jié)腸癌SW480細(xì)胞劃痕實驗（標(biāo)尺：500 μm）Figure 6 Migration of SW480 colon cancer cell scratch test(bar:500 μm)

3 討論

TRPV5和TRPV6是TRP超家族中目前唯一已知的兩種Ca2+高選擇性通道，其主要負(fù)責(zé)Ca2+由細(xì)胞外向細(xì)胞內(nèi)的主動跨膜運(yùn)輸，在機(jī)體內(nèi)參與多項生理活動的調(diào)節(jié)，包括肌肉收縮、遞質(zhì)釋放、細(xì)胞增殖、遷移及細(xì)胞凋亡等［5］。TRPV6是在腸上皮中表達(dá)的鈣通道蛋白，主要位于結(jié)腸吸收表面的頂膜中，是一種可以調(diào)節(jié)腸鈣吸收的速度和程度的蛋白質(zhì)，其功能受1-25（OH）2D3通過VDR信號通路的調(diào)節(jié)。TRPV5主要表達(dá)于腎小管上皮細(xì)胞，在結(jié)腸組織中僅有少量表達(dá)。這可能與TRPV5和TRPV6蛋白結(jié)構(gòu)的不同有關(guān)［6］。有研究發(fā)現(xiàn)，TRPV6在前列腺癌中的表達(dá)水平隨惡性程度及轉(zhuǎn)移程度的加深而增加，敲除TRPV6可抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，認(rèn)為可能與其能促進(jìn)鈣內(nèi)流，激活NFAT有關(guān)［7］。在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中，TRPV6在正常結(jié)腸組織、潰瘍性結(jié)腸炎、結(jié)腸腺瘤及結(jié)腸腺癌中表達(dá)逐漸增加［8-9］。TRPV6在Ⅰ期結(jié)腸癌中的表達(dá)為66%，在Ⅱ期結(jié)腸癌中的表達(dá)為17%，在Ⅲ、Ⅳ期結(jié)腸癌中卻幾乎無表達(dá)，認(rèn)為TRPV6表達(dá)增高主要發(fā)生在結(jié)腸癌早期，而這種伴隨結(jié)腸黏膜增生的TRPV6異常高表達(dá)可通過高鈣飲食來減弱甚至逆轉(zhuǎn)［6］。SOR-C13（一種TRPV6的抑制劑）被臨床用來治療胰腺癌并取得一定療效［10］。上述研究表明TRPV6表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡密切相關(guān)，但具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

本研究發(fā)現(xiàn)TRPV5、TRPV6在結(jié)腸癌SW480細(xì)胞中表達(dá)于胞膜及胞漿。1-25（OH）2D3（10-8mol/L）能上調(diào)TRPV5和TRPV6 mRNA及蛋白的表達(dá)，而與之相反，CuCl2（100 μmol/L）則下調(diào)TRPV5和TRPV6 mRNA及蛋白表達(dá)，組間相比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。經(jīng)高速離子成像系統(tǒng)測定發(fā)現(xiàn)，1-25（OH）2D3通過增加結(jié)腸癌SW480細(xì)胞TRPV5和TRPV6通道的表達(dá)，促使細(xì)胞外Ca2+經(jīng)鈣通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，增加了細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平；而CuCl2作用則與之相反。可能與1-25（OH）2D3和CuCl2影響了TRPV5、TRPV6的活性有關(guān)。

隨著TRPV5和TRPV6表達(dá)的變化及細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平的改變，結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為也受到相應(yīng)的影響。本研究通過MTT、劃痕法、TUNEL法研究發(fā)現(xiàn)，1-25（OH）2D3能促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和遷移，抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡（P＜0.05）；而CuCl2則抑制結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖和遷移（P＜0.05），促進(jìn)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的凋亡（P＜0.05）。1-25（OH）2D3和CuCl2分別在濃度10-8mol/L和100 μmol/L作用48 h較明顯，表現(xiàn)出一定的時間劑量依賴性。提示TRPV5、TRPV6可通過控制Ca2+的內(nèi)流，來調(diào)節(jié)結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的增殖、遷移、凋亡等生物學(xué)行為［11］，其機(jī)制可能與下調(diào)p-AKT/GSK3信號通路有關(guān)［12］。

本實驗僅通過改變TRPV5、TRPV6功能狀態(tài)觀察其對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞生物學(xué)行為的影響，但TRPV5、TRPV6對結(jié)腸癌SW480細(xì)胞增殖、遷移、凋亡的確切機(jī)制尚不明確，其可能通過調(diào)控Ca2+影響細(xì)胞周期，或者與相關(guān)調(diào)節(jié)基因表達(dá)有關(guān)。TRPV5、TRPV6之間有無競爭性或協(xié)同性，以及在正常組織細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞、離體細(xì)胞與機(jī)體組織細(xì)胞之間作用有無差異，尚需進(jìn)一步研究。

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（2017-02-03收稿）

（2017-06-24修回）

Effect of TRPV5 and TRPV6 channels on the biological behaviors of SW480 colon cancer cell line

Hui ZHANG1,Morong LIU1,Hui DONG2,Jingyu XU1,Rui XIE1,Guorong WEN1,Lianhua LIU1

Morong LIU;E-mail:zylmr@163.com
1Department of Gastroenterology,Affiliated Hospital,Zunyi Medical College,Zunyi 563003,China;2Division of Gastroenterology,Department of Medicine,University of California,San Diego,School of Medicine,San Diego 92103,USA
This work was supported by Guizhou International Science and Technology Cooperation Program(No.G(2014)7014)

Objective:To investigate the role of TRPV5 and TRPV6 in intracellular calcium regulation and biological behaviors of SW480 colon cancer cells.Methods:qRT-PCR,Western blot,and immunocytochemistry were applied to determine the mRNA and protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 colon cancer cell line upon treatment with TRPV5 and TRPV6 agonist,1-25(OH)2D3,and inhibitor,CuCl2.The change of intracellular Ca2+level was examined with a confocal laser scanning microscope.Scratch test,MTT,and TUNEL assays were used to analyze the cell migration,proliferation,and apoptosis,respectively.Results:As an agonist of TRPV5 and TRPV6,1-25(OH)2D3significantly up-regulated the mRNA and protein expression levels of TRPV5 and TRPV6 in SW480 cell lines.On the other hand,CuCl2,being an inhibitor of TRPV5 and TRPV6,effectively down-regulated the TRPV5 and TRPV6 mRNA and protein expression levels(P＜0.05).The intracellular calcium concentration in SW480 cell line significantly increased upon treatment with 1-25(OH)2D3,and significantly decreased with CuCl2treatment(P＜0.05).1-25(OH)2D3promoted cell proliferation and migration,and inhibited apoptosis of SW480 cell in a time-and dose-dependent manner(P＜0.05).However,CuCl2significantly repressed cell proliferation and migration and induced apoptosis(P＜0.05).Conclusion:TRPV5 and TRPV6 can affect the biological behaviors of colon cancer SW480 cells by regulating intracellular Ca2+level.

colon cancer,calcium channel,TRPV5,TRPV6,Ca2+

10.3969/j.issn.1000-8179.2017.12.114

①遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科（貴州省遵義市563003）；②美國加利福尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院胃腸科

*本文課題受貴州省國際科技合作計劃項目［編號：黔科合G字（2014）7014號］資助

劉模榮 zylmr@163.com

張慧 專業(yè)方向為早期結(jié)腸癌臨床及基礎(chǔ)研究。

E-mail：zhanghui1892@foxmail.com