楊玉琪

摘要：顆粒酶是細(xì)胞毒細(xì)胞發(fā)揮作用的效應(yīng)蛋白之一。本文綜述了顆粒酶的分子生物學(xué)特性，顆粒酶在ⅧV感染中的作用，及中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)對(duì)顆粒酶作用的研究進(jìn)展。

關(guān)鍵詞：顆粒酶；HIV感染；細(xì)胞毒細(xì)胞

中圖分類號(hào)：R512.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1007-2349（2017）03-0089-02

在HIV感染中，由細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（Cytotoxie T Lym-phoeyte，CTL）和自然殺傷細(xì)胞（Natural killer cell，NK）介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì)于抑制HIV復(fù)制、延緩疾病進(jìn)展發(fā)揮重要作用。顆粒酶是細(xì)胞毒性細(xì)胞所具有的重要效應(yīng)分子之一，在病毒感染的病原清除和靶細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。本文將顆粒酶在HIV感染中的作用研究進(jìn)展作一綜述。

1顆粒酶的分子生物學(xué)特性

顆粒酶是存在于細(xì)胞毒性淋巴細(xì)胞胞漿顆粒的一組同源性的絲氨酸蛋白酶（serine protease），與穿孔素（pore-formingprotein，PFP）一起儲(chǔ)存于胞漿顆粒中，并一起通過(guò)胞吐作用釋放至靶細(xì)胞間隙，協(xié)同作用致靶細(xì)胞損傷。人顆粒酶包括顆粒酶A、B、K、H等，與疾病相關(guān)的免疫效應(yīng)關(guān)系較密切的是顆粒酶A（granzyme A，GzmA）、顆粒酶B（gaanzyme B，GzmB），尤以GzmB為最多見且極具價(jià)值。

人的GzmA基因定位于5號(hào)染色體上，GzmA分子是Ha-nuka因子cDNA編碼產(chǎn)物，由兩個(gè)分子量為27KD的單體通過(guò)二硫化合物連接成50KD的同源二聚體，具有類胰蛋白酶的性質(zhì)，在體內(nèi)能緩慢引起靶細(xì)胞DNA斷裂。人的GzmB基因定位于14號(hào)染色體上，GzmB是人類淋巴細(xì)胞蛋白酶（HLP）cD-NA編碼的產(chǎn)物，分子量有30KD、32KD、35KD 3種形式，經(jīng)葡萄糖苷酶水解后均剩下一個(gè)27KD的蛋白核心，說(shuō)明3種形式的GzmB是同一蛋白帶有不同的糖基。GzmB具有門冬氨酸酶的活性，是主要效應(yīng)分子，能迅速引起靶DNA斷裂，作用強(qiáng)于GzmA。

活化的CTL和NK細(xì)胞是機(jī)體細(xì)胞毒細(xì)胞，能清除機(jī)體內(nèi)的病毒感染細(xì)胞、胞內(nèi)菌、腫瘤細(xì)胞并介導(dǎo)移植排斥反應(yīng)、自身免疫病和移植物抗宿主病。顆粒酶是活化的CTL和NK細(xì)胞的效應(yīng)分子，主要介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。GzmA、GzmB含量最豐富，表達(dá)上亦早于其它顆粒酶。GzmA主要誘導(dǎo)一種easpases非依賴性的細(xì)胞凋亡，它通過(guò)顆粒的胞吐作用釋放，在PFP協(xié)同作用下進(jìn)入靶細(xì)胞的細(xì)胞漿中，并聚集在細(xì)胞核，通過(guò)裂解SET復(fù)合物釋放的脫氧核糖核酸酶NM23-H1對(duì)染色體DNA形成單股DNA鏈切（缺）口而引起DNA斷裂，最終引起靶細(xì)胞的凋亡。GzmB最初以酶原的形式合成，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中加工去除N端信號(hào)肽后，貯存于CTL的顆粒中。當(dāng)CTL識(shí)別靶細(xì)胞時(shí)，GzmB N端的酸性二肽被切除，成為活性形式?；钚孕虶zmB可通過(guò)穿孔素或受體進(jìn)入靶細(xì)胞，切割含Asp-X，Glu-X位點(diǎn)的多種結(jié)構(gòu)和功能蛋白，引起細(xì)胞凋亡。

2顆粒酶在HIV感染中的作用

人體感染了HIV后很快建立了特異性的細(xì)胞免疫反應(yīng)和體液免疫反應(yīng)以清除病毒。特異性的中和抗體可以迅速中和細(xì)胞外病毒，阻止其侵入易感細(xì)胞及在體內(nèi)擴(kuò)散，但無(wú)法殺死細(xì)胞內(nèi)病毒，細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)可通過(guò)溶解病毒感染細(xì)胞或分泌抗病毒因子殺滅細(xì)胞內(nèi)病毒。因此，細(xì)胞免疫反應(yīng)在人體抵御病毒感染中起著中心和基礎(chǔ)的作用。細(xì)胞免疫反應(yīng)主要包括由NK細(xì)胞介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)和由CD₈⁺的CTL介導(dǎo)的獲得性免疫反應(yīng)，二者構(gòu)成了機(jī)體防御病毒感染和轉(zhuǎn)化細(xì)胞的主要機(jī)制。

在HIV感染中，由CTL和NK細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性對(duì)于抑制HIV復(fù)制、延緩疾病進(jìn)展發(fā)揮著重要作用，HIV特異性CTL在特異性抗體產(chǎn)生前即能檢測(cè)到，能有效降低病毒載量，早期CTL反應(yīng)的強(qiáng)弱直接影響HIV感染后進(jìn)展為艾滋病的時(shí)間；NK細(xì)胞是機(jī)體抵御HIV和機(jī)會(huì)性感染的第一道防線。文獻(xiàn)報(bào)道，CTL和NK細(xì)胞數(shù)量異常存在于艾滋病疾病進(jìn)程的不同階段，但其功能損傷機(jī)制及評(píng)價(jià)指標(biāo)尚無(wú)定論。CTL和NK細(xì)胞對(duì)HIV的控制都主要通過(guò)顆粒胞吐途徑溶解病毒感染細(xì)胞，顆粒酶是這一機(jī)制中重要的效應(yīng)分子之一。

顆粒酶的釋放是CTL特異殺傷的基礎(chǔ)，活化的CTL通過(guò)特異識(shí)別靶細(xì)胞，含有顆粒酶的胞漿分泌顆粒在CTL內(nèi)重新定位于靶細(xì)胞接觸的細(xì)胞膜位點(diǎn)，然后將顆粒酶和穿孔素分泌到細(xì)胞間隙。細(xì)胞毒細(xì)胞的活化過(guò)程伴隨有顆粒酶的合成產(chǎn)生過(guò)程，CTL識(shí)別靶細(xì)胞后，一方面以細(xì)胞排粒的方式分泌顆粒酶，一方面又迅速合成顆粒酶，新合成的顆粒酶既能直接持續(xù)分泌到細(xì)胞外，又能“再充入”胞漿顆粒中貯存起來(lái)，以供殺傷下一個(gè)靶細(xì)胞。

HIV特異性CD₈⁺T淋巴細(xì)胞能控制HIV的復(fù)制，延緩疾病進(jìn)程，這與HIV特異性CD₈⁺T淋巴細(xì)胞利用PEP和GzmB或CD95L直接殺傷被HIV-1感染的細(xì)胞，從而清除感染原密切相關(guān)。北京協(xié)和醫(yī)院李太生教授等研究發(fā)現(xiàn)，CD₈⁺T淋巴細(xì)胞在對(duì)HIV病毒的控制中不能單純起作用，而是受抗HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答的指揮。麻省普科醫(yī)院理根研究所和哈佛大學(xué)的研究人員發(fā)現(xiàn)HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答具有細(xì)胞殺傷活性，可破壞HIV感染的巨噬細(xì)胞，而CD₄⁺T淋巴細(xì)胞應(yīng)答受到GzmA表達(dá)的支配。HIV特異性CD₄⁺T淋巴細(xì)胞或CD₈⁺T淋巴細(xì)胞發(fā)揮其抗HIV生物活性與GzmA、GzmB有關(guān)。

NK細(xì)胞的主要功能就是通過(guò)多種機(jī)制溶解殺傷靶細(xì)胞。GzmB是NK細(xì)胞釋放的胞漿顆粒，可以與PEP配合溶解靶細(xì)胞或介導(dǎo)靶細(xì)胞凋亡。周方圓等用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了未經(jīng)HAART治療的CD₄⁺T細(xì)胞高和低兩組HIV感染者外周血NK細(xì)胞及各亞群IFN-γ、CD107a和GzmB的表達(dá)情況，結(jié)果CD₄⁺T細(xì)胞高組NK細(xì)胞及各亞群分泌IFN-γ和CD107a的水平較HIV抗體陰性對(duì)照組高，GzmB釋放百分比高于HIV抗體陰性對(duì)照組和CD₄⁺T細(xì)胞低組，其IFN-γ⁺NK細(xì)胞百分比與病毒載量呈顯著負(fù)相關(guān)。提示NK細(xì)胞功能增強(qiáng)可能是控制HIV感染疾病進(jìn)程的因素之一。

3中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)對(duì)顆粒酶的作用

臨床觀察表明中醫(yī)藥可調(diào)節(jié)艾滋病患者的免疫功能，改善患者的臨床癥狀，提高患者的生存質(zhì)量。對(duì)其免疫調(diào)節(jié)作用進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：中醫(yī)藥治療可明顯增強(qiáng)艾滋病患者HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答強(qiáng)度，這可能是中藥治療艾滋病調(diào)節(jié)免疫作用機(jī)制之一。但目前中醫(yī)藥增強(qiáng)HIV特異性T細(xì)胞免疫應(yīng)答是否與GzmA、GzmB相關(guān)國(guó)內(nèi)無(wú)報(bào)道。李曼等用由女貞子，早蓮草等組成的補(bǔ)腎方治療慢性乙型肝炎，患者經(jīng)補(bǔ)腎方治療6個(gè)月后，其CD₈⁺T細(xì)胞表達(dá)的GzmB降低，提示中醫(yī)藥可減少T細(xì)胞免疫效應(yīng)分子的表達(dá)。錢潔玉等探討了益艾康含藥血清對(duì)人自然殺傷細(xì)胞增殖及其效應(yīng)分子顆粒酶基因表達(dá)的影響，不同濃度的益艾康含藥血清均能夠促進(jìn)NK-92MI細(xì)胞增殖，增強(qiáng)NK-92MI細(xì)胞毒功能，其機(jī)制可能與上調(diào)顆粒酶基因的表達(dá)有關(guān)。李曉楠等觀察了中藥黃芩的主要活性成分漢黃芩素對(duì)人外周血單個(gè)核細(xì)胞CD3AK細(xì)胞增殖及對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721殺傷活性的影響，結(jié)果漢黃芩素在一定濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)CD3AK細(xì)胞增殖，增強(qiáng)其對(duì)肝癌細(xì)胞SMMC-7721的殺傷活性，抑制SMMC-7721細(xì)胞生長(zhǎng)、遷移和細(xì)胞的融合。漢黃芩素促進(jìn)CD3AK細(xì)胞增殖和功能改變可能與上調(diào)CD3AK細(xì)胞表面GzmB的表達(dá)有關(guān)。上述這些研究報(bào)道提示中醫(yī)藥的免疫調(diào)節(jié)作用與顆粒酶有關(guān)。

4小結(jié)

免疫系統(tǒng)是一個(gè)復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，任何環(huán)節(jié)都是相關(guān)聯(lián)的，在HIV感染的情況下，其復(fù)雜性更加難以想象，正是這種復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)型結(jié)構(gòu)，為中藥抗HIV/AIDS的研究提供了可能。闡明中醫(yī)藥對(duì)HIV感染者機(jī)體免疫調(diào)節(jié)作用是中醫(yī)藥治療艾滋病的臨床應(yīng)用所需，而目前安全、科學(xué)、規(guī)范地開展中醫(yī)藥治療艾滋病改善機(jī)體免疫作用機(jī)制方面研究仍存在較大的困難。研究中醫(yī)藥治療的艾滋病患者其外周血中顆粒酶變化情況，不失為一種探索中醫(yī)藥調(diào)節(jié)免疫在艾滋病治療中作用的方法，值得在臨床中進(jìn)一步探索研究。

（收稿日期：2016-11-15）