孔園園，邸晶美，羅尚星，劉寶京，范京惠，左玉柱

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001）

豬流行性腹瀉IgA抗體間接ELISA檢測方法的建立

孔園園，邸晶美，羅尚星，劉寶京，范京惠，左玉柱*

（河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001）

本實驗將構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒pET-32a（+）-S798轉(zhuǎn)入大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)，獲得表達(dá)量較高的包涵體蛋白。以純化的S重組蛋白作為包被抗原，初步建立了母豬乳汁中IgA抗體的間接ELISA檢測方法?？乖粷舛葹?.938 ug/mL，乳汁稀釋度為1:320，對反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，批內(nèi)批間重復(fù)性試驗變異系數(shù)均小于10%，與市售試劑盒相比特異性為90%、敏感性為94%、符合率為92%，本方法具有良好的特異性和敏感性，可以對豬乳汁中抗流行性腹瀉病毒的IgA抗體水平進(jìn)行快速檢測。

豬流行性腹瀉病毒；S蛋白；ELISA；IgA

豬流行性腹瀉（PED）是豬的一種急性、高度傳染性消化道疾病，由豬流行性腹瀉病毒（PEDV）引起。主要危害哺乳仔豬，臨床表現(xiàn)為嘔吐、水樣腹瀉和脫水死亡等癥狀[1]，使仔豬存活率顯著降低，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失[2]。哺乳仔豬通過乳汁免疫獲得母源抗體sIgA，sIgA能夠抑制PEDV在腸道上皮細(xì)胞進(jìn)行附著和繁殖，保護(hù)仔豬小腸上皮細(xì)胞，阻止PEDV侵入機體[3]。關(guān)于被動乳汁免疫，近期研究表明接受母源抗體的仔豬、保育豬的糞便中PEDV RNA載量明顯減少；母豬乳汁IgA抗體水平高，其所產(chǎn)仔豬糞便中PEDV RNA載量相對就低[4]。IgA抗體才是真正反應(yīng)黏膜免疫保護(hù)的重要指標(biāo)，因此需要建立一種合理、快速的方法對免疫母豬乳汁中IgA抗體水平進(jìn)行檢測。S蛋白是位于PEDV表面的纖突糖蛋白，含有主要抗原決定簇，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生中和抗體[5]。本實驗擴增S蛋白基因優(yōu)勢抗原表位區(qū)，將其轉(zhuǎn)入BL21（DE3）中誘導(dǎo)表達(dá)，以純化的S重組蛋白作為包被抗原，建立了針對乳汁中IgA抗體的間接ELISA檢測方法。

1 材料

1.1 抗原與乳汁

抗原：純化的S重組蛋白；PEDV陰陽性乳汁：由本實驗室保存。

1.2 抗體及其他實驗材料

辣根過氧化物酶(HRP)-山羊抗豬IgA：購自Abcam公司；96孔酶標(biāo)板、TMB單組份顯色液：購自Solarbio公司，PEDV-IgA ELISA試劑盒，購自上海東鴿生物技術(shù)有限公司。

2 方法

2.1 抗原、一抗最佳稀釋濃度的確定

純化好的蛋白用包被液梯度稀釋，包被濃度依次為3.750 μg/ mL、1.875 μg/mL、0.938 μg/ mL、0.469 μg/mL、0.236μg/mL、0.117 μg/mL，100 μL/孔，4 ℃過夜包被。用PBST洗滌3次，每次約3 min，用力拍干；加入含5 % 胎牛血清的PBST，150 μL/孔，37 ℃封閉1 h；棄去封閉液，拍干，然后用抗體稀釋液將陰、陽性乳汁按照1∶40、1∶80、1∶160、1∶320進(jìn)行倍比稀釋，100 μL/孔，37 ℃作用1 h；PBST洗滌3次，拍干，每孔加入 1∶50 000稀釋的HRP-山羊抗豬IgA100 μL/孔，37 ℃作用45 min；洗滌3次，用力拍干，加入TMB單組份顯色液，100 μL/孔，室溫避光作用10 min；加入濃H2SO450 μL/孔；酶標(biāo)儀測各反應(yīng)孔OD450nm值。選擇陽性乳汁OD450nm值近似于1.0，陽性乳汁OD450nm值/陰性乳汁OD450nm值（P/ N）比值最大時抗原、一抗稀釋度作為最佳工作條件的標(biāo)準(zhǔn)（各反應(yīng)條件共同標(biāo)準(zhǔn)）。

2.2 包被條件的確定

第1組：4 ℃包被過夜；第2組：37 ℃孵育2 h；第3組：37 ℃孵育2 h后4 ℃包被過夜；第4組：37 ℃孵育2 h后4 ℃ 36 h。

2.3 封閉液的確定分別選擇含5% 脫脂奶粉、5%新牛血清、1%BSA及5%胎牛血清的PBST作為封閉液進(jìn)行ELISA操作。

2.4 封閉時間的確定

選擇最適宜的封閉液于37 ℃分別封閉30 min、60 min、90 min、120 min。

2.5 一抗最佳作用時間的確定

加入最適濃度一抗于37 ℃條件下分別作用30 min、45 min、60 min、90 min。

2.6 酶標(biāo)二抗最佳作用濃度的確定

將HRP-山羊抗豬IgA分別進(jìn)行1﹕25 000、1﹕50 000、1﹕100 000 梯度稀釋，37 ℃作用45 min。

2.7 酶標(biāo)二抗作用時間的確定

加入適宜濃度于37 ℃條件下分別作用45 min、60 min、90 min、120 min。

2.8 底物顯色時間的確定

TMB室溫避光分別作用10 min、15 min、20 min、25 min。

表1 重組蛋白方陣試驗

表2 批內(nèi)重復(fù)試驗

表3 批間重復(fù)試驗

表4 與ELISA檢測試劑盒比較試驗

表5 建立的ELISA方法對乳汁樣品的檢測

2.9 陰陽性臨界值的確定

用建立的ELISA方法對30份陰性乳汁進(jìn)行檢測，計算出30份陰性乳汁OD450nm值的平均值(X)和標(biāo)準(zhǔn)方差(SD)。樣品OD450nm值≥X+3×SD為陽性；OD450nm值

2.10 重復(fù)性試驗

隨機選5份乳汁在同一塊酶標(biāo)板上進(jìn)行操作，每份重復(fù)5個孔；同樣的5份乳汁分別在3塊酶標(biāo)板進(jìn)行上操作，分別計算批內(nèi)、間變異系數(shù)。

2.11 與試劑盒比較

用建立的ELISA方法和市售ELISA試劑盒對62份臨床乳汁樣品分別進(jìn)行檢測，對兩種方法進(jìn)行比較。

2.12 臨床樣品的檢測

應(yīng)用建立的ELISA方法對臨床母豬乳汁樣品進(jìn)行檢測。

3 結(jié)果

3.1 間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件的優(yōu)化

抗原最佳包被濃度為0.938μg/ mL，一抗最佳稀釋倍數(shù)為1∶320（表1），包被條件為4 ℃過夜包被，封閉液為含5 % 胎牛血清的PBST，封閉時間為60 min，一抗反應(yīng)時間為60 min，酶標(biāo)二抗稀釋濃度為1∶50 000，作用時間為45 min，底物顯色時間為10 min。

3.2 陰陽性臨界值的確定

30份陰性乳汁平均OD450nm值（AV）為0.144，OD450nm值的標(biāo)準(zhǔn)方差（SD）為0.049。OD450nm均值（X）+ 3 × SD = 0.264，OD450nm均值（X）+ 2 × SD = 0.224。乳汁OD450nm值 ≥ 0.268為陽性；OD450nm值< 0.227為陰性，界于兩者之間判定為可疑。

3.3 重復(fù)性試驗

由表2、表3可知，批內(nèi)、批間重復(fù)試驗變異系數(shù)平均值分別為4.48%、4.74%，均不超過10%，說明建立的ELISA方法具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

3.4 與試劑盒比較結(jié)果

由表4可知，與市售試劑盒相比，建立的間接ELISA方法特異性為90%，敏感性為94%，符合率為92%。

3.5 臨床乳汁樣品檢測

由表5可知，所檢測68份乳汁樣品抗體陽性率為58.33%，對所產(chǎn)仔豬糞便進(jìn)行病原檢測，大多數(shù)為陰性，少部分陽性可能是由于母源抗體水平低等原因引起；抗體陰性率為50%，對發(fā)病仔豬糞便進(jìn)行病原檢測，大多數(shù)為陽性，個別為陰性，說明IgA抗體對仔豬腸道黏膜的保護(hù)性作用，IgA抗體水平可以反應(yīng)黏膜免疫情況。

4 討論

乳汁中IgA抗體數(shù)量多，且IgA不會被蛋白酶分解，可以維持自身在胃腸道的穩(wěn)定性[6]。母豬免疫豬流行性腹瀉疫苗尤其是口服疫苗，口服疫苗刺激母豬所產(chǎn)生的IgA數(shù)量要比肌肉注射途徑多。檢測乳汁IgA抗體可以對疫苗免疫效力進(jìn)行評價進(jìn)而分析對仔豬的免疫保護(hù)力。檢測母豬血清IgG抗體不能全面地反應(yīng)疫苗免疫效力與保護(hù)率，尤其口服疫苗時。應(yīng)用已建立的間接ELISA方法對母豬乳汁進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)母豬乳汁中IgA抗體水平高，仔豬發(fā)病率就會降低，反之發(fā)病率會增加，說明本方法能夠反應(yīng)乳汁中IgA抗體水平對仔豬的免疫保護(hù)情況，為PEDV IgA抗體水平監(jiān)測、疫苗免疫效力評估奠定基礎(chǔ)。

[1] 鄧芳. 豬流行性腹瀉預(yù)防及診斷研究進(jìn)展[J].畜禽業(yè),2015 (3) ﹕19-20.

[2] ?？〕?黃復(fù)深,胡佩佩.豬流行性腹瀉研究進(jìn)展[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2014,35(10)﹕107-110.

[3] SUN R Q,CAI R J,CHEN Y Q,et al. Outbreak of porcine epidemic diarrhea in suckling piglets,China[J]. Emerg Infect Dis,2012,18(1)﹕161.

[4] 華耀,王瑋,李郁,等.豬流行性腹瀉病毒S蛋白主要抗原表位區(qū)的原核表達(dá)及間接ELISA檢測方法的建立[J].微生物學(xué)通報,2016,43(2)﹕434-443.

[5] 索延樂,衛(wèi)春曉,李天麗,等.豬流行性腹瀉病毒研究進(jìn)展[J].當(dāng)代畜禽養(yǎng)殖業(yè),2015,2(3)﹕6.

[6] 孟瓊,孔寧,單同領(lǐng),等.豬流行性腹瀉病毒間接ELISA檢測方法的建立[J].中國動物傳染病學(xué)報,2016,24(4)﹕7-12.

2017-04-27）

河北省自然科學(xué)基金項目：C2015204121